吳玲，鄒鳳梅，王欣，魏勤，李軍春，劉剛，李可可，王曉寧，張蕾

(甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，甘肅省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，蘭州730000)

根據(jù)《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第2版，奈瑟菌屬(Neisseria)隸屬于β-變形菌綱，奈瑟菌目，奈瑟菌科。奈瑟菌屬的細(xì)菌對黏膜的親和力強(qiáng)，可從人體中分離出多個菌種，包括淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、灰色奈瑟菌(N.cinerea)、淺黃奈瑟菌(N.flavescens)、乳糖奈瑟菌(N.Lactamica)、黏膜奈瑟菌(N.mucosa)、多糖奈瑟菌(N.polysaccharea)、干燥奈瑟菌(N.sicca)和微黃奈瑟菌(N.subflava)等多個菌種。一些菌種主要來自于動物，如動物奈瑟菌(N.animalis)、動物口腔奈瑟菌(N.animaloris)、動物咬傷奈瑟菌(N.zoodegmatis，來自貓和犬的咽部)、反消化奈瑟菌(N.denitrificans，來自于豚鼠咽喉)、牙斑奈瑟菌(N.dentiae，來自飼養(yǎng)牛牙斑)、編織奈瑟菌(N.weaveri，來自犬的口腔菌群)和恒河猴奈瑟菌(Neisseriamacacae，來自恒河猴的口咽部)[1]。除腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌外，其余奈瑟菌引起人類感染的報道較少。恒河猴奈瑟菌1983年首次在恒河猴(獼猴)身上被發(fā)現(xiàn)[2]，而感染人的報道極為有限?，F(xiàn)將從關(guān)節(jié)竇道穿刺液中分離引起膝關(guān)節(jié)感染的恒河猴奈瑟菌報道如下。

1 病歷摘要

患者女性，76歲，患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和2型糖尿病，2020年8月行“右膝關(guān)節(jié)置換術(shù)”。術(shù)后約8個月，即2021年4月，右膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，活動受限，右膝髕骨處可見一長約20 cm的手術(shù)瘢痕組織，髕下可見一大小約0.3 cm×0.3 cm未愈竇道，持續(xù)有淡黃色液體滲出，局部皮溫增高，外院診斷為“右膝關(guān)節(jié)假體植入感染”，取患者竇道內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)腔穿刺液做細(xì)菌培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞計數(shù)：6.66×109/L，中性粒細(xì)胞百分率：73.3%，紅細(xì)胞沉降率：80 mm/h，C反應(yīng)蛋白：98.65 mg/L，白介素-6:64.76 pg/mL，降鈣素原：0.18 ng/mL，類風(fēng)濕因子：138 IU/mL，抗角蛋白抗體：陽性，抗環(huán)瓜氨酸肽抗體：>500 U/mL,空腹血糖：6.33 mmol/L。臨床診斷：膝關(guān)節(jié)假體植入感染，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和2型糖尿病。臨床治療中每日給予患者氯化鈉注射液(100 mL)+頭孢曲松鈉(2 g, ivgtt, q12h)治療2周，效果顯著，病情穩(wěn)定后出院。

2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

2.1細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 按照《臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版，用接種環(huán)挑取黃色、微渾濁的竇道穿刺液，分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上，放入35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；同時竇道穿刺液直接涂片，革蘭染色。涂片染色結(jié)果：白細(xì)胞較多，在白細(xì)胞內(nèi)可見革蘭陰性雙球菌。培養(yǎng)24 h生長情況：哥倫比亞血瓊脂平板上菌落有大小2種，小的約1 mm、大的約2 mm，光滑、濕潤、灰白色、無溶血；巧克力瓊脂平板上菌落同樣有大小2種，菌落大小同哥倫比亞血瓊脂平板，光滑、濕潤、灰白色。麥康凱瓊脂平板未生長；沙氏瓊脂平板未生長。培養(yǎng)48 h生長情況：哥倫比亞血瓊脂平板與24 h生長情況一致，略有區(qū)別的是小菌落約2 mm、大的約3 mm、出現(xiàn)淡淡的黃色素，見圖1。巧克力瓊脂平板除菌落約增大至2～4 mm外，生長情況同24 h。麥康凱瓊脂平板不生長；沙氏瓊脂平板未生長。純菌涂片革蘭染色：革蘭陰性雙球菌。哥倫比亞瓊脂平板和巧克力瓊脂平板購自鄭州安圖生物公司，麥康凱瓊脂平板和沙氏瓊脂平板為實(shí)驗(yàn)室自制。

圖1 細(xì)菌在哥倫比亞血瓊脂平板5% CO2環(huán)境溫育48 h生長情況

2.2細(xì)菌鑒定

2.2.1常規(guī)鑒定 氧化酶陽性，觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)陽性，以金黃色葡萄球菌ATCC 29213作陽性對照，以金黃色葡萄球菌 ATCC 25923為陰性對照(頭孢硝噻酚紙片購自O(shè)xoid公司)；用生物梅里埃奈瑟菌和嗜血桿菌鑒定盒(比色法API NH 10400)進(jìn)行鑒定，鑒定碼為5333，被鑒定為副流感嗜血桿菌，其鑒定%與T值均不顯示，表明用此方法不能準(zhǔn)確鑒定。

2.2.2質(zhì)譜技術(shù)鑒定 用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)進(jìn)行鑒定，用BRUKER microflex鑒定，結(jié)果為Neisseriamacacae(猴奈瑟菌)，分值2.179；用Autof ms1000鑒定，結(jié)果為Neisseriamacacae(恒河猴奈瑟菌)，分值9.6。2種質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果一致。

2.2.3靶向DNA測序鑒定 用16S rDNA基因測序鑒定方法：用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP320(Tiangen公司)提取分離菌株的基因組DNA作為PCR模板，采用27F(5′-AG

AGTTTGATCATGGCTC-3′)和1492R(5′-TAGGGTTACCTTGT

TACGACTT-3′)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×EasyTaq PCR SuperMix 15 μL，模板DNA 2.0 μL，10 μmol/L 27F引物1.0 μL，10 μmol/L 1492R引物1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至30 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，送北京睿博興公司進(jìn)行16S rDNA測序，采用Illumina公司HiSeq 2500型測序儀，將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST對比鑒定。結(jié)果顯示，分離株與恒河猴奈瑟菌、黏膜奈瑟菌的相似度均為99.654%：Neisseriamacacae(NR117701.1)99.645%，Neisseriamucosa(NR117696.1)99.645%。

3 藥敏試驗(yàn)

因恒河猴奈瑟菌沒有可參考的藥敏試驗(yàn)判斷折點(diǎn)，故參考CLSI M100第32版中表2I腦膜炎奈瑟菌抑菌圈直徑和MIC折點(diǎn)[3]。挑取純培養(yǎng)物配制為0.5 mol/L菌懸液，用棉簽蘸取均勻涂布于苛氧菌藥敏瓊脂平板(STM)上，在室溫放置10 min，將待測抗菌藥物的E-test條貼在平板上，然后放入35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱溫育24 h后觀察MIC值。結(jié)果顯示，青霉素：4.0 μg/mL(R)、頭孢曲松：0.048 μg/mL(S)、美羅培南：0.048 μg/mL(S)、米諾環(huán)素：1.0 μg/mL(S)、環(huán)丙沙星：0.25 μg/mL(R)、左氧氟沙星：1.0 μg/mL(R)、復(fù)方磺胺甲噁唑：1.0 μg/mL(R)、氯霉素：4.0 μg/mL(I)、利福平：4.0 μg/mL(R)。其中，藥敏試驗(yàn)平板和E-test條均來自于鄭州安圖生物公司。試驗(yàn)中以ATCC 49619肺炎鏈球菌和ATCC 25922大腸埃希菌作為質(zhì)控菌株，所測E-test條MIC值均在質(zhì)控范圍內(nèi)。

4 結(jié)果與討論

直接涂片革蘭染色中觀察到，白細(xì)胞數(shù)量較多、在白細(xì)胞內(nèi)可見革蘭陰性雙球菌，以此判斷該菌為穿刺液中作為病原菌的依據(jù)。用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的常規(guī)方法，如生物梅里埃API NH不能準(zhǔn)確鑒定，因API系統(tǒng)中沒有相關(guān)的數(shù)據(jù)。用MALDI-TOF MS技術(shù)可準(zhǔn)確鑒定。經(jīng)靶向DNA測序鑒定，與Neisseriamacacae(NR117701.1)序列相似度為99.645%，與Neisseriamucosa(NR117696.1)為99.645%。鑒定結(jié)果與黏膜奈瑟菌無法區(qū)別，這與臨床微生物學(xué)手冊中所描述的干燥奈瑟菌和恒河猴奈瑟菌被認(rèn)為是黏膜奈瑟菌的變種[1]可能有關(guān)；恒河猴奈瑟菌和黏膜奈瑟菌對碳水化合物利用試驗(yàn)均能利用葡萄糖、麥芽糖、果糖和蔗糖；但是黏膜奈瑟菌菌落較大、黏著、不產(chǎn)生色素，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性；而恒河猴奈瑟菌的菌落與黏膜奈瑟菌菌落比較相對較小，光滑、濕潤、且有淡淡光亮的黃色素、隨著培養(yǎng)時間的延長其色素更加明顯、硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性。利用這些表型特征和生化試驗(yàn)將兩者區(qū)別開來，以確定該菌為恒河猴奈瑟菌。

抗菌藥物敏感試驗(yàn)應(yīng)該選擇MHA平板，因當(dāng)時實(shí)驗(yàn)室無MHA平板，考慮STM與MHA的基礎(chǔ)營養(yǎng)成分基本一致，故選擇用STM。根據(jù)藥敏結(jié)果，推薦使用頭孢曲松，該菌β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)陽性，而頭孢曲松對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株的腦膜炎奈瑟菌具有高度抗菌活性[4]，而恒河猴奈瑟菌屬于奈瑟菌屬，推測對其抗菌活性也強(qiáng)，另外消除半衰期長，具有長效作用。臨床治療中每日給予患者氯化鈉注射液+頭孢曲松鈉治療2周，效果顯著，病情穩(wěn)定后出院。

恒河猴奈瑟菌來自恒河猴的口咽部，這種動物源性奈瑟菌在咬傷人后可導(dǎo)致人傷口感染，該患者未與猴接觸過。據(jù)文獻(xiàn)報道，從人類標(biāo)本中共分離出恒河猴奈瑟菌10例，其中血培養(yǎng)4例、腹膜透析液1例、口腔1例、咽試子1例、呼吸道3例[5]。而該菌引起膝關(guān)節(jié)的感染未見報道，而對引起以上感染的途徑及機(jī)制尚不清楚。恒河猴奈瑟菌是否也是人類上呼吸道的正常菌群，還或許是黏膜奈瑟菌的變種的這些疑惑，還需在今后的工作中求證。

MALDI-TOF MS能鑒定出用常規(guī)方法不能準(zhǔn)確鑒定的少見菌和罕見菌。本例如果沒有直接涂片作為判斷病原菌的依據(jù)，有可能將恒河猴奈瑟菌當(dāng)作污染菌。隨著鑒定手段的提高，通過涂片來溯源顯得尤為重要，只有判斷準(zhǔn)確，再結(jié)合MALDI-TOF MS鑒定，才能在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)這些少見菌和罕見菌引起的感染。