金優(yōu)萍，徐麗慧，余道軍，張衛(wèi)英

(1.浙江中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術(shù)與信息工程學院，杭州310053；2.浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院檢驗科，杭州310006)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)是臨床常見的機會性致病菌，可定植于鼻咽部，?？梢鸱窝住⒅卸?、化膿性腦膜炎、敗血癥等疾病[1]。WHO在2014年報告中指出肺炎是全球第四大死因[2]，對老年和兒童群體都構(gòu)成嚴重疾病負擔[3-5]。

肺炎鏈球菌感染的病原學診斷有賴于臨床微生物實驗室分離鑒定肺炎鏈球菌。目前不同級別醫(yī)院實驗室鑒定肺炎鏈球菌所采用的方法不盡相同，部分三級醫(yī)院實驗室都配備了基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)儀，而基層實驗室還是以奧普托辛(Optochin)試驗為主并輔以膽汁溶解試驗，且不同鑒定方法的檢測性能研究報道較少。分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展為確認肺炎鏈球菌提供了更多可能。近年來有學者通過對鏈球菌屬細菌基因組高通量測序和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)SPN0001檢測肺炎鏈球菌的敏感性和特異性達到100%，可作為肺炎鏈球菌分子鑒定的特異性標記[6]。

因此，本研究以SPN0001檢測陽性為肺炎鏈球菌判定標準，對疑似肺炎鏈球菌的282株α溶血鏈球菌用上述3種鑒定方法進行檢測分析，并綜合評價其應(yīng)用價值，探討適合臨床微生物實驗室應(yīng)用的準確快速鑒定肺炎鏈球菌的方法。

1 材料與方法

1.1菌株來源與復(fù)蘇 浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院檢驗科2015—2019年臨床分離疑似肺炎鏈球菌的α溶血鏈球菌共計282株(20%甘油肉湯中-70 ℃保存)。菌株復(fù)蘇時轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖生物公司)，置于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)16～18 h。用肺炎鏈球菌ATCC 49619為質(zhì)控菌株。

1.2試劑與儀器 PCR試劑包括10×buffer、dNTPs混合液和Ex taq酶(TaKaRa公司)，SPN0001引物(上游5′-AATATCTGAAGATGCTCATTCTACAATT-3′，下游5′-ATAAGGTTTACCGTCAATAATACGCAG-3′)[6]由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成，100～2 000 bp DNA marker(上海生工生物公司)，Optochin藥敏紙片(含量5 μg，直徑6 mm，Oxoid公司)。凝膠成像儀、瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad公司)，5%CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀(德國Bruker Daltonics公司)。

1.3分子生物學鑒定 282株α溶血鏈球菌分別以煮沸法(100 ℃ 10 min)提取核酸，行PCR檢測。擴增體系共25 μL，包括無菌水18.4 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs混合液2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq酶0.1 μL，模板1 μL。擴增參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)； 72 ℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察電泳結(jié)果。隨機分別選取肺炎鏈球菌特異性靶標基因SPN0001檢測結(jié)果陽性者5株及檢測結(jié)果陰性11株菌株，用細菌16S rRNA為靶標基因的引物行PCR檢測[7]，PCR條件同SPN0001，PCR擴增產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后變性在3730測序分析儀(美國ABI公司)上進行Sanger雙脫氧終止測序法測序分析。用16S rRNA測序比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)結(jié)果對肺炎鏈球菌特異性標記物SPN0001檢測的準確性進行驗證。

1.4Optochin試驗 282株α溶血鏈球菌和質(zhì)控菌株復(fù)蘇后取單個菌落劃線法接種于血平板上，在35 ℃、5%CO2中培養(yǎng)18～24 h，用紙片法行Optochin試驗。Optochin藥敏紙片抑菌圈≥14 mm判定為敏感(Opts)，抑菌圈<14 mm或抑菌圈中出現(xiàn)菌落者判定為耐藥(Optr)[8]。

1.5膽汁溶解試驗 菌株復(fù)蘇后以平板法進行膽汁溶解試驗。取實驗室自配10%去氧膽酸鈉溶液5 μL，滴加于被測菌的菌落上，置35 ℃培養(yǎng)15～30 min后觀察結(jié)果。以“菌落消失”判為膽汁溶解試驗陽性，反之為陰性[8]。

1.6MALDI-TOF MS鑒定 菌株復(fù)蘇后用無菌吸頭挑取單個菌落，直接均勻涂布于MALDI靶板。同時用已知蛋白質(zhì)標準品設(shè)2孔作為校準。待干燥后，每孔加入基質(zhì)液1 μL，干燥后用MALDI-TOF MS儀進行檢測，分值2.3～3.0為高置信的種水平鑒定；分值2.0～<2.3為確定的屬水平鑒定，可能的種水平鑒定；分值1.7～<2.0為可能的屬水平鑒定；分值0.0～<1.7為不可靠的鑒定[9]。采用鑒定分值≥2.0且取分值最高者為鑒定結(jié)果。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行。采用行×列隊卡方檢驗比較Optochin試驗、膽汁溶解試驗及MALDI-TOF MS在鑒別α溶血鏈球菌的差異。采用配對卡方檢驗比較任意2種方法在鑒別α溶血鏈球菌中的差異。雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1分子生物學鑒定 以SPN0001為檢測靶標行PCR擴增獲得154 bp擴增產(chǎn)物，以16S rRNA為靶標行PCR獲得928 bp擴增產(chǎn)物，見圖1。282株α溶血鏈球菌中，234株SPN0001陽性菌株，48株SPN0001陰性菌株。以簡單隨機抽樣法抽取5株SPN0001陽性菌株，經(jīng)16S rRNA測序確認為肺炎鏈球菌(100%)；11株SPN0001陰性菌株經(jīng)16S rRNA測序指向α溶血的非肺炎鏈球菌(98%～100%)，包括假肺炎鏈球菌或緩癥鏈球菌 8株、口腔鏈球菌2株、血鏈球菌1株。

注：1，DNA marker(100～2 000 bp)；2，SPN0001陽性(154 bp)；3，16S rRNA PCR產(chǎn)物(928 bp)；4，SPN0001陰性。

2.2Optochin試驗 282株α溶血鏈球菌中213株為Opts，69株為Optr。234株肺炎鏈球菌中Opts和Optr分別為204株和30株，肺炎鏈球菌Optochim的耐藥率為12.82%；48株非肺炎鏈球菌中有9株Opts菌株。其檢測敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值見表1。

2.3膽汁溶解試驗 282株α溶血鏈球菌中235株表現(xiàn)為膽汁溶解試驗陽性，47株表現(xiàn)為膽汁溶解試驗陰性。其檢測敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值見表1、表2。

2.4MALDI-TOF MS鑒定 282株α溶血鏈球菌中247株被鑒定為肺炎鏈球菌，其余35株為非肺炎鏈球菌(緩癥鏈球菌 25株、口腔鏈球菌6株、血鏈球菌和副溶血鏈球菌各2株)。234株肺炎鏈球菌的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果均為肺炎鏈球菌。但還有13株非肺炎鏈球菌MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果也顯示為肺炎鏈球菌。其檢測敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值見表1。

2.5組合試驗鑒定肺炎鏈球菌 MALDI-TOF MS組合膽汁溶解試驗的鑒定性能同單獨膽汁溶解試驗，但優(yōu)于MALDI-TOF MS組合Optochin試驗的鑒定性能。Optochin試驗組合膽汁溶解試驗或MALDI-TOF MS的鑒定性能優(yōu)于單獨Optochin試驗。見表2。

2.6統(tǒng)計學分析 Optochin試驗、膽汁溶解試驗及MALDI-TOF MS 3種方法對282株α溶血鏈球菌鑒定結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=14.381，P<0.05)。通過配對卡方檢驗分析，Optochin試驗與膽汁溶解試驗對282株α溶血鏈球菌鑒定結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=104.476，P=0.000)；膽汁溶解試驗與MALDI-TOF MS對282株α溶血鏈球菌鑒定結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=199.798，P=0.000)；MALDI-TOF MS與Optochin試驗對282株α溶血鏈球菌鑒定結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=114.198，P=0.000)。

表1 Optochin試驗和膽汁溶解試驗及MALDI-TOF MS對282株α溶血鏈球菌的鑒定結(jié)果

表2 不同肺炎鏈球菌鑒定試驗組合對282株α溶血鏈球菌的鑒定結(jié)果

3 討論

肺炎鏈球菌是臨床重要的病原菌，由于其與假肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌等非肺炎鏈球菌在進化關(guān)系上緊密[10]，以及鏈球菌物種之間發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移[11]，使其許多表型和分子特征相似，導(dǎo)致臨床難以準確鑒定肺炎鏈球菌。臨床實驗室常用的鑒定肺炎鏈球菌鑒定試驗有Optochin試驗和膽汁溶解試驗[12]，近年來采用MALDI-TOF MS鑒定肺炎鏈球菌的實驗室越來越多。本研究選擇以分子生物學方法檢測SPN0001陽性為肺炎鏈球菌判定標準，對以上3種方法鑒定肺炎鏈球菌的檢測性能進行對比研究。

Optochin是一種奎寧衍生的抗菌藥物，通過結(jié)合H+-ATPase的F0部分的c亞單位，阻止其螺旋變構(gòu)，導(dǎo)致H+無法被泵出而形成胞內(nèi)pH降低以及電荷紊亂而導(dǎo)致細菌死亡[13]。Optochin試驗已成為鑒定肺炎鏈球菌的主要方法[12]。但隨著對α溶血鏈球菌的了解增加，發(fā)現(xiàn)部分假肺炎鏈球菌可表現(xiàn)為Opts[14]，因此不能單憑Optochin敏感性試驗確認肺炎鏈球菌，另一方面，已有報道肺炎鏈球菌H+-ATPase的F0部分的c亞單位和a亞單位的堿基突變導(dǎo)致對Optochin產(chǎn)生耐藥[15]，因此其敏感性和特異性均值得重新評價。本研究中有部分非肺炎鏈球菌表現(xiàn)為Optochin敏感，其是否為假肺炎鏈球菌有待進一步鑒定。而肺炎鏈球菌對Optochin耐藥的機制是否存在上述堿基突變需要進一步確證。

膽汁溶解試驗是以脫氧膽酸鹽溶解鏈球菌細胞壁，由于肺炎鏈球菌存在自溶素基因lytA，表現(xiàn)為該試驗陽性。膽汁溶解試驗作為傳統(tǒng)的鑒定肺炎鏈球菌方法，其優(yōu)點是準確度高[16]，本研究中其敏感性和特異性分別為100%和97.92%，與其他研究者對膽汁溶解試驗的評價較一致[17]。但在判斷結(jié)果方面，客觀性較MALDI-TOF MS和Optochin試驗差[18]，結(jié)果需要有經(jīng)驗的實驗室人員做出正確的判斷，因此，限制了膽汁溶解試驗在臨床實驗室的應(yīng)用。但膽汁溶解試驗仍作為鑒定肺炎鏈球菌的首選和推薦方法，實驗室應(yīng)每年定期進行相關(guān)人員培訓(xùn)以及判讀的人員比對工作，盡量減少人員主觀判讀的差異性。有研究者提出測定膽汁溶解試驗新方法，即通過測量鏈球菌懸浮液濁度下降程度判定試驗結(jié)果，可有效避免主觀判讀[17]。但該方法需要一定量的菌落，且不便于大樣本批量操作。也有文獻報道MALDI-TOF MS聯(lián)合膽汁溶解試驗的方法，將膽汁溶解結(jié)果以MALDI-TOF MS測定分值進行判斷，可有效消除膽汁溶解試驗在實際應(yīng)用中受到的主觀判斷結(jié)果的局限性[19]，又能方便大批量樣本的操作?？梢詫⒃摲椒ㄟM行進一步的驗證，在實際工作中推廣使用。

MALDI-TOF MS基于細菌豐富的肽和小蛋白質(zhì)經(jīng)MALDI-TOF MS轉(zhuǎn)換成獨特質(zhì)荷比信號所構(gòu)成的該細菌特征峰譜進行快速鑒定[20]。 有研究者總結(jié)了MALDI-TOF MS鑒定肺炎鏈球菌的敏感性為99%，但是緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌極容易被鑒定為肺炎鏈球菌[21]。同樣，本研究結(jié)果顯示MALDI-TOF MS鑒定肺炎鏈球菌的敏感性高達100%，且操作方便、結(jié)果判讀客觀，因此可以作為肺炎鏈球菌鑒定的篩選方法，但其特異性只有72.92%，因此鑒定為非肺炎鏈球菌的結(jié)果可靠，而對鑒別為肺炎鏈球菌的結(jié)果需要進一步用其他方法進行確認。

本研究結(jié)果表明MALDI-TOF MS鑒定快速且敏感性為100%，而膽汁溶解試驗的敏感性為100%、特異性為97.92%，Optochin試驗的檢測性能有限，因此在檢測策略上，MALDI-TOF MS組合膽汁溶解試驗鑒定肺炎鏈球菌優(yōu)于MALDI-TOF MS組合Optochin試驗。因此，如果實驗室能規(guī)范應(yīng)用膽汁溶解試驗，則可以在日常鑒定肺炎鏈球菌時，先用MALDI-TOF MS進行初篩，對于初篩陽性再行膽汁溶解試驗進行驗證，以提高肺炎鏈球菌鑒定效率和可靠性。如果實驗室沒有MALDI-TOF MS，且膽汁溶解試驗判定結(jié)果可靠的前提下，建議可行膽汁溶解試驗快速、準確、低成本地鑒定肺炎鏈球菌。對于有條件的實驗室，采用基于肺炎鏈球菌SPN0001為靶基因的分子生物學方法鑒定肺炎鏈球菌結(jié)果更為準確，因為肺炎鏈球菌SPN0001基因具有高度保守性和特異性的特點。而隨著分子生物學技術(shù)的進步，今后可能會有更優(yōu)的方法實現(xiàn)高通量、快速、準確鑒定肺炎鏈球菌。