伍單丹，孫迪，汪銘書，程安春，毛賽*

（1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院禽病防治研究中心，成都 611130；2.四川農業(yè)大學預防獸醫(yī)研究所，成都 611130；3.四川農業(yè)大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130）

NLRP3炎癥小體（Inflammasome）是一種胞漿內多蛋白復合體，是固有免疫系統(tǒng)重要組成，可識別多種病原相關分子模式（PAMPs）以及損傷相關分子模式（DAMPs），如外源性ATP、造孔毒素、細菌、病毒等，在機體天然免疫防御病原感染中發(fā)揮重要作用[1-3]。近年來，鴨腸炎、鴨肝炎、禽流感等病毒病及大腸桿菌病、沙門氏菌病、鴨疫等細菌病時有發(fā)生，嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展。NLRP3炎癥小體是炎癥反應核心，在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用，也是多種疾病治療潛在靶點。研究表明NLRP3炎癥小體可被口蹄疫病毒（FMDV）[4]、腸病毒71（EV71）[5]、新城疫病毒（NDV）[6]、腦心肌炎病毒（EMCV）[7]等多種病毒激活，引發(fā)機體炎癥反應。但關于鴨NLRP3炎癥小體研究較少，制約鴨NLRP3炎癥小體在鴨傳染性疾病中作用及機制研究，導致對水禽疾病發(fā)生機制研究及有效防治策略開發(fā)緩慢。本研究對鴨NLRP3基因克隆，通過生物信息學方法分析其氨基酸序列、蛋白質特征結構及遺傳多樣性，構建真核表達載體，為鴨NLRP3炎癥小體功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞和抗體

真核表達載體pCAGGS為四川農業(yè)大學預防獸醫(yī)研究所實驗室保存。鴨胚成纖維細胞（DEF）為每次新鮮培養(yǎng)。ProteinFind?Anti-DYKDDDDK（Flag）Mouse Monoclonal Antibody（HT201-01）購自北京全式金生物技術有限公司；HRP標記山羊抗鼠IgG（M21001L）購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；Alexa Fluor?488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（33206ES60）購自羿圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus（9108）、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase（R045A）、PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（6210A）、限制性內切酶EcoRⅠ（1611）、限制性內切酶BglⅡ（1606）、DL10000 DNA Marker（3584Q）均購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；DL5000 DNA Marker（MD102-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Endo-free Plasmid Mini KitⅡ、Plasmid Mini KitⅠ購自Omega；通用型DNA純化回收試劑盒（DP219）購自天根生化科技（北京）有限公司；TransIntro?EL Transfection Reagent（FT201-01）購自北京全式金生物技術股份有限公司；DAPI（C0060）購自北京索萊寶科技有限公司；ECL顯色液（P0018FS）購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 引物設計與PCR擴增

根據(jù)NCBI鴨NLRP3基因組序列（Gene ID:101795933），利用SnapGene 2.3.2設計真核表達特異性擴增引物，送華大基因股份有限公司合成。引物序列見表1。參照RNAiso Plus（9108）說明書，從DEF細胞中提取總RNA，NanoDrop檢測核酸濃度和純度后，嚴格按照PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（6210A）說明書合成cDNA。以cDNA為模板，PCR擴增目的基因。PCR擴增體系為：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 5 μL，上游引物F 0.2 μL，下游引物R 0.2 μL，cDNA模板0.2 μL，ddH2O補足至10 μL。反應程序：預變性98℃3 min；98℃10 s，57℃5 s，72℃30 s，30個 循 環(huán)；72℃延伸7 min。

表1 引物設計Table 1 Primer design

1.4 載體構建及測序

PCR產物經10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測分離，切膠純化回收目的基因片段。同時將pCAGGS載體用限制性內切酶EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切，回收酶切產物。將線性化載體與目的基因片段進行同源重組后，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素（Amp+）的LB固體平板，置于37℃培養(yǎng)箱過夜后挑選單菌落，進行菌落PCR鑒定。將鑒定正確的單菌落接種于Amp+LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)后，用質粒提取試劑盒提取質粒，對質粒進行雙酶切鑒定并送華大基因股份有限公司測序，將測序正確的質粒命名為pCAGGS-duNLRP3-Flag，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 生物信息學分析

應用NCBI數(shù)據(jù)庫ORF Finder程序搜尋開放閱讀框并推導氨基酸序列，BLAST比對分析基因相似性，SMART分析duNLRP3蛋白結構域；通過DNAMAN將測序結果與NCBI現(xiàn)有鴨NLPR3基因比對；應用DNAStar軟件將測序結果與其他物種NLRP3基因序列比對同源序列，通過軟件Mega X構建系統(tǒng)進化樹；應用ProtParam、ProtScale、SWISS-MODEL等在線軟件預測分析蛋白理化性質、蛋白結構、細胞內定位等。

1.6 細胞培養(yǎng)與轉染

參照文獻原代DEF細胞分離培養(yǎng)方法分離、培養(yǎng)DEF細胞[8]。取10日齡鴨胚胚體，剔除頭、四肢和內臟，用無菌PBS清洗后，將胚體剪碎成勻漿狀，然后加入0.25%胰酶置于37℃水浴鍋消化5 min，經4℃4 500 r·min-1離心5 min，棄上清。用DMEM重懸、過濾沉淀，將濾液與含10%NBS的DMEM混合后接種于細胞培養(yǎng)板，置37℃、50 mL·L-1CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞匯合度達70%～80%時，將重組質粒pCAGGS-duNLRP3-Flag轉染細胞。繼續(xù)培養(yǎng)細胞，進行后續(xù)試驗。

1.7 間接免疫熒光

將DEF細胞接種于含細胞爬片的12孔細胞培養(yǎng)板，待細胞匯合度達70%～80%時，將pCAGGSduNLRP3-Flag轉染細胞，收不同時間點NLRP3樣，觀察pCAGGS-NLRP3-Flag表達時間。另外，在NLRP3蛋白表達之后，接毒1 000 TCID50，通過觀察NLRP3熒光變化驗證其生物學活性。具體操作方法：細胞爬片收樣后經4 mL·L-1多聚甲醛固定、0.25%的Triton X-100透化處理后，5% BSA 37℃封閉1 h；加入一抗Anti-DYKDDDDK Mouse Monoclonal Antibody（1∶500），4℃孵育過夜；PBST洗滌后，加入Alexa Fluor?488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（1∶400），37℃孵育1 h；PBST再次洗滌后，加入DAPI（1∶1 000）染核，37℃孵育10 min；用含50%甘油封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.8 Western blot

將DEF細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞匯合度達70%～80%時，將pCAGGS-duNLRP3-Flag轉染細胞。轉染48 h后，加入細胞裂解液，充分裂解后離心，收集上清，經SDS蛋白凝膠中電泳分離目標蛋白。采用半濕轉方式作蛋白轉膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜；TBST洗滌后，加入一抗Anti-DYKDDDDK Mouse Monoclonal Antibody（1∶5 000），4℃孵育過夜；TBST再次洗滌后，加入HRP標記山羊抗鼠IgG（1∶3 000），室溫孵育1.5 h；TBST清洗后，ECL顯色1 min，并采集成像。

2 結果與分析

2.1 NLRP3基因克隆

PCR擴增的NLRP3片段經10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測，經測序長度為2 901 bp，如圖1所示，可在電泳圖看到靠近3 000 bp位置有一條與目的片段長度相應的明亮條帶，與預期長度相符。

圖1 PCR擴增鴨NLRP3基因Fig.1 Amplification of duck NLRP3 gene by PCR

2.2 真核重組表達載體構建

將回收目的基因片段與pCAGGS載體同源重組連接，獲得pCAGGS-duNLRP3-Flag重組質粒。用限制性內切酶EcoRⅠ和BglⅡ進行雙酶切后，獲得1 159、1 700和4 698 bp 3個片段，如圖2所示。NLRP3序列中有一個BglⅡ酶切位點，因此，雙酶切獲得3個片段，與預期結果一致。經分析，確定其中含鴨NLRP3基因編碼區(qū)序列全長2 805 bp（去除殘留酶切位點、Flag標簽和NLRP3非編碼區(qū)）。

圖2 重組質粒pCAGGS-duNLRP3-Flag的Eco R I和Bgl II雙酶切鑒定Fig.2 Double digestion of recombinant plasmid pCAGGS-duNLRP3-Flag by Eco R I and Bgl II

2.3 生物信息學分析

2.3.1 基因序列分析

將陽性重組質粒分析測序，成功獲得duNLRP3基因編碼區(qū)系列。應用NCBI的ORF Finder程序進行分析，結果顯示，duNLRP3基因編碼區(qū)全長2 805 bp，可編碼934個氨基酸。通過DNAMAN將測序結果與已報道鴨NLRP3基因序列比對發(fā)現(xiàn)，與NCBI登 錄 號 為MH373356.1、XM_005029957和XM_005029959基因序列相似性為100%，與XM_005029958基因序列相似性為90.16%，如圖3所示。通過SMART程序預測結構域，結果顯示，duNLRP3蛋白有NLRP3蛋白典型的結構域，分別是位于N端第7～90位氨基酸的PYRIN結構域，位于第177～345位氨基酸的NACHT結構域，以及C端的6個LRR結構域，分別位于680～707、708～735、734～764、765～793、79～822和823～849位氨基酸，如圖4所示。

圖3 duNLRP3與NCBI上提交的鴨NLRP3基因序列相似性分析Fig.3 Similarity analysis of NLRP3 gene sequences between the sequenced result and the sequences submitted on NCBI

圖4 duNLRP3蛋白結構域預測Fig.4 Prediction of the protein domains of duNLRP3

2.3.2 相似性分析及進化樹構建

應用DNAstar軟件分析基因相似性，結果顯示，duNLRP3基因與Gallus（雞屬）、Anser（雁屬）、Numida（珠雞屬）、Tyto（草鸮屬）、Centrocercus（榛雞屬）、Melegris、Coturnix（鵪鶉）、Falco（隼屬）和Strigops（鸮面鸚鵡屬）NLRP3基因相似性較高，分別為84.6%、75.7%、84.8%、81.5%、84.4%、84.2%、81.9%、80.3%、80.1%；與哺乳動物和魚類NLRP3基因相似性較低，低于55%，如圖5所示。系統(tǒng)進化樹分析顯示，NLRP3基因分為哺乳動物、鳥類和魚類3個分枝，duNLRP3位于鳥類分枝，如圖6所示，進化樹形態(tài)與分類學保持一致。

圖5 duNLRP3與其他物種NLRP3基因相似性分析Fig.5 Similarity analysis of NLRP3 gene sequences between duck and other species

圖6 duNLRP3基因進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree of duNLRP3 gene

2.3.3 蛋白質理化性質分析

應用ProtParam分析duNLRP3蛋白理化性質，結果顯示，duNLRP3蛋白含有934個氨基酸，其中亮氨酸含量最高（14.9%）、谷氨酸第二（7.3%）、甘氨酸第三（7.2%），其余氨基酸含量見表2。DuNLRP3蛋白理論分子質量為104.31 ku，分子式為C4605H7310N1270O1372S59，等電點（pI）為5.88，不穩(wěn)定系數(shù)為44.17，說明duNLRP3蛋白屬于酸性、不穩(wěn)定蛋白。

表2 duNLRP3蛋白氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of duNLRP3 protein

應用ProtScale預測duNLRP3氨基酸序列親/疏水性，結果顯示，duNLRP3氨基酸序列最低分值為-3.256（位于第98為氨基酸，谷氨酰胺），親水性最強；最高分值為2.467（位于第840位氨基酸，丙氨酸），疏水性最強，如圖7所示。該蛋白整條肽鏈大部分位于親水區(qū)域，總平均親水性（GRAVY）為-0.175，說明duNLRP3蛋白為親水性蛋白。

圖7 duNLRP3蛋白疏水性預測Fig.7 Hydrophpbicity prediction of duNLRP3 protein

2.3.4 跨膜結構域預測

通過TMHMM Server v.2.0程序預測duNLRP3跨膜結構域，結果顯示，duNLRP3蛋白無跨膜區(qū)，整條肽鏈位于膜外且不屬于定位于膜上的蛋白，為膜外蛋白（見圖8）。由圖9、10可知，核定位分析結果顯示入核得分為0.46、信號肽預測結果顯示，有信號肽概率為3.617%，表明該蛋白定位于細胞質中，屬于胞質蛋白，不是膜蛋白、核內蛋白或分泌蛋白。

圖8 duNLRP3蛋白跨膜結構預測Fig.8 Transmembrane structure prediction of duNLRP3 protein

圖9 duNLRP3蛋白核定位預測分析Fig.9 Prediction of nuclear localization of duNLRP3 protein

圖10 duNLRP3蛋白信號肽預測分析Fig.10 Prediction analysis of signal peptide of duNLRP3 protein

2.3.5 二級三級結構預測

通過SOPMA在線程序對二級結構進行預測，結果顯示，duNLRP3蛋白二級結構主要為α-螺旋（58.03%），無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β-轉角分別為31.26%、7.07%和3.64%，如圖11所示。通過SWISS-MODEL程序對該蛋白三級結構進行預測，結果顯示，duNLRP3蛋白含有α-螺旋、β-轉角和無規(guī)則卷曲等復雜結構，且duNLRP3與人NLRP3蛋白高級結構高度相似，與魚類NLRP3蛋白高級結構存在較大差異，如圖12所示。

圖11 duNLRP3蛋白二級結構預測Fig.11 Secondary structure prediction of duNLRP3 protein

圖12 NLRP3蛋白三級結構預測Fig.12 Tertiary structure prediction of NLRP3 protein in duck,human and Crucian carp

2.3.6 磷酸化位點預測分析

利用NetPhos3.1 Server在線程序預測duNLRP3蛋白磷酸化位點，如圖13所示，結果顯示，該蛋白共有81個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點47個，蘇氨酸磷酸化位點27個，酪氨酸磷酸化位點7個。

圖13 duNLRP3蛋白磷酸化位點預測Fig.13 Phosphorylation sites of duNLRP3 protein

2.4 重組蛋白duNLRP3-Flag表達和鑒定

IFA檢測發(fā)現(xiàn)，重組質粒pCAGGS-duNLRP3-Flag轉染DEF細胞后，鴨NLRP3蛋白從12 h開始表達，在細胞質中呈彌散性分布，且隨轉染時間增加蛋白表達量逐漸增多，DHAV-1刺激后，鴨NLRP3寡聚化，在核周呈現(xiàn)點狀聚集，如圖14A所示。WB檢測結果顯示在104 ku有條帶，與預期蛋白結果相符，如圖14B所示。結果表明重組質粒pCAGGS-duNLRP3-Flag可在DEF細胞中成功表達，且表達的蛋白具有寡聚化功能。

圖14 重組質粒pCAGGS-duNLRP3-Flag在DEF細胞中的表達Fig.14 Expression of recombinant plasmid pCAGGS-duNLRP3-Flag in DEF cells

3 討論

炎癥小體作為炎癥反應重要組成，在2002年首次被提出，是多種蛋白質組成復合體，是天然免疫系統(tǒng)重要組成[9]。在感知外界病原體或損傷后，傳遞信號給免疫系統(tǒng)，啟動炎癥。根據(jù)受體蛋白不同，炎癥小體主要有NLRP3、NLRC4、AIM2、NLRP1、NLRP6等[10]，由于NLRP3炎癥小體可被廣泛外源性和內源性刺激物激活[11]，是炎癥小體研究重點。NOD樣受體蛋白3是NLRP3炎癥小體核心蛋白，主要包含3個功能結構域：氨基（N）末端PYD結構域、中間NACHT結構域及羧基（C）末端LRR結構域[12]。本研究中擴增的鴨NLRP3基因長2 805 bp，編碼934個氨基酸，具有完整PYD、NACHT和LRR結構域。因此，本試驗獲鴨NLRP3基因全長CDS序列，編碼的蛋白在理論上具有NLRP3蛋白完整功能。研究發(fā)現(xiàn)，鴨NLRP3炎癥小體在大腸桿菌感染及砷、鉬、鎘等重金屬污染時參與機體炎癥反應[13-16]。本研究在DHAV-1感染后，duNLRP3發(fā)生寡聚化，形成斑點樣聚集。NLRP3蛋白自身寡聚化是NLRP3炎癥小體活化的結構基礎[17]，說明鴨NLRP3蛋白具有與哺乳動物NLRP3蛋白相似的功能。

NLRP3炎癥小體激活受兩級信號調控，第一級信號為預激活，第二級信號為組裝。磷酸化修飾貫穿于NLRP3炎癥小體激活全部過程，是預激活階段（Priming）和組裝階段（Assembly）關鍵分子。在NLRP3炎癥小體激活Priming階段，位于PYD和NACHT結構域之間的第198位絲氨酸（人Ser198，小鼠Ser194）發(fā)生的磷酸化修飾介導NLRP3去泛素化及自身寡聚化，促進NLRP3炎癥小體激活[18]。還有一些位點的磷酸化參與維持靜息狀態(tài)時NLRP3蛋白的自我抑制或抑制NLRP3炎癥小體組裝，抑制炎癥小體激活。比如，NLRP3蛋白PYD區(qū)Ser5（小鼠Ser3）和Tyr32（小鼠Tyr30）的磷酸化導致相應位點帶上負電荷，在靜電斥力作用下無法與ASC蛋白PYD結構域發(fā)生同型互作，抑制炎癥小體組裝[19-21]。LRR區(qū)Tyr861（小鼠Tyr859）和Tyr918（小鼠Tyr915）磷酸化促進NLRP3蛋白自噬降解或蛋白酶體途徑降解，在NLRP3炎癥小體活性調控中發(fā)揮抑制作用[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)鴨NLRP3蛋白在上述磷酸化位點相同或相近位置也存在磷酸化陽性位點，說明NLRP3炎癥小體活性調控機制在不同物種間具有相似性。

不同物種NLRP3炎癥小體活性存在較大差異。相比于人類和小鼠NLRP3炎癥小體的高促炎活性，蝙蝠NLRP3炎癥小體促炎活性較低。在病毒感染后，蝙蝠NLRP3轉錄水平也顯著低于人類和小鼠，Ahn等研究發(fā)現(xiàn)蝙蝠NLRP3蛋白LRR結構域與其較低的功能活性有關，LRR-LRR相互作用力增強，導致NLRP3炎癥小體活化閾值升高，降低其促炎活性[25]。鴨NLRP3蛋白LRR結構域包含229個氨基酸，形成6個LRR。相比人NLRP3 LRR序列縮短148個氨基酸，缺失過渡LRR，并減少2個經典LRR。因此，鴨NLRP3蛋白活化能力和NLRP3炎癥小體活性可能與人等哺乳動物的NLRP3炎癥小體存在差異，但尚需進一步試驗驗證。本研究通過克隆鴨NLRP3基因全長編碼區(qū)后對其進行生物信息學分析，構建鴨NLRP3基因真核表達載體，為今后探討鴨NLRP3基因在宿主防御病原感染中作用及鴨NLRP3炎癥小體功能調控奠定基礎。