李文慧，張立華，鐘繼亮，邵幫濤，李迎梅，黃鵬飛，李興國，韓德果

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

植物在生長發(fā)育過程中需要鐵、錳、銅和鋅等必需微量元素，這些元素對植物正常生長發(fā)育至關(guān)重要[1]。鐵元素在土壤中（特別是堿性土壤pH 7.4～8.4）溶解度較差（不足10 mol·L-1），因此缺鐵是北方果樹生長發(fā)育過程中常見現(xiàn)象。輕度缺鐵導(dǎo)致葉綠素合成減少，光合速率降低，新葉褪綠；嚴(yán)重缺鐵時(shí)，鐵與氧發(fā)生還原反應(yīng)，氧自由基增加（ROS）損傷生物合成，導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度降低[2]。

為避免上述一系列缺鐵問題發(fā)生，植物在進(jìn)化過程中形成兩種從土壤中吸收鐵的作用機(jī)理（機(jī)理Ⅰ和機(jī)理Ⅱ）[3]。在缺鐵情況下，機(jī)理Ⅰ是所有非禾本科植物吸收鐵元素的有效途徑，這類植物產(chǎn)生更多鐵還原酶，將鐵（Ⅲ）還原成鐵（Ⅱ），從而有利于植物吸收鐵。Abadía等研究發(fā)現(xiàn)，缺鐵引起檸檬酸鹽等羧酸鹽增加[4]，在番茄和尤力克檸檬中發(fā)現(xiàn)缺鐵引起檸檬酸合成酶CS（Citrate synthetase）活性增加[5-6]。另外，擬南芥突變體FRD3證明檸檬酸（Citric acid）在鐵長距離運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)RD3可裝載鐵螯合劑（檸檬酸鹽），將植物體內(nèi)鐵運(yùn)輸?shù)侥举|(zhì)部中[7]。

小金海棠是一種鐵高效蘋果屬型，以往研究中已克隆得到與小金海棠有關(guān)的一些微量元素高耐受性基因[8]，證實(shí)這些基因在小金海棠中表達(dá)受鐵脅迫影響。劉麗麗等發(fā)現(xiàn)MxYSL7可能與小金海棠中鐵在木質(zhì)部和韌皮部運(yùn)輸有關(guān)[9]。韓德果等研究克隆得到MxCS1、MxCS2和MxCS3等檸檬酸合成酶家族基因，證實(shí)MxCS1、MxCS2和MxCS3這3種基因表達(dá)受鐵脅迫和植物激素（IAA和ABA）影響[10]。MxCS1、MxCS2和MxCS3基因過表達(dá)擬南芥可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鐵脅迫的耐受性[11-12]。植物激素如ABA、IAA作為感知鐵脅迫的信號分子在植物鐵脅迫中參與反應(yīng)，小金海棠幼苗中Mx-CS1、MxCS2和MxCS3表達(dá)量均受ABA和IAA處理影響，處理后這些激素在小金海棠各部分表達(dá)量均增加。缺鐵脅迫使小金海棠莖尖IAA含量上升，經(jīng)IAA處理后莖尖也誘發(fā)植物體缺鐵反應(yīng)[13]。

前期研究已明確小金海棠檸檬酸合成酶中發(fā)揮關(guān)鍵作用的MxCS1，MxCS2和MxCS3基因功能[14]。然而，這個(gè)基因家族其他成員是否也具有相似功能尚不清楚。因此，發(fā)掘小金海棠檸檬酸合成酶基因家族中新基因，研究該基因在小金海棠不同部位表達(dá)水平及該基因表達(dá)與鐵脅迫、ABA和IAA處理之間關(guān)系，并進(jìn)一步過表達(dá)該基因，確定其對轉(zhuǎn)基因擬南芥根、莖、葉中鐵、錳、銅和鋅元素含量、檸檬酸合成酶活性、檸檬酸和葉綠素含量等的影響，將為提高植株鐵脅迫耐受性和培育耐缺鐵的蘋果砧木提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）種子來自擬南芥資源中心（https://abrc.osu.edu/，俄亥俄州立大學(xué)，哥倫布，美國），小金海棠（Malus xiaojinensisCheng et Jiang）組培苗為實(shí)驗(yàn)室保存（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱，中國）。擬南芥選用Col-0，播種在MS培養(yǎng)基上和營養(yǎng)缽中（草炭∶蛭石=3∶1），在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，14 h光照，10 h黑暗，生長溫度白天22℃，夜間20℃。待長至四周時(shí)進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。在生長培養(yǎng)基（MS+0.3 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA）中培養(yǎng)小金海棠組培苗45 d，將其轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基（MS+1.2 mg·L-1IBA）中培養(yǎng)50 d至生根。再將幼苗轉(zhuǎn)移至Hoagland溶液中培養(yǎng)，直到植株長出8～9片成熟葉片。鐵脅迫處理：鐵脅迫處理濃度參考文獻(xiàn)[14-16]，將小金海棠幼苗浸泡于不同鐵濃度（4、40和160 μmol·L-1）的Hoagland營養(yǎng)液中。ABA和IAA處理：將幼苗分別放入鐵濃度正常的0.1 mmol·L-1ABA溶液中和0.1 mmol·L-1IAA溶液中。在處理0、3、6、9和12 h后，取對照植株以及處理植株根、木質(zhì)部、韌皮部、新葉和成熟葉，將樣品迅速放入液氮中冷凍處理，儲存于-80℃冰箱中用于提取RNA。

1.2 MxCS4基因全長獲取

根據(jù)Li等操作方法，從不同部位（根、木質(zhì)部、韌皮部、新葉、成熟葉）提取RNA[17]。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄操作說明書合成出第一條cDNA鏈，將合成好的cDNA鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得MxCS4基因完整序列。依照MdCS4（MDP0000680864）同源區(qū)域設(shè)計(jì)引物（F1：5'ATGGTGTTCTTCAGGAGCGTCACAG 3'和R1：5'TCAAGACGAAGCTGCTTTCT TGCA 3'），利用設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增出全長序列。采用PCR擴(kuò)增方法以F1和R1為引物從小金海棠中克隆得到MxCS4基因cDNA全長。將獲得的DNA片段凝膠純化，再連接至pMD18-T載體上，然后送出測序。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

根據(jù)SYBR Premix ExTaqTMⅡ說明書進(jìn)行Mx-CS4基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，反應(yīng)體系以及運(yùn)行條件參照前期研究。以蘋果屬ApActin基因作為內(nèi)參并設(shè)計(jì)引物（ApActF1：5'CTACAAAGTCATCGTCCAGACAT 3'和ApActR1：5'TGGGATGACATGGAGAAGATT 3'）。

利用設(shè)計(jì)好的定量引物（MF：5'GAATGAGAGGAATGACAGGGTTGCTG 3'和MR：5'CTGGAGG GCCATGACACCAGTG 3'）對不同處理（4、40和160 μmol·L-1鐵）、不同處理時(shí)間（0、3、6、9、12 h）下小金海棠不同部位（根、木質(zhì)部、韌皮部、成熟葉、新葉）中MxCS4基因表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。使用2-ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)[18]。

1.4 MxCS4蛋白亞細(xì)胞定位

利用PCR擴(kuò)增方法，在MxCS4基因開放閱讀框序列兩端加上HindIII和BamH I雙酶切位點(diǎn)，隨后將該序列插入pSAT6-GFP-N1載體中。隨后參照韓德果等研究方法[16]，利用基因槍法將質(zhì)粒導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞，利用激光共聚焦顯微鏡觀察定位結(jié)果。

1.5 擬南芥轉(zhuǎn)化與鑒定

構(gòu)建用于擬南芥轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體，通過PCR擴(kuò)增在MxCS4基因5'和3'末端加上SacI和XbaI兩個(gè)限制酶切位點(diǎn)，將PCR得到的目的片段連接至克隆pMD18-T載體上。測序結(jié)果無誤后對連有MxCS4基因序列的pBI121和T載體進(jìn)行雙酶切，然后膠回收并用T4連接酶進(jìn)行載體連接，構(gòu)建pBI121-MxCS4載體，最后將pBI121-MxCS4載體轉(zhuǎn)入菌株為GV3101農(nóng)桿菌中。

花序浸漬法將MxCS4基因轉(zhuǎn)入擬南芥中[19]，培養(yǎng)3～4周，待種子成熟后，收取T1代種子，干燥器中存放2周。再經(jīng)含有50 μg·mL-1卡那霉素的MS篩選培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)基因擬南芥種子作初步篩選。經(jīng)培養(yǎng)和篩選得到純合體T3代植株，用于進(jìn)一步分析。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥鐵脅迫耐性分析

分別從T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（OE-5和OE-6）和野生型擬南芥株系中篩選出60株生長狀況相符幼苗，每組20株，轉(zhuǎn)移至鐵濃度分別為4、100和400 μmol·L-1的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，12 d后觀察各株系表現(xiàn)型。

1.7 葉綠素含量、檸檬酸含量和檸檬酸合成酶活性測定

根據(jù)關(guān)錦毅等試驗(yàn)方法[20]，分別測定T3代純合體轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（OE-5和OE-6）和野生型擬南芥（WT）葉片中葉綠素含量。利用高效液相色譜法測定檸檬酸含量[21]，然后再分別測定轉(zhuǎn)基因擬南芥株系以及野生型擬南芥株系葉片CS活性[22]。

1.8 鐵、錳、銅和鋅濃度測定

據(jù)韓德果等試驗(yàn)方法，分別稱取野生型和T3代純合體轉(zhuǎn)基因株系（OE-5和OE-6）擬南芥100～200 mg根、莖、葉和整株，而后將樣品放到裝有2 mL硝酸的密封聚四氟乙烯容器中。將容器加熱到150℃，加熱90 min，隨后保持150℃恒溫放置6 h。待容器冷卻至室溫后，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（SPS1200 VR;Seiko，Tokyo，Japan）測定金屬元素濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 小金海棠MxCS4基因克隆與序列分析

序列分析結(jié)果顯示，MxCS4基因全長為1 218 bp，這個(gè)基因編碼出一個(gè)含有405個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，ExPASy軟件預(yù)測結(jié)果顯示，編碼蛋白分子質(zhì)量為44.9 ku，等電點(diǎn)為6.15，且MxCS4蛋白含有一個(gè)具有植物特異性的高度保守氨基酸序列LERPKSVT（即LERP-box），LERP-box被視為植物檸檬酸合成酶的標(biāo)識[23]。

為研究植物CS蛋白間進(jìn)化關(guān)系，利用DNAman軟件分析來自不同物種的9個(gè)CS蛋白（見圖1）。如圖1 A所示，MxCS4氨基酸序列在C端包含有一個(gè)保守檸檬酸合成酶結(jié)構(gòu)域。所有9個(gè)CS蛋白結(jié)構(gòu)域中均含有CS植物特異性LERP-box序列。此外，對來自于9種植物的CS蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（見圖1B），結(jié)果顯示MxCS4、MdCS4（蘋果Malus domesticaM.，MDP0000680864）、PbCS4（白梨Pyrus bretschneideriR.,XP_009365050）和Mx-CS1（小金海棠Malus xiaojinensisC.，ADL62695.1）同源性較強(qiáng)，聚為第一組。PpCS（桃Prunus persicaL.，AAL11504）、PsCS1（山杏Prunus sibiricaL.，AIU64849）和CsCS（橙Citrus sinensisL.，KDO46047）被分到第2組。AtCS4（擬南芥A.thalianaL.，AAM62868.1）和DcCS3（胡蘿卜Daucus carotavar.sativaH.，AB017159.1）為第3組。

圖1 MxCS4蛋白與其他CS蛋白序列比對（A）和系統(tǒng)發(fā)育樹（B）Fig.1 Mutiple alignment(A)and phylogenetic tree(B)of MxCS4 protein and other CS proteins

2.2 MxCS4基因在蘋果屬小金海棠植株中的表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究小金海棠中各組織MxCS4基因在不同處理?xiàng)l件下表達(dá)情況。在正常鐵濃度（40 μmol·L-1）處理下，MxCS4在根、葉和韌皮部中表達(dá)量較高，在木質(zhì)部中表達(dá)量最低（見圖2A）。在低鐵（4 μmol·L-1）脅迫處理下，MxCS4在新葉和根中表達(dá)量增加，9 h時(shí)達(dá)到最高，之后表達(dá)量持續(xù)降低，在成熟葉中表達(dá)量隨時(shí)間逐漸降低，在12 h時(shí)降到最低。IAA和ABA處理時(shí)，MxCS4在新葉和根中表達(dá)情況與低鐵脅迫處理時(shí)一致，均在9 h時(shí)達(dá)到最高。然而，在高鐵（160 μmol·L-1）脅迫處理下，MxCS4在新葉和根中表達(dá)量隨時(shí)間增加均呈下降趨勢，在成熟葉中呈先升后降趨勢，在9 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。在IAA和ABA處理下，MxCS4在成熟葉中表達(dá)情況與其他各部位表達(dá)情況相同（見圖2C）。

圖2 小金海棠MxCS4在不同組織以及不同處理下表達(dá)模式Fig.2 Expression pattern of MxCS4 in different organs and different treatments in Malus xiaojinensis

2.3 MxCS4亞細(xì)胞定位情況

為進(jìn)一步研究MxCS4基因功能，構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體，采用基因槍法進(jìn)行洋蔥表皮亞細(xì)胞定位研究。結(jié)果表明，在洋蔥細(xì)胞中MxCS4蛋白僅定位在細(xì)胞膜上（見圖3），初步判斷MxCS4基因表達(dá)的蛋白定位在細(xì)胞膜上。

圖3 MxCS4亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of MxCS4

2.4 MxCS4基因過表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鐵脅迫的耐受性

為探究植物中MxCS4基因在鐵脅迫中發(fā)揮的作用，構(gòu)建pBI121-MxCS4載體并利用農(nóng)桿菌導(dǎo)入擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。以野生型擬南芥作為對照，從轉(zhuǎn)基因擬南芥中挑選出12個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行RT-PCR分析，分析結(jié)果表明其中6個(gè)株系（OE-2、OE-3、OE-5、OE-6、OE-7、OE-9）表現(xiàn)為陽性（見圖4A）。

從表型上看，在正常鐵濃度（100 μmol·L-1）處理下，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥無明顯差異（見圖4B），各株系擬南芥均生長較良好。但在低鐵（4 μmol·L-1）脅迫處理下，野生型擬南芥表現(xiàn)出明顯萎縮及黃化，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（OE-5和OE-6）并無明顯萎黃現(xiàn)象。在高鐵（400 μmol·L-1）脅迫處理下，野生型擬南芥生長發(fā)育情況也較轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（OE-5和OE-6）差。

高鐵和低鐵脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥（OE-5和OE-6）中葉綠素含量與野生型擬南芥相比顯著升高（見圖4C），OE-5、OE-6檸檬酸合成酶活力與WT相比極顯著升高，低鐵脅迫下增長量高于高鐵脅迫（見圖4D），所有擬南芥檸檬酸含量呈現(xiàn)趨勢與檸檬酸合成酶活力一致，但轉(zhuǎn)基因擬南芥（OE-5和OE-6）檸檬酸含量極顯著升高（見圖4E）。

圖4 MxCS4超表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鐵脅迫能力、葉綠素和檸檬酸含量、檸檬酸合成酶活性Fig.4 Overexpression of MxCS4 in transgenic A.thaliana contributed to improved Fe stress tolerance,and increased citrate synthase activity,chlorophyll and citric acid content

2.5 過表達(dá)MxCS4基因提高轉(zhuǎn)基因植株中鐵、鋅、銅、錳元素含量

對野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥（OE-5和OE-6）根、莖、葉和整株金屬元素含量比較可得出，在葉（見圖5A）、莖（見圖5B）、整株（見圖5C）、根（見圖5D）中鐵、銅、鋅和錳4種元素含量均顯著高于野生型擬南芥（WT）。轉(zhuǎn)基因植株各部位銅元素含量也均高于野生型植株，但僅在根中達(dá)到顯著差異。以上結(jié)果表明，MxCS4基因過表達(dá)提高檸檬酸合成酶含量，最終在轉(zhuǎn)基因植株中形成更多檸檬酸，提高植株對金屬元素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)金屬離子，特別是鐵、鋅、錳和銅轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖5 超表達(dá)MxCS4提高轉(zhuǎn)基因植株中鐵、銅、鋅、錳含量Fig.5 Overexpression of MxCS4 increased the contents of Fe,Cu,Zn,Mn in transgenic A.thaliana

3 討論與結(jié)論

序列比對分析結(jié)果表明，MxCS4是CS家族成員，首次被克隆驗(yàn)證，與MdCS4、PbCS4、MxCS1、PpCS、PsCS1、CsCS、AtCS4、DcCS之間有較強(qiáng)同源性（見圖1）。所有CS家族在C端包含一個(gè)保守CS結(jié)構(gòu)域[24]。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，CS家族基因具有高度保守進(jìn)化過程，CS家族基因普遍分布于蘋果、桃、杏、橙、胡蘿卜和擬南芥中，且參與包括金屬轉(zhuǎn)運(yùn)在內(nèi)的多種過程。

MxCS4基因在韌皮部中表達(dá)量略低于葉和根，MxCS4在木質(zhì)部中表達(dá)量最低（見圖2A）。這種表達(dá)現(xiàn)象顯示，MxCS4在活躍部位中發(fā)揮重要作用，與MxCS1、MxCS2和MxCS3表達(dá)情況一致。鐵脅迫時(shí)，新葉、根、成熟葉中MxCS4表達(dá)均受到顯著影響。鐵脅迫處理3、6、9 h后，新葉（見圖2B）和根（見圖2D）中MxCS4表達(dá)量均有所增加，12 h后時(shí)表達(dá)量下降。12 h時(shí)MxCS4表達(dá)水平有所下降，可能是此時(shí)已有較大量CA積累。在低鐵脅迫處理下，小金海棠新葉和根MxCS4表達(dá)上調(diào)，加速CS和CA合成。在高鐵脅迫處理下，Mx-CS4在小金海棠新葉和根表達(dá)下調(diào)，減少CS和CA合成，從而減弱植株從環(huán)境中吸收鐵的能力，這與之前報(bào)道結(jié)果一致[25]。在成熟葉中MxCS4表達(dá)模式與新葉和根呈相反趨勢（見圖2C），鐵脅迫處理時(shí)下調(diào)，高鐵脅迫處理時(shí)上調(diào)。植物在低鐵環(huán)境下，優(yōu)先向新葉和根等活性部位提供鐵，這些部位中MxCS4表達(dá)上調(diào)，而成熟葉表達(dá)下調(diào)。

IAA、ABA處理時(shí)，MxCS4在小金海棠中表達(dá)均受到顯著影響，MxCS4可能在調(diào)控小金海棠鐵脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用。IAA和ABA影響滲透物質(zhì)、葉綠素含量積累，增強(qiáng)抗氧化酶活性，被認(rèn)為是植物中鐵脅迫的信號物質(zhì)[26]，缺鐵誘導(dǎo)小金海棠莖尖IAA含量升高，而IAA含量上升引起莖尖缺鐵反應(yīng)。IAA和ABA處理均影響MxCS4表達(dá)，因而推測MxCS4可能影響鐵元素轉(zhuǎn)運(yùn)。而MxCS1、MxCS2和MxCS3表達(dá)水平受IAA影響較大，受ABA影響較小。

亞細(xì)胞定位研究證實(shí)MxCS4蛋白僅定位在細(xì)胞膜上（見圖3）。Slabas等研究表明，檸檬酸合成酶蛋白預(yù)期定位結(jié)果是線粒體、過氧化物酶體和乙醛酸循環(huán)體[27]。猜測MxCS4蛋白具有某些影響其定位結(jié)果的未知區(qū)域，具體原因需進(jìn)一步研究。

MxCS4基因有可能通過調(diào)節(jié)檸檬酸合成，幫助植物在鐵脅迫下生存。MxCS4過表達(dá)擬南芥中檸檬酸合成酶活性和檸檬酸含量均較高（見圖4），有利于低鐵環(huán)境中鐵吸收。當(dāng)植物處于高鐵脅迫作用下，高活性檸檬酸合成酶有助于合成檸檬酸，螯合多余鐵以減輕毒害，此為MxCS4過表達(dá)提高擬南芥對高鐵脅迫耐受性的原因。鐵是葉綠體必需成分，所以高濃度檸檬酸誘導(dǎo)高濃度鐵，導(dǎo)致MxCS4過表達(dá)的擬南芥中葉綠素含量相對較高，促進(jìn)鐵、錳、銅和鋅含量增加（見圖5）。

綜上所述，本研究結(jié)果與之前小金海棠檸檬酸合成酶家族基因MxCS1、MxCS2和MxCS3研究結(jié)果一致。在低鐵（4 μmol·L-1）脅迫處理下，Mx-CS4基因表達(dá)量變化較快，在9 h達(dá)到峰值，幅度較高（5.2倍），與MxCS1基因（24 h達(dá)到峰值，幅度4.1倍）、MxCS2基因（12 h，4.6倍）、MxCS3基因（10 h，4.3倍）相比，達(dá)到最大值時(shí)間較快，提升幅度較大。亞細(xì)胞定位顯示該基因定位在細(xì)胞膜上，與MxCS2一致。MxCS4過表達(dá)擬南芥中檸檬酸含量（215 mg·g-1FW）和鐵元素含量（128 μg·g-1FW）也高于MxCS1過表達(dá)擬南芥（137 mg·g-1FW和95 μg·g-1FW）、MxCS2過表達(dá)擬南芥（156 mg·g-1FW和105 μg·g-1FW）和MxCS3過表達(dá)擬南芥（196 mg·g-1FW和115 μg·g-1FW）。因此MxCS4比Mx-CS1、MxCS2和MxCS3更可能是MxCS基因家族關(guān)鍵基因。轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證實(shí)MxCS4過表達(dá)提高擬南芥對鐵脅迫的耐受性，該研究將有利于培育耐缺鐵的蘋果砧木。對MxCS4和MxCS家族成員其他功能還有待進(jìn)一步研究。