賁海燕，曲紅云，霍建飛，姚玉榮，高 葦，郝永娟，王萬立，張雪巖，胡建坤，黃瑞榮*

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，天津 300381；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝分院，黑龍江 哈爾濱 150069；3.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，江西 南昌 330200）

【研究意義】由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaKleb）侵染引起的茄子黃萎?。╒erticillium wilt）是一種世界性土傳病害[1]。該病原菌的寄主范圍廣泛，除侵染茄子外，還可對棉花、向日葵、番茄、草莓、馬鈴薯等600 多種作物造成危害[2]。【前人研究進(jìn)展】1914 年美國首次發(fā)現(xiàn)由大麗輪枝菌引發(fā)的棉花黃萎病，而后在1935 年我國因引進(jìn)美國的棉花品種而傳入黃萎病菌[3]。在20 世紀(jì)50 年代初期，茄子黃萎病僅在我國東北局部地區(qū)發(fā)生，隨著茄果類蔬菜種植面積的不斷擴(kuò)大而迅速蔓延，發(fā)病范圍也日益南擴(kuò)，目前在我國茄子主栽培區(qū)均有該病害的發(fā)生。茄子黃萎病發(fā)病率較高，一般年份發(fā)病率在40%～50%，嚴(yán)重年份可達(dá)70%以上，致使毀種失收，對茄子產(chǎn)量和品質(zhì)均造成嚴(yán)重的影響，已成為制約茄子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害[1,4]。黃萎病屬于典型的土傳維管束病害，其致病菌大麗輪枝菌的主要存活結(jié)構(gòu)和初侵染源是微菌核，由于其抗逆性強(qiáng)，在土壤中存活時(shí)間較長，化學(xué)防治并不理想；倒茬輪作雖然有效，但在茄子生產(chǎn)茬口安排會(huì)帶來實(shí)際困難；嫁接技術(shù)是減輕茄子黃萎病發(fā)生有效的方法，但由于其操作環(huán)節(jié)多、技術(shù)要求較高以及增加投入成本等問題，很難在實(shí)踐生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。選育及利用抗病品種是防治茄子黃萎病最直接、安全、高效的措施之一，其中篩選抗病種質(zhì)資源是抗病育種中重要的基礎(chǔ)工作。自然病圃法是抗病性鑒定中最傳統(tǒng)、應(yīng)用最普遍的方法，目前其鑒定結(jié)論仍是新品種審定時(shí)主要的依據(jù)，但由于其鑒定周期長，且受季節(jié)的影響，鑒定材料數(shù)量受到限制[5]。此外，病圃中病菌數(shù)量的不確定、分布不均以及氣候環(huán)境條件的變化等一系列因素均會(huì)影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】苗期室內(nèi)人工接種法，不受季節(jié)影響，能更好地控制選擇壓，并且可大量、重復(fù)性篩選材料[6]。目前作物黃萎病采用的接種方法多為蘸根法、傷根法，這在棉花和向日葵等作物上研究的較為深入，而茄子上的接種鑒定方法報(bào)道較少[7-10]。進(jìn)一步完善、改進(jìn)茄子黃萎病人工接種技術(shù)仍有必有?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，本研究以茄子為試驗(yàn)材料，采用現(xiàn)有報(bào)道的接種方法比較在同一品種上的接種效果，并綜合探究了不同類型強(qiáng)致病力菌株、菌液濃度、茄子苗齡等因素對接種成效的影響、以期優(yōu)化最佳接種技術(shù)，從而構(gòu)建高效、穩(wěn)定、簡便的茄子黃萎病苗期抗病性鑒定評價(jià)體系，為茄子黃萎病基礎(chǔ)研究、抗病育種與利用及抗源篩選等提供技術(shù)支撐。同時(shí)，采用本研究優(yōu)化的茄子黃萎病抗性鑒定技術(shù)對收集到的50份茄子資源品種的抗性進(jìn)行鑒評，通過與田間病圃中各品種的抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行比對，以驗(yàn)證優(yōu)化技術(shù)的實(shí)用性和鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。并期待挖掘到抗耐黃萎病的茄子資源種質(zhì)，以緩解當(dāng)前生產(chǎn)抗耐黃萎病品種不足及茄黃萎病育種抗源材料匱乏問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種：茄子品種龍雜茄10 號(hào)，為本課題組培育的耐病品種。供試菌株：不同培養(yǎng)性狀的強(qiáng)致病力菌株25 株，其中A 型菌株11 株，為菌核型，菌落生長緩慢，菌核多；B 型菌株7 株，為菌核型，菌落為灰黑色，菌落生長較慢，菌核多；C 型菌株3 株，為絲核型，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌核較多，菌落生長較快；D 型菌株4株，為菌絲型，氣生菌絲發(fā)達(dá)，為灰白色[11]。所有菌株均由本課題組單孢分離、純化后保存（表1）。

表1 茄子黃萎病菌25株菌株來源Tab.1 The origin of 25 isolates of Verticillium dahliae

1.2 茄子黃萎病菌產(chǎn)孢力的測定

將25 個(gè)供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4 d 后，在無菌工作臺(tái)中，使用滅好菌的打孔器打取菌碟，每150 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中放入2塊，25 ℃，130 r/min搖床培養(yǎng)4 d產(chǎn)孢量較多時(shí)，四層紗布過濾，收集濾液15 mL，用蒸餾水定容至100 mL，配制成孢子懸浮液，取少量用血球計(jì)數(shù)板測量，計(jì)算每毫升孢子個(gè)數(shù)，每個(gè)菌株3次重復(fù)。

1.3 茄子黃萎病菌最佳接種濃度的篩選

從上述產(chǎn)孢力強(qiáng)的菌株中選擇4 種不同培養(yǎng)類型菌株各1 株（A 型菌株2015-078；B 型菌株2015-037；C 型菌株2015-061；D 型菌株2015-102），25 ℃、130 r/min 搖床液體培養(yǎng)4 d 后，紗布過濾，濃度分別稀釋至108，107，106，105，104個(gè)孢子/mL。茄苗長至3～4 片真葉期，采用傷根后10 mL 菌懸液灌根接種法，每個(gè)處理32棵茄子苗，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4 茄子黃萎病菌接種方法的篩選

在試驗(yàn)溫室內(nèi)，茄苗長至3～4 片真葉期，采用上述篩選出的接種菌株“2015-61”，接種濃度為1×105個(gè)孢子/mL，以5 種處理方式接種：①蘸根法，把茄子幼苗輕輕拔起，根部泥土清洗干凈后蘸根30 min；②灌根法，在根際1 cm 部位斜切一刀后，將10 mL 孢子懸浮液進(jìn)行灌根；③拌土法，把孢子懸浮液拌入土壤中均勻，使土壤接種終濃度為1×105個(gè)孢子/mL；④注射法，將10 mL 孢子懸浮液用滅菌針頭注入茄苗莖基部；⑤無底缽傷根法，采用8連排特制營養(yǎng)缽，將缽底部長出的須根剪斷后浸泡在菌懸液中30 min。以無菌水處理為對照組（CK）。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)32棵茄子苗。

1.5 無底缽傷根法接種苗齡的篩選

采用無底缽傷根法對茄子不同真葉期（3～4 片、5～6 片和7～8 片）進(jìn)行最佳接種苗齡的篩選。接種菌株為“2015-61”，接種濃度1×105個(gè)孢子/mL，剪斷缽底須根后浸泡在菌懸液中30 min。每個(gè)處理32 株苗，3次重復(fù)。

1.6 無底缽傷根法最佳接種時(shí)間的篩選

在試驗(yàn)溫室中，茄苗長至3～4 片真葉，剪斷無底缽須根后，分別進(jìn)行10，20，30 min 不同浸泡時(shí)間的處理。接種菌株為“2015-61”，接種濃度為1×105個(gè)孢子/mL。每個(gè)處理32 株苗，3 次重復(fù)。試驗(yàn)期間茄苗按常規(guī)方法管理，但防蟲不治病。

1.7 病情調(diào)查及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

所有試驗(yàn)均在黑龍江省農(nóng)科院試驗(yàn)溫室內(nèi)進(jìn)行，白天平均溫度27.3 ℃，夜間平均溫度為17.5 ℃。

接種后，待茄子黃萎病典型發(fā)病癥狀出現(xiàn)后進(jìn)行第一次病情調(diào)查，之后每10 d 調(diào)查一次，至發(fā)病穩(wěn)定不再擴(kuò)展。依據(jù)如下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情級(jí)數(shù)調(diào)查，計(jì)算病情指數(shù)。

茄子黃萎病苗期分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，植株生長健康，無發(fā)病癥狀；1級(jí)，植株1～2真葉發(fā)黃、卷曲或葉片脫落；2 級(jí)，植株3 片及以上真葉發(fā)黃、卷曲或脫落；3 級(jí)，整個(gè)植株的真葉幾乎全部發(fā)病，出現(xiàn)萎蔫、黃化或脫落，而植株頂部新葉片健康或發(fā)黃但未脫落，全株未完全枯死；4級(jí)，植株全株枯死或只剩光桿。

發(fā)病率及病情指數(shù)按照以下公式計(jì)算：

1.8 茄子黃萎病抗病性鑒定與評價(jià)

采用以上建立的無底缽傷根法對本研究室保存的50份茄子種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定。依據(jù)這些材料品種在本單位占地700 m2的茄子黃萎病標(biāo)準(zhǔn)病圃的結(jié)果進(jìn)行比較驗(yàn)證。茄子黃萎病抗病性鑒定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：

免疫（I）：DI=0；抗?。≧）：DI≤15；中抗（MR）：15＜DI≤30，耐?。═）：30＜DI≤50；中感（MS）：50＜DI≤70；感?。⊿）：DI＞70。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理，并用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

（3）經(jīng)營產(chǎn)品線：對經(jīng)銷商的代理產(chǎn)品進(jìn)行全面調(diào)研，代理產(chǎn)品中一定不能有公司競品，其主要經(jīng)營資金等應(yīng)集中在B公司的產(chǎn)品上。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄子黃萎病菌株類型的篩選

試驗(yàn)結(jié)果表明，25株強(qiáng)致病力菌株中7株有較好的產(chǎn)孢力（表2），其中A型菌株3 株，B 型菌株2 株，C 型菌株1 株，D 型菌株1 株，25 ℃搖床培養(yǎng)第4 天產(chǎn)孢量達(dá)到最大，孢子濾液定容稀釋后的濃度為1.1×107～2.3×107個(gè)孢子/mL，推算原濾液孢子濃度在7.33×107～15.33×107個(gè)孢子/mL。茄子黃萎病菌常見的接種濃度為1×107個(gè)孢子/mL，本試驗(yàn)中篩選到這7 株菌株產(chǎn)孢快，可作為接種試驗(yàn)的接種菌株。其他菌株由于產(chǎn)孢量不足或達(dá)到最佳產(chǎn)孢量所需時(shí)間較長，影響接種鑒定試驗(yàn)效率，因此不用于本試驗(yàn)的接種鑒定。

表2 不同培養(yǎng)性狀的強(qiáng)致病力菌株25株產(chǎn)孢量的比較Tab.2 The spore-producing rates of 25 Highly pathogenic strains with different culture traits were compared

2.2 茄子黃萎病菌接種濃度的篩選

試驗(yàn)選取的四種類型菌株均有較強(qiáng)的致病力，但植株整體發(fā)病的嚴(yán)重程度存在一定差異（表3）。其中A 型菌株“2015-178”發(fā)病較輕，接種25 d，不同接種濃度的平均病情指數(shù)為61.6～65.8；D型菌株“2015-102”整體發(fā)病最重，接種25 d的平均病情指數(shù)為73.4～84.4。C型菌株“2015-61”以菌液濃度1×107個(gè)孢子/mL 接種的病情指數(shù)最高達(dá)86.9，但其致病力與D 型菌株“2015-102”比較，在相同菌液濃度下無顯著性差異。各菌株不同濃度接種后發(fā)病趨勢基本相似，即接種濃度越大，發(fā)病越嚴(yán)重（表3），當(dāng)接種濃度為1.0×106個(gè)孢子/mL 及以上時(shí)，各菌株病情指數(shù)差異不顯著，發(fā)病趨于穩(wěn)定。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌株“2015-61”有更好的致病效率（表3），其處理濃度為1×105個(gè)孢子/mL 時(shí)，接種15 d和25 d的病情指數(shù)分別為44.3和78.1，與1×106個(gè)孢子/mL及以上的病情指數(shù)差異不顯著，可達(dá)到同樣的致病效果。因此，接下來的鑒定方法試驗(yàn)和抗病性鑒定試驗(yàn)均應(yīng)用菌株“2015-61”接種，以減少菌種擴(kuò)繁工作量，提高試驗(yàn)成效。

表3 不同接種濃度對茄子黃萎病發(fā)病程度的影響Tab.3 Effects of different inoculum concentrations on resistance to eggplant Verticillium wilt

2.3 茄子黃萎病菌接種方法的篩選

試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果顯示，5 種接種方法均能誘導(dǎo)茄苗發(fā)病，但病害顯癥及病情差異較大（表4）。蘸根接種，發(fā)病速率快，接種第8 天即表現(xiàn)出底部葉片變黃、半邊退綠的癥狀，接種第25 天平均病指最高達(dá)85.7。灌根法在接種傷根時(shí)較難把控，接種第25天的病情指數(shù)為77.1，整體表現(xiàn)為發(fā)病不均勻。注射法接種，病情進(jìn)展相對較慢，病情嚴(yán)重度低于蘸根接種和灌根接種；該法操作困難，功效低。拌土法接種，顯癥慢，接種第12天才開始顯癥；整體發(fā)病輕，接種15 d和25 d的平均病情指數(shù)分別為20.1和62.2，明顯低于其他接種方法，且發(fā)病不均勻。無底缽傷根法接種發(fā)病速率較快、均勻度好，操作簡便，接種后第15、25 天的平均病指分別為44.5 和80.5，接種成效與蘸根接種和灌根接種無差異，病情指數(shù)與鑒定寄主的實(shí)際抗感情況較為一致。

表4 不同接種方法對茄子黃萎病發(fā)病程度的影響Tab.4 Effects of different inoculum methods on resistance to eggplant Verticillium wilt

2.4 無底缽傷根法不同接種苗齡對發(fā)病的影響

結(jié)果顯示，茄子植株不同苗齡進(jìn)行接種對黃萎病發(fā)病程度的影響較大（表5），其中3～4 片真葉期發(fā)病效果最好，處理25 d后病株率和病情指數(shù)分別為100%，59.8，好于其它處理，此時(shí)清水對照處理植株生長良好，無發(fā)病；而4～5 片真葉、6～7 片真葉期病情指數(shù)在53.7 以上，但其清水對照處理植株葉片出現(xiàn)大面積黃化，花葉斑，植株老化嚴(yán)重，干擾其病情指數(shù)的調(diào)查，影響最終的調(diào)查結(jié)果。因此無底缽傷根法最佳接種苗齡為3～4片真葉期為宜。

表5 不同接種苗齡對茄子黃萎病發(fā)病程度的影響（無底缽傷根法）Tab.5 Effects of different inoculum seedling age on resistance to eggplant Verticillium wilt（root-cutting with bottomless bowl）

2.5 無底缽傷根法不同接種時(shí)間對發(fā)病的影響

兩次調(diào)查結(jié)果表明，無底缽傷根法不同浸泡時(shí)間對發(fā)病程度的影響差異不明顯（表6）。接種第15天，浸根10 min的病情指數(shù)為31.0，發(fā)病率為90.6%，浸根30 min的病情指數(shù)為33.9，發(fā)病率為87.5%；接種第25 天，各處理發(fā)病趨于穩(wěn)定，處理10～30 min 的病情指數(shù)為74.7～75.5，發(fā)病率均為100%，較長時(shí)間地浸泡沒有引起更嚴(yán)重的發(fā)病，因此采用10～30 min 的浸泡時(shí)間均可，為了提高試驗(yàn)效率，節(jié)省時(shí)間，可選擇浸泡10 min。

表6 不同接種時(shí)間對茄子黃萎病發(fā)病程度的影響（無底缽傷根法）Tab.6 Effects of different time on resistance to eggplant Verticillium wilt（root-cutting with bottomless bowl）

2.6 茄子黃萎病抗病性鑒定與評價(jià)

應(yīng)用以上建立、優(yōu)化的無底缽傷根法對本研究室現(xiàn)保存的50 份茄子種質(zhì)資源進(jìn)行了黃萎病苗期抗性鑒定試驗(yàn)（表7）。從結(jié)果中看出，茄子黃萎病接種第8 天開始發(fā)病，接種第20 天病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果顯示，“蒜芥茄”和“俄羅斯龍葵”均未發(fā)病為免疫品種（I）；“托魯巴姆”、“砧好和”和“EP 6279”病情指數(shù)24.0～29.3，為中抗品種（MR）；耐病品種（T）有13 個(gè)，病情指數(shù)37.4～48.5；中感品種（MS）19 個(gè)，病情指數(shù)52.7～68.6；感病品種（S）13 個(gè)，病情指數(shù)71.9～97.3。其中“蒜芥茄”、“俄羅斯龍葵”和“EP 6279”對黃萎病的抗病性較好，可作為潛在砧木開發(fā)材料。以上材料的抗感情況與其每年田間病圃的抗性類型基本一致。

表7 不同茄子品種和育種材料對黃萎病的抗性評價(jià)（無底缽傷根法）Tab.7 Identification of resistance type of eggplant varieties against Verticillium wilt（root-cutting with bottomless bowl）

續(xù)表Continuted tab.

續(xù)表Continuted tab.

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，采用蘸根法、灌根法等5 種方法接種黃萎病菌均能誘導(dǎo)茄苗發(fā)病，但病害顯癥及病情差異較大。蘸根法、灌根法和拌土法等是土傳病害苗期抗病性鑒定常用到的接種方法[18-19]，本試驗(yàn)采用以上幾種方法與無底缽浸根接種法進(jìn)行對比，較全面地分析評判了各個(gè)方法的利和弊。蘸根法是黃萎病接種較推薦的方法[17]，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該方法接種發(fā)病速率快，接種第8 天既顯現(xiàn)出黃萎病淡黃綠色斑點(diǎn)等癥狀，但整體病情較實(shí)際偏重，這對篩選抗源材料是有利的，但不利于耐病茄子品種的篩選與研判。灌根法在黃萎病接種試驗(yàn)中應(yīng)用也較多[9,20]，本研究發(fā)現(xiàn)以該方法接種需要緩苗較長時(shí)間，且存在發(fā)病不均勻現(xiàn)象，這應(yīng)與接種操作時(shí)傷根把控難以做到一致性有關(guān)，由此可導(dǎo)致數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性存在偏差。胡建坤等[20]在茄子黃萎病接種方法研究中也有類似結(jié)論。前人有關(guān)土壤帶菌量不均勻?qū)е聠沃臧l(fā)病不一致的報(bào)道[17]。本研究還發(fā)現(xiàn)拌土接種法的顯著弊端在于茄苗接種后初始顯癥明顯較其他方法滯后4～6 d，病情進(jìn)展緩慢，病株病級(jí)偏差，影響至接種試驗(yàn)效率及其結(jié)果評判的可靠性。注射法接種在病害顯癥和病情嚴(yán)重度上與蘸根接種和灌根接種沒有太大的區(qū)別，但此法操作困難，費(fèi)工費(fèi)力功效低，不值得推崇。

本研究無底缽傷根法的接種裝置是八連排接種缽，每排為4 個(gè)缽，一套裝置是32 個(gè)缽（可根據(jù)需要取出或挪動(dòng)其中的一排或多排），每個(gè)缽體下方開口處，將露出的須根減掉，并整盤浸泡在裝有孢子懸浮液的配套塑料盒裝置中[21]。整個(gè)過程真實(shí)地模擬了致病菌從根部傷口處侵染，保證每棵茄子苗均勻帶菌，實(shí)際發(fā)病均勻一致，很少出現(xiàn)同一處理有的植株發(fā)病嚴(yán)重，有的發(fā)病輕甚至不發(fā)病，或者重復(fù)之間發(fā)病不一致的情況。此方法與蘸根法的相似處是對植株根部進(jìn)行傷根再蘸取菌懸液，但是無底缽傷根法不需要將植株連根拔除，節(jié)省了重新種苗的步驟，并且避免了較長時(shí)間緩苗導(dǎo)致的發(fā)病不一致，存在較大發(fā)病誤差。目前，國內(nèi)外已經(jīng)利用類似的接種方法進(jìn)行了棉花、苜蓿等作物的抗黃萎病材料的篩選并應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)，并且降低了田間鑒定中由于病原菌分布不均勻和氣象因素等影響帶來的結(jié)果不確定性[5,22]。接種濃度、生育期及接種時(shí)間等是影響黃萎病抗性鑒定方法準(zhǔn)確性的重要因子[23]，為此本研究對無底缽傷根法進(jìn)行了優(yōu)化，構(gòu)建了在常溫下（17.5～27.5 ℃）以產(chǎn)孢效率較高的茄子黃萎病菌株“2015-61”為抗性鑒定使用菌株，接種菌液濃度1×105個(gè)孢子/mL，接種茄苗葉齡3～4 葉，傷根處菌液浸泡處理10 min 的無底缽傷根法茄苗期黃萎病人工接種技術(shù)體系。其優(yōu)點(diǎn)在于在于技術(shù)要領(lǐng)易于掌握，操作簡便；病害發(fā)生整齊度一致，抗性鑒定結(jié)果可靠，評判準(zhǔn)確；接種菌懸液濃度相對偏低，節(jié)省用菌量，提高功效。該項(xiàng)技術(shù)可廣泛用于黃萎病菌致病力分化、生理類型鑒定、致病機(jī)理及藥物篩選等相關(guān)試驗(yàn)研究。

圖1 部分茄子品種和育種材料對黃萎病的抗病性鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of resistance type of some eggplant varieties against Verticillium wilt

將上述優(yōu)選法接種技術(shù)運(yùn)用于茄子抗黃萎病資源的篩選，其結(jié)果與筆者多年來獲得的大田自然病圃茄子抗黃萎病的數(shù)據(jù)結(jié)果較為吻合。試驗(yàn)鑒定到“蒜芥茄”、“俄羅斯龍葵”和“EP 6279”等抗性資源種質(zhì)，可作為茄子抗黃萎病嫁接技術(shù)的砧木開發(fā)利用。

致謝：天津市寶坻區(qū)重大項(xiàng)目（201911）和天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研人員創(chuàng)新研究與實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2021004）同時(shí)對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！