張 芳，陸 涵，何永明

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省作物生理生態(tài)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

【研究意義】水稻是我國重要的糧食作物，其產(chǎn)量通常由株高、分蘗數(shù)、穗粒數(shù)及千粒質(zhì)量等農(nóng)藝性狀決定，而穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量又受控于花器官的發(fā)育。闡明水稻雄蕊發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，為培育高產(chǎn)水稻品種提供理論支持，對保證糧食安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】赤霉素（gibberellins，GAs）是一類廣泛存在于植物等生物中的四環(huán)二萜類化合物，由4 個異戊二烯單位組成，其基本結(jié)構(gòu)是赤霉素烷。GAs作為經(jīng)典5大類植物激素之一，是一種高效能的廣譜植物生長調(diào)節(jié)劑，參與調(diào)控植物的種子萌發(fā)、節(jié)間伸長、纖維發(fā)育、葉片生長、花器官發(fā)育、打破種子休眠等眾多生理過程[1-2]。目前已鑒定獲得的天然GAs多達(dá)136 種，但除GA1、GA3、GA4、GA7外的絕大多數(shù)GAs 并無生物活性，而是作為活性GAs 的前體或無活性的代謝物[3-4]。遺傳學(xué)證據(jù)表明，盡管植物中已分離鑒定出GA3，但是在許多植物中GA1和GA4是主要的活性GAs[5-7]。經(jīng)過60 多年的研究，植物體內(nèi)GAs 的生物合成途徑已經(jīng)比較清楚，主要分為3 個階段：第一階段在質(zhì)體中完成，底物牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）在內(nèi)根-古巴焦磷酸合成酶（ent-copalyl diphosphatesynthase，CPS）和內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（ent-kaurene synthase，KS）催化下環(huán)化為赤霉素的前身內(nèi)根-貝殼杉烯（ent-kaurene）。CPS是正式進(jìn)入赤霉素生物合成的早期關(guān)鍵基因，如果CPS完全突變，植物將無法產(chǎn)生任何赤霉素，種子不能萌發(fā)[8]。擬南芥中的CPS 是由單基因AtCPS/GA1編碼，AtCPS只在頂端、根尖、發(fā)育中的花藥和種子等快速生長的組織中特異性表達(dá)[9]；第二階段主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上完成，內(nèi)根-貝殼杉烯經(jīng)內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO）和內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶（ent-kaurene acid oxidase，KAO）氧化生成GA12，它是GAs 的最初產(chǎn)物；最后一階段在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中完成，GA12的C13 經(jīng)羥基化和非羥基化后生成GA53和GA12，隨后，GA53和GA12在GA20 氧化酶（GA 20-oxidase，GA20ox）和GA3氧化酶（GA 3-oxidase，GA3ox）的作用下經(jīng)過一系列的氧化步驟分別形成具有生物活性的GA4和GA1[10-11]。GA20ox 和GA3ox 催化活性GAs 生物合成的后期步驟，對活性GAs 的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。在擬南芥基因組中GA20ox和GA3ox分別存在5 個（At20ox1-At20ox5）和4 個（At3ox1-At3ox4）拷貝，在水稻基因組中分別含有4 個（OsGA20ox1-OsGA20ox4）和2 個（OsGA3ox1、OsGA3ox2）拷貝[12-14]；這些基因的突變均導(dǎo)致活性GAs合成的缺陷，引起植株矮小、開花延遲以及短雄蕊和短花瓣等現(xiàn)象[15-17]。水稻“綠色革命”基因sd1（semi-dwarf1）編碼GA20ox2，d1編碼玉米中的GA3ox2，基因缺失后，突變體呈現(xiàn)出植株矮小、雌雄同花等表型[18-19]。研究[20-21]表明，GAs失活對活性GAs濃度的有效調(diào)節(jié)及其在植物體內(nèi)的平衡是非常重要的。GAs 的代謝失活主要有兩種途徑，其一是通過EUI（elongated uppermost internode）蛋白使GA4的16,17-雙鍵環(huán)被氧化從而失去活性，水稻中由OsEUI單基因編碼EUI，該基因缺失導(dǎo)致突變體節(jié)間伸長，GA4和GA1含量增加[22-23]；另外一種是借助GA2氧化酶（GA 2-oxidase，GA2ox）將GA4和GA1分別氧化為無活性的GAs，水稻基因組中含有6 個拷貝的OsGA2ox（OsGA2ox1-OsGA2ox6）[24-25]。植物體內(nèi)活性GAs 水平通過前饋和反饋?zhàn)饔镁S持GA 穩(wěn)態(tài)，當(dāng)活性GAs 含量低時，GAs 作為信號分子促進(jìn)合成基因GA20ox和GA3ox的表達(dá)，抑制失活基因GA20ox的表達(dá)；當(dāng)植物體內(nèi)活性GAs 含量較高時，GAs 對GA 合成關(guān)鍵基因的調(diào)控則相反。如在ga1-3突變體中，GA20ox1和GA3ox1表達(dá)明顯增加，而GA2ox1的轉(zhuǎn)錄水平則下降；相反，當(dāng)外加活性GA 處理時，GA20ox1和GA3ox1的表達(dá)受抑制，但卻促進(jìn)GA2ox1的表達(dá)[26]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】水稻是開花受精植物，其穎花開放包括稃片張開、花絲伸長、花藥開裂以及稃片閉合。花誘導(dǎo)后，活性GAs 對花器官的生長發(fā)育起著非常關(guān)鍵的作用，尤其是對雄蕊、花瓣與子房?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬以粳稻中花11為試驗(yàn)材料，利用Real-time PCR 鑒定開花前2 d至穎花開放期間，雄蕊中GAs生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)模式，并測定活性GA1和GA4含量，從而解析水稻雄蕊發(fā)育晚期赤霉素的生物合成特性和探究GAs在水稻穎花開放過程的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及雄蕊樣品的采集

試驗(yàn)品種為粳稻中花11，常規(guī)管理種植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園試驗(yàn)田，抽穗期為7月上旬。通過定株定時調(diào)查，本試驗(yàn)條件下抽出1 d后的稻穗才會開花，穎花開花的高峰時間約為11:30。選擇頂部已有少量開過穎花（穎花成熟度主要根據(jù)其在穗上的著生位置和花藥長度[27]）的主穗，分別于開花前2 d、1 d、4 h（07:00—07:30）、0 h（11:00—11:30）挑取穎花，選取的穎花樣品立即放入液氮中速凍，帶回室內(nèi)后在液氮中進(jìn)一步剝?nèi)⌒廴?，將樣品保存?80 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因芯片數(shù)據(jù)分析 利用水稻基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)庫RiceXPro分析赤霉素合成和代謝過程中相關(guān)基因在水稻不同組織部位及不同生育時期的表達(dá)模式（RiceXProhttp://ricexpro.dna.affrc.go.jp/index.html）。

1.2.2 Real-time PCR 植物樣品總RNA 的提取采用Trizol試劑（北京全式金公司），DNase I（Invitrogen）去除基因組DNA 的污染后，用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real-time PCR 采用SYBRPremix Ex TaqII試劑盒（Takara）。Real-timePCR 反應(yīng)體系20μL：SYBRPremix Ex Taq10μL，正反向引物各0.4μL，cDNA模板2μL，ROX Reference Dye（50×）0.4μL，ddH2O 6.8μL。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃38 s，循環(huán)數(shù)為40。以O(shè)sGAPDH為內(nèi)參基因，目標(biāo)基因和OsGAPDH引物序列詳見表1，結(jié)果根據(jù)2-ΔCt方法計算分析。每份樣品2次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。

表1 Real-time PCR 表達(dá)分析的基因引物序列Tab.1 Primers used to amplify for real-time PCR

1.2.3 赤霉素的提取與測定 雄蕊樣品于液氮中研磨至粉末，準(zhǔn)確稱量1 g，加入10 mL提取液V（乙腈）∶V（水）∶V（乙酸）=90∶9∶1），4 ℃避光提取過夜，12 000 g 4 ℃下離心5 min，吸取上清，加入5 mL提取液再提取1次，合并2次所得上清液；用氮吹儀以N2氣經(jīng)吹干，以400μL甲醇溶解過夜，過0.22μm尼龍濾膜，保存于-20 ℃待測。采用高效液相色譜（Aglient1290）-質(zhì)譜（SCIEX-6500Qtrap）系統(tǒng)檢測GA1和GA4，色譜柱為poroshell 120 SB-C18反相色譜柱；流動相：A∶B=（甲醇/0.1%甲酸）∶（水/0.1%甲酸）；外標(biāo)法定量，每份樣品3次重復(fù)[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻赤霉素合成與代謝相關(guān)基因在不同組織器官中的表達(dá)模式

利用水稻（日本晴Nipponbare）表達(dá)譜基因芯片數(shù)據(jù)庫RiceXPro 中的數(shù)據(jù)分析赤霉素合成和代謝過程中相關(guān)基因在水稻不同時期、不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，赤霉素合成早期基因OsKS1和OsCPS1、OsKAO2分別在雌蕊和花藥里強(qiáng)烈表達(dá)；赤霉素合成后期基因OsGA20ox3和OsGA3ox1主要集中在花藥中表達(dá)，其它組織部位中表達(dá)微弱；OsGA20ox2和OsGA3ox2在莖稈和花器官中都有較強(qiáng)的表達(dá)；OsGA20ox1和誘導(dǎo)活性GAs 失活的OsGA2ox在營養(yǎng)器官和花器官各組織都有較豐富的表達(dá)；而誘導(dǎo)GA4失活的OsEUI主要集中在水稻花藥中表達(dá)。

2.2 赤霉素合成早期基因在水稻雄蕊發(fā)育中的表達(dá)特性

為進(jìn)一步鑒定赤霉素合成早期基因OsCPS1、OsKS1、OsKO和OsKAO2在水稻雄蕊發(fā)育過程中的表達(dá)情況，于穎花開放前不同時間點(diǎn)（開花前2 d、1 d、4 h和0 h）分別取樣檢測。結(jié)果（圖2）顯示，隨著開花的臨近，水稻雄蕊中OsCPS1的表達(dá)顯著性增強(qiáng)，并在開花前4 h達(dá)到最高值，同時OsKS1和OsKO也表現(xiàn)出類似的變化趨勢，而OsKAO2的表達(dá)持續(xù)下降；另外，相較開花前2 d，在穎花開放時，雄蕊中這4個基因的表達(dá)量均下降到最低值；說明水稻穎花開放事件中所需的GAs在開花前已經(jīng)完成合成的前期步驟。

圖1 水稻中赤霉素合成與代謝相關(guān)基因的表達(dá)譜分析（RiceXPro）Fig.1 Representative gene expression analyses of gibberellin synthesis and deactivation of rice（RiceXPro）

圖2 水稻雄蕊中OsCPS1、OsKS1、OsKO、OsKAO2的表達(dá)分析Fig.2 Expression analyses of OsCPS1，OsKS1，OsKO，OsKAO2 in stamens of rice plant

2.3 赤霉素合成后期基因在水稻雄蕊發(fā)育中的表達(dá)特性分析

利用Real-time PCR 鑒定OsGA20ox、OsGA2ox和OsGA3ox等基因在水稻雄蕊中的表達(dá)情況（圖3）。結(jié)果顯示，穎花開放時雄蕊中OsGA20ox2和OsGA3ox2的表達(dá)水平迅速上升，表達(dá)量相較開花前2 d 分別增加了2.1 和2.8 倍（圖3A）。而OsGA20ox1、OsGA20ox3、OsGA20ox4和OsGA3ox1的表達(dá)均隨開花的臨近逐漸下降，其中OsGA20ox3和OsGA3ox1的降幅最大，表達(dá)量分別僅為開花前2 d 的16.7%和9.6%（圖3A）。雄蕊中OsGA2ox1、OsGA2ox2、OsGA20ox4和OsEUI的表達(dá)隨著開花的臨近逐漸下降，且表達(dá)量在開花時達(dá)到最低值，而OsGA2ox3和OsGA2ox6的表達(dá)大幅度提高，增幅分別高達(dá)1.5 和20.1 倍（圖3B）。水稻穎花開放時花絲迅速伸長，并同步發(fā)生花藥的開裂，而此時雄蕊中OsGA20ox2和OsGA3ox2的表達(dá)量大幅度增加，因此，OsGA20ox2和OsGA3ox2可能在促進(jìn)雄蕊伸長過程中起著重要的作用。

2.4 水稻雄蕊中的GA4和GA1的含量分析

進(jìn)一步測定水稻雄蕊中赤霉素含量顯示，穎花開放時雄蕊中GA4的含量大幅度降低，僅為開花前1 d的16.1%，降幅高達(dá)84.88%（圖4A）；而GA1的含量在此期間卻表現(xiàn)出與GA4相反的變化，水稻開花時，雄蕊中GA1的含量是開花前1 d 的2.4 倍（圖4B）。這與前期基因表達(dá)結(jié)果一致，水稻穎花開放時，GA4合成的關(guān)鍵基因OsGA20ox3、OsGA3ox1和其負(fù)反饋調(diào)控基因OsGA2ox1、OsGA2ox2、OsGA20ox4、OsEUI的表達(dá)均較開花前大幅度下降（圖3），進(jìn)而大幅度降低了GA4的含量；相反GA1合成的關(guān)鍵基因OsGA20ox2、OsGA3ox2表達(dá)量顯著高于開花前（圖3A），從而促進(jìn)GA1的大量合成。說明在水稻雄蕊發(fā)育晚期GA1可能調(diào)控穎花開放的花絲伸長。

圖3 水稻雄蕊中OsGA20ox、OsGA3ox、OsGA2ox、OsEUI的表達(dá)分析Fig.3 Expression analyses of OsGA20ox，OsGA3ox，OsGA2ox，OsEUI in stamens of rice plant

圖4 水稻雄蕊中GA4和GA1的含量Fig.4 Concentrations of GA4and GA1 in the stamens of rice plant

3 討論

GAs 是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育不可缺少的植物激素之一，調(diào)控植物生長發(fā)育多個過程，包括種子萌發(fā)、莖和葉柄的伸長、花的誘導(dǎo)以及花器官發(fā)育等[29-30]。大量研究表明盡管GA3是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最為常用的赤霉素，但在多數(shù)植物體內(nèi)GA1和GA4具有更為廣泛的生理活性[1-2,31]，且在擬南芥和水稻中，GA4生物活性約為GA1的1 000倍[5,31]。OsGA13ox異常表達(dá)導(dǎo)致活性更高的GA4在水稻中的富集減少，形成水稻半矮化突變體[32]。水稻突變體shb由于赤霉素合成減少，表現(xiàn)出根尖分生區(qū)皮層細(xì)胞更短、更少的表型[33]。擬南芥雄蕊的正常發(fā)育要較高含量的GAs。GA-合成缺陷突變體（ga1-3，ga1-6）或GA-受體缺陷突變體（gai）的擬南芥花芽都具有典型的短花瓣與短雄蕊，花絲的細(xì)胞伸長受到抑制[14,26]。長期研究認(rèn)為在水稻中GA1是營養(yǎng)器官中的主要活性GAs，調(diào)控莖稈伸長等過程，水稻拔節(jié)時期GA1 的含量較高；GA4集中富集于花和穗子等繁育器官，調(diào)控雄蕊發(fā)育等[17,34]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著開花的臨近水稻雄蕊中OsGA20ox2和OsGA3ox2表達(dá)增強(qiáng)，且GA1含量顯著增加，而GA4含量則大幅下降，這暗示著GA1可能調(diào)控水稻穎花開放過程的花絲伸長。

植物需要產(chǎn)生和積累合適水平的活性GAs以確保正常的生長發(fā)育。GAs可以從合成位點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)至生長發(fā)育過程中需要GAs的組織或器官中?；钚訥As自身可作為信號，通過正、負(fù)反饋?zhàn)饔谜{(diào)控活性GAs生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，維持植物體內(nèi)赤霉素穩(wěn)態(tài)。大多數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明，GA 生物合成受到活性GAs 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，小麥Rht2、玉米Dwarf8 和擬南芥gai 矮化突變體體內(nèi)都含有異常高水平的活性GAs，這種高水平的活性GAs可能中斷GA信號傳導(dǎo)途徑，抑制GA的生物合成[26,35]。GA4處理擬南芥后AtGA2ox表達(dá)水平降低，說明AtGA2ox表達(dá)受到赤霉素的反饋調(diào)節(jié)，同樣的OsGA2ox在兩個赤霉素缺失型突變體的表達(dá)量高于正常植株，外源赤霉素處理則減少基因表達(dá)量[11,24,35]。本研究結(jié)果顯示水稻雄蕊發(fā)育晚期GA4含量顯著降低，而此期間GA4合成的關(guān)鍵基因OsGA20ox3、OsGA3ox1以及編碼調(diào)控活性GAs失活的相關(guān)氧化酶基因OsGA2ox1、OsGA2ox2、OsGA2ox4、OsEUI的表達(dá)量均大幅度下降；這與前人研究結(jié)果相一致，再次證明了GA4調(diào)控植物體內(nèi)活性GAs平衡的重要作用。