張李敏，郭琦，王向斌，黃茜，李學(xué)軍，周傳江，趙道全，張建新，劉慧芬*

（1河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453007；2河南省黃河流域伊洛河水生生物野外科學(xué)觀測研究站，河南鄭州 450000）

0 引言

1 材料與方法

1.1 試驗材料

表1 引物序列信息Table 1 Primers sequence

1.2 花?Amh基因cDNA克隆及序列分析

1.3 花?Amh基因原核表達及多克隆抗體制備

1.4 重組蛋白AMH免疫熒光定位

1.5 雌二醇處理對花?Amh基因表達的影響

雌激素處理參考Jiang等（2017）的方法，按照0（對照）、100和200 μg/g梯度劑量稱取雌二醇，溶于95%乙醇中，然后均勻噴灑在飼料上。將處理后的飼料置于40℃烘箱中烘干，對照組飼料用95%乙醇噴灑進行同樣處理。選取3月齡幼魚，挑選480尾規(guī)格一致的健康個體隨機分成3組，按照設(shè)計的試驗組分別于每天8：00、12：00和17：00投喂飼料，60 d后分離不同劑量的處理組和對照組卵巢樣品，置于-80℃保存，用于Amh基因表達分析。

1.6 RNA提取及實時熒光定量PCR檢測

采用TRIzol提取卵巢組織RNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用NanoDrop 2000檢測RNA濃度和純度。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將質(zhì)量合格的RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以GAPDH和β-actin為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量PCR檢測Amh基因的表達情況，反應(yīng)體系10.0 μL：TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ5.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，無菌水2.0 μL。擴增程序：95℃30 s，95℃5 s，60℃20 s，進行40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，以單因素方差分析（ANOVA）和Duncan's多重比較分別檢驗不同組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Amh基因序列分析結(jié)果

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過PCR擴增獲得Amh基因，其cDNA序列全長1849 bp，ORF為1671 bp，編碼556個氨基酸殘基，5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）28 bp，3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）150 bp。ORF編碼的AMH蛋白分子式為C2688H4306N768O845S23，理論分子量為61.60 kD，理論等電點（pI）為5.81，脂肪系數(shù)為85.38，親水性系數(shù)為-0.385，說明該蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白。生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果顯示，AMH蛋白具有典型的TGF-β和AMH-N端結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白，第1~21位氨基酸為信號肽，且在第21~22個氨基酸間存在信號肽剪切位點，第455~461個氨基酸（RTQRAAR）為纖溶酶蛋白酶裂解位點（圖1）；AMH蛋白定位于細胞膜的概率較高。運用MEGA 7.0基于不同物種AMH基因同源比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同物種AMH基因分為兩支，哺乳動物與硬骨魚各聚為一支，其中，花與同屬于鯉科魚類的斑馬魚、黃河鯉、銀鯽、四川裂腹魚等聚為一小支，與鲆科和合鰓魚科等親緣關(guān)系較遠，與花的生物學(xué)地位相一致（圖2）。

圖1 花?Amh基因cDNA序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of H.maculatus Amh gene

圖2 基于不同物種AMH蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of AMH protein amino acid sequence in different species

2.2 AMH重組蛋白的原核表達及純化結(jié)果

將獲得的Amh基因序列與pET-32a載體連接構(gòu)建重組表達載體pET32a-Amh，并轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞。隨后采用1.0 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在28.5 kD左右出現(xiàn)目的條帶，而陰性對照和空白對照在同一區(qū)域未出現(xiàn)特異條帶，表明重組表達載體pET32a-Amh構(gòu)建成功。誘導(dǎo)后菌體經(jīng)超聲破碎、離心、SDS-PAGE電泳分析表明重組蛋白主要存在于上清液中。利用親和純化的方法對AMH重組蛋白進行純化，結(jié)果顯示，50 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫時開始檢測到目的蛋白；200和500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫時，檢測到大量的目的蛋白，但200 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫時，獲得高濃度和高純度的目的蛋白（圖3）。

圖3 AMH重組蛋白的表達純化結(jié)果Fig.3 Expression and purification ofAMH recombinant protein

2.3 多克隆抗體效價檢測及特異性分析結(jié)果

小鼠經(jīng)過4次免疫后進行采血，收集血清。使用ELISA對獲得的AMH多克隆抗體進行效價測定，結(jié)果顯示多克隆抗體的效價為2.4×106（表2）。Western blotting檢測結(jié)果顯示在28.5 kD附近可見清晰的條帶，其大小與AMH原核表達結(jié)果相一致，表明制備的AMH多克隆抗體可有效識別AMH抗原（圖4）。

圖4 Western blotting檢測AMH重組蛋白的特異性Fig.4 The specificity of AMH recombinant protein was detected by Western blotting

表2 AMH多克隆抗體效價檢測結(jié)果Table 2 AMH polyclonal antibody potency assay

2.4 花?AMH蛋白細胞定位

圖5 AMH在花?卵巢中的定位結(jié)果（標尺=20 μm）Fig.5 Localization of AMH in H.maculatus ovary（scale bar=20 μm）

2.5 雌二醇對花?卵巢組織學(xué)影響

組織學(xué)分析結(jié)果（圖6）顯示，雌二醇處理20 d后，對照組卵母細胞核明顯，嗜堿性強；低濃度處理組（100 μg/g）中的初級卵母細胞數(shù)量增多，可觀察到細胞核及核仁；高濃度處理組（200 μg/g）中的卵母細胞體積明顯大于其他試驗組，核質(zhì)比降低。雌二醇處理40 d后，對照組的卵母細胞進入小生長期，細胞體積增大，核仁數(shù)量增多；低濃度處理組的卵母細胞呈圓形，胞核體積增大，核仁大小不一；高濃度處理組的卵母細胞體積不斷增加，但仍可觀察到卵原細胞。根據(jù)時間的推移，飼喂60 d后，卵母細胞發(fā)育至Ⅱ期中期，核質(zhì)比上升，胞核嗜堿性減弱，低濃度處理組的卵母細胞增長速度加快，已完成卵原細胞增殖期，且卵膜內(nèi)緣皮質(zhì)層不斷擴散，形成強嗜堿性絲狀物質(zhì)；高濃度處理組中的卵母細胞較低濃度處理組發(fā)育緩慢，仍含有一期的卵原細胞（圖6）。

圖6 雌二酵處理下花?卵巢組織學(xué)觀察Fig.6 Histology observation of H.maculatus ovary after estradiol treatment

2.6 雌二醇處理對花?卵巢Amh基因表達的影響

實時熒光定量PCR檢測雌二醇處理對花?卵巢Amh基因表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Amh基因在低濃度處理組（100 μg/g）和高濃度處理組（200 μg/g）均呈下降趨勢（圖7），其中，低濃度處理組Amh基因表達相對表達量最低，抑制作用顯著（P＜0.05），說明雌激素在卵巢發(fā)育中對Amh基因表達具有抑制作用。

圖7 雌二醇對花?卵巢Amh基因表達的影響Fig.7 Effects of estradiol on the expression of Amh gene in H.maculatus ovary

3 討論

AMH是動物性腺發(fā)育過程中的一個關(guān)鍵因子。在哺乳動物中，較多的研究已證實，Amh基因在卵巢中發(fā)揮作用，但目前Amh基因在魚類卵巢發(fā)育過程中的基礎(chǔ)生物學(xué)研究相對較少。本研究克隆得到花Amh基因cDNA全長序列1849 bp，共編碼556個氨基酸殘基，該蛋白含有TGF-β結(jié)構(gòu)域，屬于典型的TGF-β家族成員。Pfennig等（2015）比較了不同物種Amh基因序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同物種的Amh基因編碼蛋白普遍含有1個N端序列以及緊鄰TGF-β結(jié)構(gòu)域上游的纖溶酶蛋白酶裂解位點（R-X-X-R），該位點為蛋白酶的識別位點，是AMH配體加工所必需的。除日本比目魚（Paralichthys olivaceus）（Yoshinaga et al.，2004）外，大多數(shù)魚類中Amh基因編碼的蛋白酶識別位點為雙基序（R-X-X-R-X-X-R）?；ˋMH蛋白中纖溶酶蛋白酶裂解位點（RTQRAAR）也為雙基序，說明其配體加工過程與哺乳動物類似。氨基酸同源比對分析結(jié)果顯示，不同脊椎動物AMH蛋白的氨基酸序列整體相似性較低，且系統(tǒng)發(fā)育進化結(jié)果顯示，花與斑馬魚、鯉魚等鯉科魚類單獨聚為一支，這與花的生物學(xué)分類地位相符合，證明克隆得到的序列為花Amh基因。

從哺乳動物的研究發(fā)現(xiàn)，雄性睪丸支持細胞在妊娠第7周就開始分泌AMH，雌性動物在性別分化時不產(chǎn)生AMH，妊娠36周后才能檢測到AMH（Zeng et al.，2015）。研究發(fā)現(xiàn)，Amh基因在原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡中高表達，優(yōu)勢卵泡選擇后表達量逐漸下降，在閉鎖卵泡中幾乎檢測不到Amh基因表達（Renato，2018）。魚類Amh基因的研究主要集中在雄性性別分化，常被用作雄性魚類的性別標記，但在雌性性腺中也表達。研究發(fā)現(xiàn)，在成熟斑馬魚中檢測到Amh基因在卵母細胞和濾泡層中高表達（Hofsten et al.，2005）。大西洋鱈的Amh基因在卵巢發(fā)育早期表達，而在后期信號消失（Johnsen et al.，2013）。黑鯛的Amh基因在卵巢發(fā)育早期不表達，在卵黃蛋白原合成期表達量升高（Wu et al.，2010）。本研究克隆獲得花Amh基因的ORF，并成功構(gòu)建到原核表達載體pET-32a上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得重組蛋白分子量約為28.5 kD，以可溶性狀態(tài)表達，純化后免疫小鼠，獲得多克隆抗體，其能識別重組蛋白。此外，本研究應(yīng)用多克隆抗體進行免疫熒光試驗，結(jié)果顯示AMH蛋白主要表達于顆粒細胞，與在羅非魚（Ijiri et al.，2008）、斑馬魚（Kaviani et al.，2013）中發(fā)現(xiàn)的細胞定位結(jié)果類似，推測Amh對花卵細胞發(fā)育具有重要作用。

雌激素在調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生中行使重要功能。劉濤（2012）研究發(fā)現(xiàn)，外源17-β雌二醇處理促進中華鱘卵母細胞生長和發(fā)育。呂德亮等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，注射雌二醇可顯著提高海膽的性腺指數(shù)，促進其性腺發(fā)育。類似的現(xiàn)象在中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）（沈蓓杰等，2010）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）（Liu et al.，2018）中 也有報道。在本研究中，以100 μg/g雌二醇長期喂養(yǎng)花，同樣發(fā)現(xiàn)其卵母細胞發(fā)育進程高于對照組（0 μg/g）。外源性激素處理除了對動物的性腺發(fā)育有影響，對調(diào)控通路中的基因表達也有一定的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，在雌性花中雌二醇抑制了Amh基因表達。吳燕鐸等（2022）在探究性類固醇激素對斑鱧雌性相關(guān)基因Foxl2表達的影響中發(fā)現(xiàn)，外源激素濃度過高會抑制內(nèi)源性激素的分泌，從而抑制雌性相關(guān)基因的表達。由此推測長期喂養(yǎng)雌二醇會造成雌性花體內(nèi)雌激素過高，通過負反饋機制抑制Amh基因表達。因此，深入研究花雌激素與Amh基因表達之間存在的關(guān)聯(lián)機制，將有助于理解魚類卵巢發(fā)育的分子機理。

4 結(jié)論

Amh基因含有TGF-β家族典型的結(jié)構(gòu)域，在卵巢顆粒細胞表達，且響應(yīng)雌激素的調(diào)控，可能在花卵巢發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。