范曉瑜 史春麗 肖艷群 王雪亮

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）屬受體酪氨酸激酶家族，主要定位于細胞膜。EGFR 被配體激活后啟動胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因的轉(zhuǎn)錄，參與細胞遷移、黏附、增殖、凋亡等過程。EGFR 突變檢測對于接受EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治療的非小細胞肺癌患者至關(guān)重要。肺癌組織中EGFR 突變狀態(tài)目前被認為是預(yù)測TKI 治療反應(yīng)和疾病預(yù)后的金標準［1］。然而，有時卻無法采集到合格的組織樣本進行EGFR 突變檢測，如無法活檢、取樣失敗或樣本量太少等［2-3］，此時需要其它來源的標本行基因突變檢測。大量研究表明腫瘤細胞和組織死亡后，腫瘤細胞DNA可以從原發(fā)腫瘤灶和/或局部轉(zhuǎn)移部位釋放進入血液，此類DNA 稱為血液游離DNA（cell free DNA，cfDNA）［4］。cfDNA 進行基因突變檢測具有以下特點：1.操作簡便；2.可動態(tài)追蹤療效。因此利用血液中cfDNA 進行EGFR 突變檢測已成為可行的組織樣本的替代選擇［5］。

目前臨床上血液EGFR 突變檢測常用方法有擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）、高通量測序（next-generation sequencing，NGS）、數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）等，方法學(xué)眾多導(dǎo)致檢測結(jié)果間可能存在差異。同時，cfDNA 片段小［6］、半衰期短［7］、含量低［8］，檢測過程繁瑣，對操作人員技術(shù)和經(jīng)驗要求較高，每個步驟出現(xiàn)問題均可導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)問題，從而影響檢測結(jié)果的準確性。本研究制備可模擬cfDNA 的樣本，并將其作為室間質(zhì)量評價（external quality assessment，EQA）樣本開展EGFR 基因突變檢測的EQA 活動，以期發(fā)現(xiàn)實驗室檢測過程中所存在問題，達到改進和提高檢測質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 細胞

1.1.1 培養(yǎng)試劑

RPMI 1640 培養(yǎng)基（貨號：A1049101）、Ham's F-12K 培養(yǎng)基（貨號：21127022）、Leibovitz's L-15培養(yǎng)基（貨號：11415064）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS；貨 號：10099141C）和 胰 蛋 白 酶（0.25%）（貨號：25200114）購自美國Gibco 公司（規(guī)格：500 mL/瓶）。

1.1.2 細胞系種類和培養(yǎng)方法

實驗所需細胞系、攜帶突變位點、購買來源和相應(yīng)的培養(yǎng)方法，見表1。

表1 細胞和培養(yǎng)條件Table 1 Cells and culture conditions

1.2 試劑

DNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司，貨號：69506）；游離DNA 提取試劑盒（美國ThermoFisher Scientific 公司，貨號：A29319）；雙鏈DNA 高靈敏度熒光定量試劑盒（美國ThermoFisher Scientific公司，貨號：Q33231）；人類EGFR 基因突變檢測試劑盒（廈門艾德公司，貨號：ADx-EG14-LC）；Agilent2100 生物芯片分析系統(tǒng)配套試劑（美國Agilent公司）；dPCR 熒光探針（美國ThermoFisher Scientific公司）；dPCR 配套試劑（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Memmert 公司，型號：INC153）；超聲波破碎儀（美國Covaris 公司，型號：LE220）；Qubit 3.0 熒光定量儀（美國ThermoFisher Scientific 公司，型號：Q33216）；生物分析儀（美國Agilent 公司，型號：2100）；液滴數(shù)字PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號：QX200）；熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司，型號：Cobas Z480）。

1.4 質(zhì)控品制備

培養(yǎng)細胞提取基因組DNA，經(jīng)超聲波破碎儀對各細胞基因組DNA 進行打斷，參數(shù)如下：功率峰值為450 W，負載比為30%，爆發(fā)周期數(shù)為200，處理時間為240 秒。打斷后得到不同細胞來源的小片段DNA，加入血漿后抽提cfDNA，采用Qubit 3.0 熒光定量儀測定cfDNA 濃度；利用Agilent 2100 生物分析儀分析cfDNA 片段的大小分布；利用QX200 液滴數(shù)字PCR 儀分析突變頻率，使用QuantsSoft 軟件對陰性和陽性液滴數(shù)目進行統(tǒng)計后對突變頻率進行分析。制備好的樣本置于-20℃冷凍保存。

1.5 室間質(zhì)量評價

EQA 樣本盤包括一支野生型樣本及四支突變型樣本。隨機編號后將樣本盤經(jīng)冷鏈運輸至參評實驗室，要求其在規(guī)定時間內(nèi)使用其常規(guī)檢測系統(tǒng)（包括儀器、試劑和方法等）進行檢測并回報結(jié)果。按臨床實驗室EQA 要求評價其檢測能力，得分100 為成績優(yōu)秀，得分80～99 為合格，得分小于80 為不合格，室間質(zhì)評成績?yōu)榉系臉颖緮?shù)/總樣本數(shù)×100。

2 結(jié)果

2.1 樣本評估結(jié)果

將不同細胞來源的人工模擬cfDNA 片段上機檢測，經(jīng)鑒定其片段長度約160～180 bp，見圖1。將其用血漿稀釋后，經(jīng)dPCR 檢測證實其突變頻率約為0.9%，見圖2。ARMS 檢測結(jié)果顯示各制備人工模擬cfDNA 攜帶突變與預(yù)期結(jié)果一致。見圖3。

圖1 cfDNA 片段長度分布Figure 1 The size distribution of cfDNA fragment

圖2 突變頻率驗證Figure 2 Validation of mutation heterogeneity rate

圖3 室間質(zhì)量評價樣本熒光PCR 擴增曲線Figure 3 Fluorescence PCR amplification curve of external quality assessment samples

2.2 參評實驗室回報情況和室間質(zhì)量評價結(jié)果

2019 年至2021 年分別收到有效回報結(jié)果33、29 和27 份。參評實驗室最常用的方法為ARMS法（66.7%、75.9%和74.1%），其次為dPCR 法（12.1%、13.8%和14.8%）和NGS 法（21.2%、10.3%和11.1%）。按照結(jié)果評價原則，2019 年26 家實驗室（78.8%）回報結(jié)果完全正確（100 分），4 家（12.1%）成績合格（80 分），3 家（9.1%）成績不合格（＜80 分）；2020 年26 家實驗室（89.7%）回報結(jié)果完全正確（100 分），2 家（6.9%）成績合格（80 分），1 家（3.4%）成績不合格（＜80 分）；2021 年26 家實驗室（96.3%）回報結(jié)果完全正確（100 分），1 家（3.7%）成績不合格（＜80 分）。見表2。

表2 參評實驗室所用方法和檢測能力［n（%）］Table 2 Methods and performance scores of participating laboratories［n（%）］

3 次EQA 活動中，樣本整體符合率分別為92.7%、97.2%、98.5%。野生型樣本未見上報假陽性結(jié)果；突變型樣本上報結(jié)果均出現(xiàn)假陰性情況。其中1912 號樣本復(fù)合突變（p.T790M+p.L858R）符合率最低，為81.8%，部分實驗室僅檢出其中一種突變類型，存在漏檢情況。見表3。野生型樣本和突變型樣本的符合率分別為100%（89/89）和94.9%（338/356）。見表4。

表3 EGFR 基因突變檢測樣本盤組成和室間質(zhì)量評價結(jié)果［n（%）］Table 3 Sample panels of EGFR gene mutation detection and results of external quality assessment［n（%）］

表4 野生型樣本和突變型樣本的符合率Table 4 Conformity rate of wild type sample and mutant type sample

3 討論

EGFR 基因突變的準確檢測對于靶向藥物的選擇及預(yù)后判斷至關(guān)重要。在無法獲得合格腫瘤組織樣本或需動態(tài)監(jiān)測療效時，血液中cfDNA 可作為組織樣本的替代選擇。然而血液cfDNA 存在以下特殊性質(zhì)：①片段較短，約166 bp［6］；②半衰期快，約為16 分鐘～2 小時［7］；③含量較低，血液中cfDNA 濃度約為1 000 ng/mL，平均180 ng/mL［8］。由于上述特性，進行cfDNA 檢測時易出現(xiàn)抽提失敗等原因?qū)е碌募訇幮越Y(jié)果。此外，由于檢測方法學(xué)的高敏感性，易造成污染而出現(xiàn)假陽性情況。為保證檢測質(zhì)量，需要采取有效的質(zhì)量保證措施，如利用合適的cfDNA 質(zhì)控品監(jiān)控檢測全過程。

cfDNA 質(zhì)控品制備過程中一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)是對基因組進行剪切以獲得片段化DNA，目前主流方法包括超聲法和酶切法［9-10］。已有研究利用超聲打斷基因組DNA 獲取cfDNA 樣本，用于無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測EQA 活動中，結(jié)果證實其作為EQA 樣本有較好的適用性［10］。本研究通過超聲法制備人工模擬cfDNA，鑒定顯示cfDNA 片段長度約160～180 bp，加入血漿后檢測突變頻率約為0.9%，這表明通過超聲法制備的cfDNA 質(zhì)控品可較大程度接近真實血液cfDNA 片段分布，從而較好模擬臨床樣本。

本中心于2019 年至2021 年利用制備的質(zhì)控品組織實施血液EGFR 基因突變檢測EQA 活動。三次結(jié)果顯示，成績優(yōu)秀實驗室分別為78.8%（26/33），89.7%（26/29），96.3%（26/27），表明參評實驗室血液EGFR 基因突變檢測能力整體較好且逐年提高。三次EQA 回報結(jié)果中，符合率最低樣本為1912 號復(fù)合突變（p.T790M+p.L858R）（81.82%）和1913 號p.L861Q 突變（87.88%），其中分別有83.33%（5/6）和100%（3/3）的結(jié)果為假陰性。分析導(dǎo)致樣本不符合原因如下：①cfDNA 含量較低且高度片段化，不同提取試劑結(jié)合效率差別可能較大［11］；②假陰性結(jié)果可能由于EQA 樣本突變頻率較低，檢測人員操作誤差造成，如cfDNA 抽提得率低等；假陽性結(jié)果可能因為操作過程中交叉污染所致。③假陰性結(jié)果中有87.5%（7/8）是由實驗室自建方法回報，未進行充分的方法學(xué)確認也可能是上述情況發(fā)生的重要因素之一。因此，為提高檢測質(zhì)量，實驗室可從以下幾個方面進行改進：①選擇合適的提取試劑，并充分評估cfDNA 抽提效率；②進一步加強人員培訓(xùn)，以減少人員操作失誤，也可通過使用全自動核酸提取儀以避免操作誤差；③對于實驗室自建方法，應(yīng)進行充分的性能確認后再投入后續(xù)使用。

綜上所述，利用細胞系制備的血液EGFR 基因突變樣本可充分模擬臨床樣本，達到監(jiān)控檢測全過程的目的。EQA 結(jié)果表明大部分實驗室EGFR基因突變檢測能力良好，但部分實驗室檢測能力尚需提高。血液EGFR 基因突變EQA 可改進和提高臨床實驗室檢測的整體質(zhì)量，為臨床合理靶向用藥提供有效指導(dǎo)。