范國紅，楊鴻林，陸趙陽，沈昊，曹季軍，凌偉，劉松良，李勇

(1.蘇州市第九人民醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州 215200；2.太倉市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇太倉 215400)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是原發(fā)于結(jié)腸黏膜上皮的惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處[1]。盡管近年來手術(shù)方式及藥物輔助治療方法不斷改進，并且通過腸鏡檢查以及血清學(xué)篩查指標(biāo)，可實現(xiàn)一定程度的早期診斷，但是效果并不顯著，敏感性和特異性不高。

細胞角蛋白18(cytokeratin 18, CK18)是Ⅰ型細胞角蛋白的重要成員，其表達與肝癌、病毒性肝炎等肝病具有顯著相關(guān)性，并且在細胞凋亡過程中具有重要的調(diào)控作用[2-3]。CK18包括多個片段，M65是其中之一，可作為反映細胞壞死后釋放進入血液的CK18的總量指標(biāo)，CK18及其片段產(chǎn)物的表達在CRC診斷以及藥物動力學(xué)分析中具有重要的臨床價值[4]。

表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白7(epidermal growth factor-like protein 7, EGFL7)屬于EGFL家族成員，可以激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、核因子κB、促分裂活化的蛋白激酶、蛋白激酶B和Notch等重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5]。EGFL7在人類腫瘤組織中高表達，包括腎癌、惡性膠質(zhì)瘤、肝細胞癌、乳腺癌、肺癌和CRC等，并與患者臨床病理特征密切相關(guān)[6]。值得注意的是，肝癌、肺癌及卵巢癌等惡性腫瘤患者血清中的EGFL7水平明顯升高，尤其以肝癌患者血清EGFL7水平升高最明顯，較正常人群升高近4倍[7]，但其在CRC患者血清中的表達尚無報道。本研究旨在觀察M65和EGFL7在CRC血清中的表達，并探討其在CRC發(fā)生發(fā)展中的診斷價值及預(yù)后判斷價值。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2019年3月至2021年7月經(jīng)蘇州市第九人民醫(yī)院病理科、太倉市第一人民醫(yī)院病理科初診確診的CRC患者46例，年齡38～84歲，男28例，女18例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理確診為CRC；(2)術(shù)前未進行過任何治療，無其他腫瘤史，且臨床病理及隨訪信息均齊全；(3)排除其他系統(tǒng)疾病。根據(jù)1997年國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期系統(tǒng)對CRC進行病理分期。以同期43例經(jīng)腸鏡檢查獲得病變組織的非腫瘤腸道疾病(包括腸道息肉、腸炎等)確診患者(年齡30～84歲，男27名，女16名)的血清標(biāo)本作為疾病對照。本研究經(jīng)太倉市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：2021-KY-124)，研究對象均知情同意。

1.2血清標(biāo)本收集 采集所有研究對象清晨空腹靜脈血2 mL，置于含促凝劑和分離膠的真空采集管中，室溫下3 000×g離心15 min后吸取血清，置于-80 ℃冰箱凍存待測。

1.3ELISA檢測 使用中國和銳公司試劑盒，采用ELISA方法檢測M65的表達水平，按試劑盒說明書進行操作。使用Abcam公司試劑盒，采用ELISA方法檢測EGFL7的表達水平，按試劑盒說明書進行操作。

1.4Ki67免疫組化檢測 將包埋好的CRC組織切成4 μm切片，70 ℃烘烤1 h后經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫水，置于檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中進行抗原修復(fù)，然后將切片置于3% H2O2溶液中去除內(nèi)源性辣根過氧化物酶(HRP)，BSA封閉后加抗Ki67一抗(北京中杉金橋公司)37 ℃溫育1 h，清洗后用HRP標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋公司)，室溫溫育30 min，最后DAB顯色后蘇木素襯染，中性樹膠封片后顯微鏡觀察。Ki67染色結(jié)果經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)生讀片后判斷陽性指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1CRC患者及對照患者血清M65、EGFL7表達水平比較 CRC患者血清的M65表達水平為215.7(152.5，287.8)U/L，而對照組為125.7(111.0，142.1)U/L，Mann-WhitneyU檢驗顯示兩組間血清M65濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=290.5，P<0.000 1)。CRC患者血清EGFL7的濃度為1.814(1.209，2.537)pg/mL，而對照組為1.193(1.025，1.464)pg/mL，Mann-WhitneyU檢驗分析顯示兩組間血清EGFL7濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=599，P=0.001 2)。

2.2血清中M65、EGFL7聯(lián)合檢測在CRC中的診斷價值分析 通過ROC曲線分析，得到當(dāng)M65作為區(qū)分CRC患者和對照患者的診斷指標(biāo)時，曲線下面積(area under curve，AUC)為0.853 1(95%CI：0.771 4～0.934 9)，cut off值為146.8 U/L時，敏感性為78.26%，特異性為83.72%。EGFL7作為區(qū)分CRC患者和對照患者的診斷指標(biāo)時，AUC為0.697 2(95%CI：0.585 8～0.808 5)，cut off值為1.480 pg/mL時，敏感性為67.39%，特異性為76.74%。二者聯(lián)合診斷時AUC為0.909 0(95%CI：0.845 6～0.972 4)，敏感性和特異性分別為86.96%、81.84%。見圖1。

圖1 血清中M65、EGFL7聯(lián)合檢測在CRC中的診斷價值

2.3不同臨床病理參數(shù)CRC患者間血清M65、EGFL7表達水平比較 將M65的表達水平與CRC患者的各臨床病理參數(shù)通過Mann-WhitneyU檢驗進行不同分類的比較分析，結(jié)果顯示，瘤體大小≥5 cm患者M65濃度高于瘤體大小<5 cm患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038)；而不同腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的患者間EGFL7水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009、0.005、0.021)。見表1。

表1 CRC患者各病理特征分類下的M65、EGFL7檢測結(jié)果

2.4CRC患者血清M65、EGFL7表達水平與腫瘤細胞增殖能力的相關(guān)性 46例CRC患者的腫瘤組織Ki67表達百分比為10%的1例，20%的2例，30%的5例，40%的2例，50%的2例，60%的7例，70%的5例，80%的12例，90%的10例。見圖2。將M65的表達水平與腫瘤細胞的增殖能力進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.277 7，P=0.061 6)，EGFL7與Ki67的表達相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.185 2，P=0.218 7)。

圖2 腸癌組織Ki67不同程度表達(100×)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，M65在疾病對照組中表達穩(wěn)定，而在CRC組的表達明顯增高，考慮CRC組與疾病對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能提示CRC進展過程中出現(xiàn)的大量細胞死亡導(dǎo)致細胞角蛋白釋放至血液，同時在腫瘤進展過程中還有一些其他因素導(dǎo)致角蛋白片段釋放增加、降解減少，這些因素共同導(dǎo)致M65血清濃度的升高。這些可能是M65作為CRC診斷潛在標(biāo)志物的分子基礎(chǔ)。M65與EGFL7的聯(lián)合檢測AUC值可達0.909 0，這與陳文萍在2020年的一項多指標(biāo)聯(lián)合檢測在大腸癌中的診斷價值研究結(jié)果類似[8]，同時這兩個標(biāo)志聯(lián)合檢測的敏感性和特異性也與朱珊玲等的一項4個腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合研究結(jié)果接近[9]，這些結(jié)果都提示M65與EGFL7的聯(lián)合檢測具有很強的潛在CRC診斷價值。

M65表達與腫瘤細胞增殖的相關(guān)性雖然未見統(tǒng)計學(xué)意義，但r值為0.277 7，P值為0.061 6，提示M65的產(chǎn)生與腫瘤細胞的快速增殖之間可能有一定的正相關(guān)性。由于M65是細胞壞死之后釋放的，而細胞的快速增殖進而缺氧是導(dǎo)致細胞壞死的主要原因，因此M65的臨床價值更多是建立在其與腫瘤細胞增殖、壞死相關(guān)，與臨床相關(guān)的分析顯示M65濃度與腫瘤大小顯著相關(guān)(P=0.038)，與其他因素相關(guān)性不顯，也進一步證實了這一點。進一步增加樣本量可能會得到M65與腫瘤細胞增殖之間更為準(zhǔn)確的關(guān)系。而EGFL7作為一種血管內(nèi)皮細胞源性分泌性因子，主要作用在于調(diào)節(jié)各類細胞(包括內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞等)的黏附、遷徙[10]。本研究結(jié)果顯示，EGFL7與腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都具有顯著相關(guān)性，而與腫瘤細胞的增殖無顯著相關(guān)性，提示EGFL7與M65不同，不是通過腫瘤細胞增殖、壞死相關(guān)的途徑，而可能是通過調(diào)控腫瘤細胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移等途徑發(fā)揮促腫瘤功能。因此，M65可作為CRC疾病的篩查標(biāo)志以及腫瘤增殖壞死的標(biāo)志，而EGFL7的臨床價值更偏向作為CRC腫瘤轉(zhuǎn)移與不良預(yù)后的預(yù)測標(biāo)志物。

綜上所述，血清中M65、EGFL7的濃度在CRC患者中顯著升高，二者聯(lián)合檢測可有效診斷CRC。而血清EGFL7水平與患者的臨床病理特征的相關(guān)性更強，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否具有相關(guān)性，未來或可用于患者的預(yù)后判斷及轉(zhuǎn)移評估。本課題的研究病例數(shù)量較少，相關(guān)推論還需要擴大樣本量以及追蹤患者的長期隨訪數(shù)據(jù)，以進行深入研究。