李泓雨，張林，聶圣松，楊過(guò)，杭俊楠，黃瑋婷，方中明，查仁明

（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativaL）是世界上最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量直接影響糧食安全。目前生產(chǎn)上主要采用施用氮肥的方法提高水稻產(chǎn)量，包括硝酸銨等無(wú)機(jī)氮及氨基酸等有機(jī)氮，其中氨基酸是生物體內(nèi)氮素運(yùn)輸?shù)闹饕问剑╔u et al.，2012；徐智軍等）。一方面，氨基酸參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育中重要化合物前體的合成，如激素等（Tegeder，2012；Pratelli and Pilot，2014；Jin et al.，2019）；另一方面，直接或間接參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的氮代謝過(guò)程，包括氨基酸在植物體內(nèi)的同化、分配和利用（Liu and Bush，2006；Tegeder，2014）。植物體內(nèi)氨基酸由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Amino acid transporters，AATs）負(fù)責(zé)運(yùn)輸，故AATs在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用（彭波等，2016）。因此，研究水稻AATs編碼基因的時(shí)空表達(dá)特性及其功能，對(duì)深入了解水稻對(duì)有機(jī)氮源的響應(yīng)機(jī)制及氨基酸的吸收與利用提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】AATs介導(dǎo)了氨基酸在植物體內(nèi)的運(yùn)輸，AATs被分為兩個(gè)超家族：氨基酸、多胺和膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)（Amino acid-polyamine-choline，APC）超家族和氨基酸/生長(zhǎng)素透性酶（Amino acid/auxin permease，AAAP）超家族。其中，APC超家族又分為3個(gè)亞家族：陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Cationic amino acid transporters，CATs）家 族、氨 基 酸/膽 堿 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白（Amino acid/choline transporters，ACTs）家族和多胺、H+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Polyamine H+symporters，PHSs）家族；AAAP超家族又分為6個(gè)亞家族：氨基酸透性酶（Amino acid permeases，AAPs）家族、賴(lài)氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Lysine-histidine-like transporters，LHTs）家族、脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Proline transporters，ProTs）家族、γ-氨基酸丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（γ-aminobutyric acid transporters，GATs）家族、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Auxin transporters，AUXs）家族和芳香族和中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Aromatic and neutral amino acid transporters，ANTs）家族（Fischer et al.，1998）。水稻于2012年完成AAT家族的全基因組分析，共鑒定出85個(gè)AAT編碼基因，其中共鑒定了19個(gè)AAP家族成員（Zhao et al.，2012）。大量研究證實(shí)，AAAP參與水稻從土壤中吸收氨基酸，以及氨基酸在木質(zhì)部的轉(zhuǎn)移或韌皮部和種子中的積累（Tegeder and Rentsch，2010）。已報(bào)道水稻OsAAP1基因在根尖和側(cè)根表皮細(xì)胞表達(dá)量較高，有利于促進(jìn)中性氨基酸如脯氨酸、丙氨酸和酪氨酸等的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)水稻分蘗和單株產(chǎn)量具有正調(diào)控作用（Ji et al.，2020）。水稻OsAAP3基因在根中表達(dá)較高，其編碼蛋白主要運(yùn)輸賴(lài)氨酸和精氨酸，負(fù)調(diào)控水稻分蘗芽的伸長(zhǎng)和分蘗的產(chǎn)生及單株產(chǎn)量（Taylor et al.，2015；Lu et al.，2018；Wang et al.，2019），且該蛋白在葉片中可通過(guò)調(diào)節(jié)精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)和一氧化氮途徑影響水稻葉片假病斑和衰老（Wei et al.，2021）。水稻OsAAP4基因在根的皮層細(xì)胞表達(dá)量較高，在葉片、葉鞘、莖和穗的維管束也有表達(dá)，從而調(diào)控中性氨基酸（纈氨酸和脯氨酸）的運(yùn)輸，且OsAAP4a和OsAAP4b兩種剪接的超表達(dá)植株在不同中性氨基酸濃度下促進(jìn)分蘗芽的伸長(zhǎng)，正調(diào)控單株產(chǎn)量（Fang et al.，2021）。水稻OsAAP5基因在根的皮層細(xì)胞、葉鞘、幼穗的維管束薄壁細(xì)胞均有表達(dá)，表明其在木質(zhì)部和韌皮部的氨基酸運(yùn)輸發(fā)揮重要作用，調(diào)控堿性氨基酸（賴(lài)氨酸和精氨酸）和中性氨基酸（丙氨酸和纈氨酸）的運(yùn)輸，負(fù)調(diào)控水稻分蘗芽的伸長(zhǎng)和單株產(chǎn)量（Wang et al.，2019）。水稻OsAAP6基因主要在根表皮和韌皮部表達(dá)，參與水稻根部對(duì)蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和酸性氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，其次在胚乳中表達(dá)量也較高，表達(dá)上調(diào)能夠增加種子蛋白質(zhì)含量，且同時(shí)抑制支鏈淀粉的合成，對(duì)于稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)具有重要意義（Peng et al.，2014，Ogasawara et al.，2021）。水稻OsAAP10基因在莖中表達(dá)相對(duì)較高，敲除OsAAP10基因后谷粒蛋白含量顯著下降，同時(shí)還改變了淀粉的含量和組成（Shi et al.，2020；Wang et al.，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然前人研究已表明，AAP亞家族的部分成員參與了水稻氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和生長(zhǎng)發(fā)育，但大多數(shù)成員的時(shí)空表達(dá)特性和生物學(xué)功能尚不清楚。目前鮮見(jiàn)有關(guān)水稻AAPs家族基因OsAAP14啟動(dòng)子克隆及時(shí)空表達(dá)特性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以中花11為材料，克隆OsAAP14基因的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建pCAMBIA1391Z-OsAAP14表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化獲得啟動(dòng)子-GUS植株，通過(guò)對(duì)植株各組織部位進(jìn)行GUS染色，采用石蠟切片技術(shù)觀(guān)察不同組織細(xì)胞部位表達(dá)，經(jīng)不同氨基酸處理后進(jìn)行根部GUS染色，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)上述GUS染色部位對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)量，分析該基因的時(shí)空表達(dá)特性，以期揭示OsAAP14基因的表達(dá)規(guī)律，為水稻分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻材料為中花11（ZH11），供試菌株為大腸桿菌（Escherichia coil）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，表達(dá)載體為pCAMBIA1391Z，由貴州大學(xué)植物激素與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控實(shí)驗(yàn)室提供，2×Phanta Max DNA聚合酶、2×RapidTaqMaster Mix DNA聚合酶、DNA Marker、HisScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix實(shí)時(shí)熒光試劑盒、Trizol試劑、質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收純化試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。T4 DNA連接酶、BamHⅠ、EcoRⅠ限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司。引物合成和測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司重慶部完成。GUS染液購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司。20種氨基酸粉末購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及引物設(shè)計(jì).參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（薩姆布魯克和拉塞爾，2002），使用CTAB法提取水稻中花11葉片樣品DNA。根據(jù)Phytozome網(wǎng)站（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）中的OsAAP14（LOC_Os04g56470）序列為參考序列，使用Primer primer 5.0設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物：qPCR-AAP14-F/qPCR-AAP14-R、OsAAP14-GUS-F/OsAAP14-GUS-R、GUS-AAP14JD-F/GUS-AAP14JD-R（表1），委托北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用的引物序列信息Table 1 Primer sequences information used in the test

1.2.2OsAAP14基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增.以中花11 DNA為模板、OsAAP14-GUS-F/OsAAP14-GUS-R為引物，用2×Phanta Max DNA聚合酶進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×Phanta Max DNA聚合酶25.0 μL，100 μm/μL OsAAP14-GUS-F和OsAAP14-GUS-R各2.0 μL，100 ng/μL DNA模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，利用膠回收試劑盒回收純化目的條帶，送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在Phytozome網(wǎng)站進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，以確定所獲片段是否為目標(biāo)片段。使用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)OsAAP14基因啟動(dòng)子中的順式作用元件進(jìn)行分析。

1.2.3OsAAP14基因啟動(dòng)子-GUS表達(dá)載體構(gòu)建將純化回收的OsAAP14基因啟動(dòng)子片段和pCAMBIA1391Z進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，反應(yīng)條件為37℃，4 h，分別回收純化酶切反應(yīng)液中的目的片段和載體片段，使用T4 DNA連接酶將兩者連接，反應(yīng)條件為16℃，8 h。將重組質(zhì)粒pCAMBIA1391ZOsAAP14轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選出陽(yáng)性菌落，使用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.6左右，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.2.4OsAAP14基因啟動(dòng)子-GUS表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定.將重組陽(yáng)性質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染中花11愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)化植株，待小苗強(qiáng)壯時(shí)剪取葉片2 cm，使用CTAB法提取其基因組DNA，以GUS-AAP14JD-F和GUS-AAP14JD-R為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。將PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性的小苗移至溫室種植。

1.2.5OsAAP14基因啟動(dòng)子-GUS表達(dá)活性檢測(cè)收獲鑒定成功的T0代種子后，將其浸泡在水中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待種子的芽長(zhǎng)到2 cm左右，將其播種到96孔板溫室光照水培，待小苗到三葉時(shí)期，換用國(guó)際水稻研究所的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)液（表2）培養(yǎng)。待小苗長(zhǎng)到生殖期，采集小苗的根、芽伸長(zhǎng)的基部、莖、葉鞘、葉和穗，侵泡于GUS染色液進(jìn)行染色，37℃保存24 h，然后用75%酒精脫色3次后于4℃保存。將用酒精脫色后的材料置于顯微鏡下觀(guān)察，藍(lán)色部位為GUS活性表達(dá)位點(diǎn)。

表2 國(guó)際水稻研究所常規(guī)營(yíng)養(yǎng)液的成分Table 2 Composition of conventional nutrient solution with the International Rice Research Institute

制備微量元素貯備液時(shí)，各種鹽類(lèi)分別溶解，再與50 mL的硫酸混勻，加蒸餾水稀釋至1 L。使用時(shí)每4 L營(yíng)養(yǎng)液添加微量元素貯備液5 mL。用HCl調(diào)節(jié)pH值到5.0，每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)液。

1.2.6 制作水稻GUS染色的組織部位的石蠟切片從水稻的根、葉鞘、莖、葉和穗各部位切取2 mm的小段，放入FAA固定液中固定1.5 h。固定后用50%、65%、85%、100%濃度的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為10 min，然后使用二甲苯和無(wú)水乙醇比例為1∶2、1∶1、2∶1的混合液中按順序分別透明10 min，最終轉(zhuǎn)入純二甲苯中透明2次，每次5 min，至各組織部位透明。將處理過(guò)后的透明組織放入融化石蠟液中，浸泡1 h，冷卻后直接切片，厚度為5 μm，切片于50℃烤干后使用二甲苯脫蠟2次，每次15 min，最后使用中性樹(shù)膠封片，體視鏡下觀(guān)察拍照。

1.2.7 氨基酸處理誘導(dǎo)表達(dá).將OsAAP14-GUS轉(zhuǎn)基因植株的T1代種子浸泡在水中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待種子的芽長(zhǎng)到2 cm左右時(shí)播種到96孔板，在溫室光照下用全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培，待小苗生長(zhǎng)到3周左右，將全營(yíng)養(yǎng)液中氮素?fù)Q成5個(gè)不同類(lèi)型的外源氨基酸處理，分別為添加終濃度為0.5 mmol/L酸性氨基酸（天冬氨酸0.2 mmol/L、谷氨酸0.3 mmol/L）、0.5 mmol/L堿性氨基酸（精氨酸0.2 mmol/L、賴(lài)氨酸0.1 mmol/L、組氨酸0.2 mmol/L）、1 mmol/L中性氨基酸1（絲氨酸0.1 mmol/L、蘇氨酸0.2 mmol/L、甘氨酸0.2 mmol/L、丙氨酸0.3 mmol/L、脯氨酸0.2 mmol/L）、1 mmol/L中性氨基酸2（纈氨酸0.2 mmol/L、半胱氨酸0.1 mmol/L、天冬酰胺0.3 mmol/L、谷氨酰胺0.3 mmol/L、酪氨酸0.1 mmol/L）、1 mmol/L中性氨基酸3（蛋氨酸0.1 mmol/L、色氨酸0.1 mmol/L、亮氨酸0.2 mmol/L、異亮氨酸0.3 mmol/L、苯丙氨酸0.3 mmol/L）。培養(yǎng)0、1和2 h時(shí)取根部進(jìn)行GUS染色，比較植株在不同類(lèi)型氨基酸處理下的GUS活性。用0.2 mmol/L的精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸分別處理0、1和2 h時(shí)取根部進(jìn)行GUS染色，比較植株在不同氨基酸處理下的GUS活性。

1.2.8OsAAP14基因表達(dá)分析.于野生型中花11生殖期取其根部、芽伸長(zhǎng)的基部、葉鞘、莖、葉片和穗，使用Trizol植物總RNA提取法提取各部位總RNA，并使用HisScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板、qPCR-AAP14-F和qPCRAAP14-R為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系10 μL：TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μ L，100 μm/μL qPCR-AAP14-F和qPCRAAP14-R引物各1 μL，100 ng/μL cDNA模板1 μL，ddH2O 2 μL。以O(shè)sActin基因?yàn)閮?nèi)參，利用2-Ct計(jì)算水稻不同組織中OsAAP14基因的相對(duì)表達(dá)量。

對(duì)野生型中花11小苗同樣采用1.2.7中的氨基酸處理方法，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同氨基酸處理下OsAAP14基因的相對(duì)表達(dá)量。分別采用2 μmol/L的赤霉素和2 μmol/L脫落酸處理野生型中花11小苗，于處理0、1和2 h時(shí)采集其根部樣品，使用Trizol植物總RNA提取法提取根部總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以其為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源激素處理下OsAAP14基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，數(shù)據(jù)重復(fù)4次，利用GraphPad Prism 7繪制柱形圖，并利用SPSS中的Duncan’s新復(fù)極差法方法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsAAP14基因啟動(dòng)子擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

以O(shè)sAAP14-GUS-F和OsAAP14-GUS-R為 引物、中花11基因組DNA為模板進(jìn)行OsAAP14基因啟動(dòng)子序列PCR擴(kuò)增，獲得一條特異性條帶，約2000 bp（圖1），回收純化后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示該片段長(zhǎng)1993 bp，與參考序列日本晴OsAAP14（LOC_Os04g 56470）序列一致。

圖1 OsAAP14基因啟動(dòng)子序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of amplification of OsAAP14 gene promoter sequence

2.2 OsAAP14基因啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果

為了解OsAAP14基因的啟動(dòng)子序列信息，使用PlantCARE對(duì)OsAAP14基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如圖2和表3所示。OsAAP14基因啟動(dòng)子序列包含有以下功能元件：MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)CCAAT-box 1個(gè)；參與干旱響應(yīng)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS 2個(gè)；參與光反應(yīng)的元件TCT-motif、AEbox和G-box分別有1、2和5個(gè)；參與赤霉素響應(yīng)元件P-box 1個(gè)；核心啟動(dòng)子元件和啟動(dòng)子中常見(jiàn)的順式作用元件TATA-box和CAAT-box分別有52和16個(gè)；參與脫落酸響應(yīng)元件ABRE 5個(gè)；響應(yīng)厭氧誘導(dǎo)順式作用元件ARE 1個(gè)；參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件TC-rich repeats 1個(gè)；參與響應(yīng)茉莉酸甲酯信號(hào)的順式作用元件CGTCA-motif 6個(gè)；與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件CAT-box 1個(gè)；參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控的順式作用元件O2-site 2個(gè)。

表3 OsAAP14基因啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果Table 3 The result of OsAAP14 gene promoter cis-acting element analysis

圖2 OsAAP14啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果Fig.2 The result of OsAAP14 promoter cis-acting element analysis

2.3 OsAAP14基因啟動(dòng)子-GUS表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

分別將回收純化的OsAAP14基因啟動(dòng)子序列片段和pCAMBIA1391Z進(jìn)行酶切后，用T4 DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取部分單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖3-A。挑取部分陽(yáng)性克隆菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，提取其重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，結(jié)果表明成功構(gòu)建OsAAP14基因啟動(dòng)子-GUS表達(dá)載體pCAMBIA1391ZOsAAP14（圖3-B）。對(duì)16株遺傳轉(zhuǎn)化獲取的轉(zhuǎn)化苗總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選鑒定出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所鑒定的轉(zhuǎn)化苗均為陽(yáng)性植株（圖4）。

圖3 單克隆菌落菌液PCR驗(yàn)證（A）及重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證（B）Fig.3 Bacterial liquid PCR verification of monocloning（A）and enzyme digestion verification of recombinant plasmid（B）

圖4 轉(zhuǎn)基因植株鑒定結(jié)果Fig.4 Identification results of transgenic plants

2.4 OsAAP14基因啟動(dòng)子-GUS植株染色及基因表達(dá)量分析

為了解OsAAP14基因的時(shí)空表達(dá)特性，對(duì)T1代OsAAP14基因啟動(dòng)子-GUS植株的不同組織部位進(jìn)行GUS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水稻根部（圖5-A）、芽伸長(zhǎng)的基部（圖5-B）、葉鞘（圖5-C）、莖（圖5-D）、葉片（圖5-E）和穗（圖5-F）均有明顯的染色，說(shuō)明OsAAP14基因在水稻不同組織中均有表達(dá)，但芽伸長(zhǎng)的基部和葉片的染色更深。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，OsAAP14基因在水稻芽伸長(zhǎng)的基部和葉片的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織（P＜0.05）（圖5-L）。為了了解OsAAP14基因在不同組織部位細(xì)胞中的表達(dá)情況，對(duì)上述染色部位進(jìn)行石蠟切片分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsAAP14基因在根部皮層薄壁細(xì)胞（圖5-G）、葉鞘的韌皮部（圖5-H）、莖的維管束部位（圖5-I）、葉片的葉肉部位（圖5-J）和穗的穎殼內(nèi)部（圖5-K）均有表達(dá)，其中在根部皮層薄壁細(xì)胞、葉片的葉肉部位和穗的穎殼內(nèi)部的表達(dá)水平較高。

圖5 OsAAP14啟動(dòng)子-GUS植株染色、切片及組織表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Staining，sectioning and tissue expression identification of OsAAP14 promoter-GUS plants

2.5 外源氨基酸和激素處理對(duì)OsAAP14基因表達(dá)的影響

為了解外源氨基酸和激素對(duì)OsAAP4基因表達(dá)的影響，采用5種不同類(lèi)型氨基酸對(duì)OsAAP14啟動(dòng)子-GUS植株進(jìn)行0、1和2 h處理，取根部進(jìn)行GUS染色，比較不同類(lèi)型氨基酸處理下的根部GUS表達(dá)情況，結(jié)果如圖6和圖7所示。堿性氨基酸處理下隨著處理時(shí)間的增加，植株根部GUS染色加深，而酸性氨基酸處理下染色沒(méi)有加深（圖6-A和圖6-B），說(shuō)明堿性氨基酸強(qiáng)烈誘導(dǎo)了OsAAP14基因的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果也表明，堿性氨基酸處理顯著提高了OsAAP14基因的相對(duì)表達(dá)量，而酸性氨基酸對(duì)OsAAP14基因的表達(dá)無(wú)顯著影響（P＞0.05）（圖6-C和圖6-D）。GUS染色結(jié)果和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示，中性氨基酸對(duì)OsAAP14基因的表達(dá)無(wú)顯著影響，或者抑制OsAAP14基因的表達(dá)（圖7）。

圖6 外源酸性氨基酸和堿性氨基酸處理對(duì)根部OsAAP14基因表達(dá)的影響Fig.6 The effect of exogenous acidic amino acids and basic amino acids on gene expression of OsAAP14 in roots

圖7 外源中性氨基酸處理對(duì)OsAAP14基因表達(dá)的影響Fig.7 The effect of exogenous neutral amino acids on gene expression of OsAAP14

采用堿性氨基酸中的精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸分別單獨(dú)處理OsAAP14啟動(dòng)子-GUS植株0、1和2 h，取根部進(jìn)行GUS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組氨酸處理下，隨著處理時(shí)間的增加根部染色加深（圖8-A），實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，OsAAP14基因隨著處理時(shí)間增加表達(dá)量顯著升高，與GUS染色結(jié)果一致（圖8-D），表明組氨酸能強(qiáng)烈誘導(dǎo)OsAAP14基因的表達(dá)。精氨酸和賴(lài)氨酸處理下，隨著處理時(shí)間的增加，根部染色未加深（圖8-B和圖8-C），實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示OsAAP14基因的相對(duì)表達(dá)量未發(fā)生顯著變化（圖8-E和圖8-F）。分別采用外源激素赤霉素和脫落酸對(duì)野生型中花11植株進(jìn)行0、1和2 h處理，取根部進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明OsAAP14基因受赤霉素和脫落酸誘導(dǎo)，相對(duì)表達(dá)量顯著升高（圖9）。

圖8 外源組氨酸、精氨酸和賴(lài)氨酸處理對(duì)OsAAP14基因表達(dá)的影響Fig.8 The effect of exogenous histidine，arginine and lysine treatments on gene expression of OsAAP14

圖9 外源赤霉素和脫落酸處理下OsAAP14基因在根部的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 The effect of exogenous gibberellin and abscisic acid on gene relative expression of OsAAP14 in roots

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)OsAAP14基因在水稻芽伸長(zhǎng)的基部表達(dá)量最高，在根、葉鞘、葉片和穗也有一定表達(dá)，但在莖中表達(dá)量最低。已有報(bào)道表明水稻OsAAP1、OsAAP3、OsAAP4和OsAAP5基因在根、芽伸長(zhǎng)的基部、葉鞘、葉片和幼穗的表達(dá)量均較高，其中，OsAAP3基因在莖中的表達(dá)量也較高，而OsAAP1、OsAAP4和OsAAP5基因在莖中表達(dá)量較低（Lu et al.，2018；

Wang et al.，2019；Ji et al.，2020；Fang et al.，2021）?？梢?jiàn)，OsAAP14基因在水稻不同組織中的表達(dá)規(guī)律與OsAAP1、OsAAP4和OsAAP5基因相似，但與OsAAP3基因的表達(dá)規(guī)律不同。此外，OsAAP1和OsAAP4基因在根表皮和皮層及葉片的葉肉細(xì)胞表達(dá)，但在穎殼內(nèi)外均有表達(dá)（Ji et al.，2020；Fang et al.，2021）。本研究發(fā)現(xiàn)，OsAAP14基因在根部皮層薄壁細(xì)胞、葉片的葉肉細(xì)胞、穗的穎殼內(nèi)部有較高表達(dá)?？梢?jiàn)，AAPs家族多個(gè)成員在根的表皮和皮層均有較高表達(dá)，說(shuō)明這些成員協(xié)同參與了根部的氨基酸運(yùn)輸，但在地上組織中不同成員可能功能分工不同。

植物可以根據(jù)外界養(yǎng)分的種類(lèi)和濃度不同來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，如蛋白胨、谷氨酸和谷氨酰胺處理時(shí)，水稻寡肽運(yùn)輸基因OsNPF7.3的啟動(dòng)子-GUS植株根部染色加深（Fang et al.，2017）。NO3-濃度（0.5~5.0 mmol/L）逐漸增加時(shí)，硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsNPF5.16在根中的表達(dá)量逐漸增加（Wang et al.，2022）。本研究發(fā)現(xiàn)，堿性氨基酸中組氨酸作為唯一氮源時(shí)，OsAAP14基因啟動(dòng)子-GUS植株根部染色加深，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，組氨酸可誘導(dǎo)OsAAP14基因的表達(dá)，表明氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)受氨基酸類(lèi)有機(jī)氮源的調(diào)控，而OsAAP14基因正常情況下可能主要參與調(diào)控水稻地上部分氨基酸的運(yùn)輸，但當(dāng)外界組氨酸含量增加時(shí)則參與調(diào)控水稻根部氨基酸的運(yùn)輸。在其他前人研究報(bào)道中，使用外源谷氨酸處理誘導(dǎo)水稻根中防御相關(guān)基因如Os-WRKY76、OsJAZ3等 表 達(dá) 上 調(diào)（Kadotani et al.，2016）。同樣地，谷氨酸處理也誘導(dǎo)擬南芥根中的谷氨酸受體基因AtGLR2.7和谷氨酰胺合成基因AtGSR1表達(dá)上調(diào)（Marella et al.，2013；Molly et al.，2014；Guo et al.，2019）。這進(jìn)一步說(shuō)明氨基酸誘導(dǎo)基因的表達(dá)具有廣泛性。

近年來(lái)，啟動(dòng)子被廣泛應(yīng)用于植物的基因表達(dá)分析，是開(kāi)展基因功能研究的有效途徑之一（Gago et al.，2011；劉瑞達(dá)等，2022）。本研究通過(guò)啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，OsAAP14基因的啟動(dòng)子序列除了包含有核心啟動(dòng)子元件TATA-box和CAAT-box之外，還包含赤霉素和脫落酸等激素響應(yīng)元件。為了進(jìn)一步驗(yàn)證OsAAP14基因的表達(dá)是否受到這兩類(lèi)激素的調(diào)控，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，赤霉素和脫落酸均誘導(dǎo)OsAAP14基因上調(diào)表達(dá)。玉米Zm-RXO1基因的啟動(dòng)子序列有P-box、GARE-motif和MBS等激素響應(yīng)元件，同樣外源茉莉酸、赤霉素、脫落酸等激素處理后ZmRXO1基因的表達(dá)水平升高（Tao et al.，2015），說(shuō)明基因的時(shí)空表達(dá)特性與啟動(dòng)子序列中的關(guān)鍵元件有重要關(guān)聯(lián)。因此，在今后OsAAP14基因功能研究中，應(yīng)結(jié)合組氨酸植物激素（赤霉素和脫落酸）處理分析其對(duì)OsAAP14基因表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步探究該基因?qū)Π被徇\(yùn)輸及生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

4 結(jié)論

OsAAP14基因在水稻不同組織均有表達(dá)，正常情況（未處理）下在水稻芽伸長(zhǎng)的基部和葉片中的相對(duì)表達(dá)量較高，但外源氨基酸和激素處理時(shí)，在根中該基因被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明OsAAP14基因正常情況下可能主要參與調(diào)控水稻地上部分氨基酸的運(yùn)輸，但當(dāng)外界氨基酸和激素含量增加時(shí)則參與調(diào)控水稻根部氨基酸的運(yùn)輸。