蘇靜艷，鄭景賢，趙亞浩，佟慧麗*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞與遺傳工程黑龍江省重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)實驗室，哈爾濱 150030）

透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸構(gòu)成，是重復(fù)二糖單元組成的多糖，屬于氨基聚糖家族，作為細(xì)胞外基質(zhì)重要成分，廣泛存在于人體組織。1 MDa以上透明質(zhì)酸被定義為高分子量HA（High molecular weight hyaluronic acid,HMW-HA）。HMW-HA具有抗增殖、抗氧化、抗腫瘤和抗血管生成特性，參與傷口愈合[1-2]。正常生理狀態(tài)下，透明質(zhì)酸以高分子量形式存在，在病理情況如炎癥發(fā)生時，透明質(zhì)酸降解為小分子，發(fā)揮抗炎、抗細(xì)菌感染等作用[3-4]。透明質(zhì)酸通過結(jié)合細(xì)胞表面各種受體分子如CD44、HMMR、LAYN等發(fā)揮生物學(xué)活性[5-6]。對CD44高表達(dá)的實體腫瘤，化學(xué)修飾后的透明質(zhì)酸和基于透明質(zhì)酸的納米載體可用于化療藥物遞送，增強(qiáng)藥物作用潛能及細(xì)胞毒性，獲得較好抗腫瘤作用[7]。

此外，不同生物個體中透明質(zhì)酸以不同分子量范圍存在，裸鼴鼠是目前壽命最長的嚙齒類動物，與其他哺乳動物相比，可產(chǎn)生超高分子量的透明質(zhì)酸（＞6.1 MDa），研究表明超高分子量的透明質(zhì)酸通過抑制其受體CD44與其他蛋白相互作用下調(diào)p53基因表達(dá)，使小鼠和人類細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞死亡[8]。同時裸鼴鼠體內(nèi)超高分子量透明質(zhì)酸的存在，使其體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生接觸抑制，并抵抗癌癥發(fā)生[9]，近年來引發(fā)學(xué)界關(guān)注。因此推測高分子量的透明質(zhì)酸抗癌效果較好。

橫紋肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RMS）是兒童和青少年中最常見的（約50%）軟組織肉瘤，是一種以早期肌源性分化為特征的惡性腫瘤[10]。其惡性程度高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，放化療效果不理想，易復(fù)發(fā)，預(yù)后不良，是臨床治療難題。本文通過研究高分子量透明質(zhì)酸（1.2 MDa）抑制橫紋肌肉瘤細(xì)胞遷移，旨在為高分子量透明質(zhì)酸在抗腫瘤研究中提供新的思路和策略，具有廣闊的應(yīng)用前景和價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用的RD（人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞）（CL-0193）購自武漢普諾賽生命科技有限公司，采用RD細(xì)胞專用培養(yǎng)基（CM-0193）培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 試驗試劑及儀器

高分子量透明質(zhì)酸（1.2 MDa，9004-61-9，中國）。Cdc42抗體（bs-3555R，博奧森，中國），Arp2/3抗體（bs-10563R，博奧森，中國），GAPDH抗體（10494-1-AP，Proteintech，中國）。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（bs-0925GHRP，博奧森，中國）。Cy5標(biāo)記的小鼠抗兔二抗（bs-0369M-Cy5，博奧森，中國）。甘氨酸、Tris、聚丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、胰蛋白酶、PBS溶液（Sigma，美國），微絲綠色熒光探針Actin-Tracker Green（C1033）、RIPA Buffer細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、超敏型抗熒光淬滅劑、細(xì)胞核染料DAPI、Tween 20、Trition-X-100、牛血清白蛋白BSA（碧云天，中國），PVDF膜、超敏型曝光液（Millpore，美國），其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

生物超凈工作臺（蘇州安泰，中國），電子分析天平（Mettler Toledo，瑞士），超低溫冰箱（SANYO，日本），雙板垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（北京六一，中國），CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國），倒置顯微鏡（Olympus，日本），化學(xué)發(fā)光成像儀（MiniChemiTM 500，Sage Creation Science，中國），超高分辨顯微鏡（Deltavision OMX SR，GE，美國）。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞劃痕試驗

將RD細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用100 μL移液管尖端均勻繪制無細(xì)胞區(qū)域，用PBS清洗細(xì)胞3次以去除細(xì)胞碎片，補充新鮮培養(yǎng)基（不含血清）。拍照記錄細(xì)胞生長情況，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后，再次對細(xì)胞拍照，采用Image J分析細(xì)胞劃痕面積，細(xì)胞遷移率：

遷移率（%）=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100。

1.3.2 高分子量透明質(zhì)酸的細(xì)胞添加試驗

采用PBS磷酸鹽緩沖液稀釋高分子量透明質(zhì)酸至濃度為1 μg·μL-1（透明質(zhì)酸工作液）。取貼壁生長的RD細(xì)胞，去除舊的細(xì)胞生長培養(yǎng)液，以PBS清洗細(xì)胞后，加入新鮮細(xì)胞生長培養(yǎng)液和高分子量透明質(zhì)酸的混合溶液，充分混勻，其中透明質(zhì)酸終濃度分別為50、100和200 μg·mL-1。對照組向細(xì)胞中添加PBS和新鮮生長培養(yǎng)液的混合溶液。以6孔板為例（單孔細(xì)胞培養(yǎng)液總體積為2 mL），試驗組和對照組藥品添加量如表1所示。將添加高分子量透明質(zhì)酸或者PBS對照的細(xì)胞放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)熒光定量，Western blot檢測及細(xì)胞免疫熒光試驗。

表1 高分子量透明質(zhì)酸的細(xì)胞添加試驗Table 1 Cell addition test of HMW-HA

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測

本研究采用SYBGreen實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）法檢測高分子量透明質(zhì)酸對RD細(xì)胞中不同透明質(zhì)酸受體mRNA的表達(dá)情況。具體流程為RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR檢測。①RNA提?。翰捎肨RIZOL試劑（Invitrogen）提取RD細(xì)胞總RNA。②反轉(zhuǎn)錄：采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（R211-01，南京諾唯贊，中國）進(jìn)行細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄試驗，用于雙鏈cDNA合成。③熒光定量PCR：采用SYBR qPCR Master Mix試劑盒（Q111-02，南京諾唯贊，中國）說明配制RTPCR反應(yīng)體系。

引物序列如表2所示。反應(yīng)體系為：SYBR q PCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，cDNA模板2 μL，補水至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火和延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3次平行試驗。以GAPDH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCT法計算不同透明質(zhì)酸受體mRNA相對表達(dá)量。

表2 不同HA受體熒光定量引物序列Table 2 Fluorescence quantitative primer sequences of different HA receptors

1.3.4 Western blot檢測

采用標(biāo)準(zhǔn)試驗流程進(jìn)行Western blot檢測，簡述如下：以預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次。棄去PBS，加入RIPA Buffer細(xì)胞裂解液對細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。采用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液稀釋收集的蛋白樣品。隨后，進(jìn)行SDS-PAGE聚丙酰胺凝膠電泳試驗，通過蛋白印記系統(tǒng)，將聚丙烯凝膠上分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（200 mA，恒流2 h）。分別采用CD44、cdc42、Arp2/3、和GAPDH等一抗稀釋液孵育PVDF膜（4℃，12 h），使用PBST（PBS+0.2% Tween 20）清洗PVDF膜3次，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育PVDF膜（37℃，1 h），PBST清洗3次后，采用化學(xué)發(fā)光成像儀對蛋白條帶進(jìn)行圖像采集和分析。一抗和二抗稀釋倍數(shù)分別采用說明書推薦的最佳比例。

1.3.5 細(xì)胞免疫熒光染色

采用PBS清洗貼壁的RD細(xì)胞鋪片，隨后以4%多聚甲醛于室溫下固定細(xì)胞，20 min后，棄去固定液。用PBS清洗細(xì)胞3次后，加入5%BSA的PBST（PBS+0.1%Triton）進(jìn)行透膜和封閉處理（37℃，1 h）。棄去5%BSA的PBST（PBS+0.1%Triton），以CD44一抗稀釋液（以5%BSA的PBST稀釋抗體）孵育細(xì)胞（4℃，12 h），采用PBST清洗細(xì)胞3次，棄去清洗液，加入Cy5標(biāo)記的小鼠抗兔二抗稀釋液避光孵育細(xì)胞（37℃，1 h），采用PBST清洗細(xì)胞3次并棄去清洗液。采用Actin-Tracker Green染料稀釋液避光孵育細(xì)胞30 min，采用PBST清洗細(xì)胞3次并棄去清洗液，采用DAPI細(xì)胞核染料孵育細(xì)胞10 min，采用PBST清洗細(xì)胞3次，吸凈清洗液后，將細(xì)胞鋪片倒扣于預(yù)先滴加抗熒光猝滅封片劑的載玻片上，使用超高分辨顯微鏡對細(xì)胞中CD44表達(dá)和微絲分布進(jìn)行觀察和拍照。一抗和二抗稀釋倍數(shù)分別采用說明書推薦的最佳比例。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Image J軟件掃描Western blot圖片灰度及分析細(xì)胞遷移率，所有試驗數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism軟件統(tǒng)計。采用SPSS（SPSS Inc.Chicago IL，USA）分析數(shù)據(jù)差異顯著性。相關(guān)數(shù)據(jù)使用t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析。ns代表不同處理組之間無統(tǒng)計學(xué)差異；*代表不同處理之間差異顯著（P＜0.05），**代表不同處理組之間差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高分子量透明質(zhì)酸細(xì)胞劃痕試驗

本研究采用不同濃度高分子量透明質(zhì)酸處理RD細(xì)胞，分別于作用0和24 h記錄RD細(xì)胞遷移情況（見圖1A）。統(tǒng)計分析結(jié)果表明不同濃度的透明質(zhì)酸（50、100和200 μg·mL-1）均可極顯著抑制RD細(xì)胞遷移（P＜0.01），其中200 μg·mL-1透明質(zhì)酸抑制效果最明顯（見圖1B）。表明高分子量透明質(zhì)酸可抑制RD細(xì)胞遷移，以200 μg·mL-1濃度透明質(zhì)酸用于后續(xù)試驗。

圖1 高分子量透明質(zhì)酸對RD細(xì)胞遷移的影響Fig.1 Effects of high molecular weight hyaluronic acid on RD cell migration

2.2 不同透明質(zhì)酸受體mRNA表達(dá)的熒光定量PCR檢測

采用200 μg·mL-1高分子量透明質(zhì)酸處理RD細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA，并采用SYBRGreen熒光定量PCR法檢測7種主要的透明質(zhì)酸受體mRNA表達(dá)情況。檢測結(jié)果表明不同透明質(zhì)酸受體在RD細(xì)胞中呈現(xiàn)不同的表達(dá)量。其中CD44和HMMR具有較高的表達(dá)量，且在高分子量透明質(zhì)酸處理后CD44和HMMR的mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)。而其他幾種透明質(zhì)酸受體LAYN、HARE、Siglec9、TLR2和TLR4表達(dá)水平較低，高分子量透明質(zhì)酸處理對上述幾種受體的表達(dá)無顯著影響（見圖2）。CD44和HMMR在RD細(xì)胞中高表達(dá)，在透明質(zhì)酸處理時表達(dá)量發(fā)生顯著變化，表明CD44和HMMR可能作為高分子量透明質(zhì)酸發(fā)揮作用的主要受體，在抑制RD細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮重要作用。

圖2 不同透明質(zhì)酸受體mRNA表達(dá)的熒光定量PCR檢測Fig.2 Detection of the mRNA expression of hyaluronic acid receptors by real-time fluorescence quantitative PCR

2.3 高分子量透明質(zhì)酸對RD細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步闡明高分子量透明質(zhì)酸抑制RD細(xì)胞遷移的機(jī)理。本研究采用Western blot檢測CD44及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)情況。檢測結(jié)果顯示，與mRNA表達(dá)的熒光定量檢測結(jié)果一致，200 μg·mL-1高分子量透明質(zhì)酸處理RD細(xì)胞48 h后，CD44蛋白表達(dá)量與對照組相比顯著下調(diào)（見圖3A，B）。同時透明質(zhì)酸處理組的細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白cdc42和Arp2/3表達(dá)量亦顯著下調(diào)（見圖3A，C，D）。上述結(jié)果表明，高分子量透明質(zhì)酸處理引起CD44表達(dá)量下調(diào)，通過下調(diào)cdc42和Arp2/3表達(dá)而影響微絲聚合，阻礙RD細(xì)胞遷移。

圖3 高分子量透明質(zhì)酸對RD細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Protein expression related to cell migration impacted by high molecular weight hyaluronic acid in RD cells

2.4 高分子量透明質(zhì)酸對RD細(xì)胞中CD44定位及微絲分布的影響

本研究采用細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)對RD細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)及微絲分布情況進(jìn)行共定位染色。超高分辨顯微鏡觀察結(jié)果顯示CD44蛋白分布在RD細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)域，200 μg·mL-1高分子量透明質(zhì)酸處理后，紅色陽性熒光信號分布及強(qiáng)度顯著減少和減弱（見圖4）。微絲分布定位的熒光染色（綠色信號）結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞中，在CD44高表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)域，微絲在局部聚集呈分枝狀，提示此處微絲裝配為細(xì)胞偽足并促進(jìn)細(xì)胞遷移。高分子量透明質(zhì)酸處理48 h后，細(xì)胞體積增大且伸展，同時CD44表達(dá)量降低，微絲呈現(xiàn)應(yīng)力纖維的分布狀態(tài)（見圖4B）。此外，光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果顯示200 μg·mL-1高分子量透明質(zhì)酸處理RD細(xì)胞48 h后，并未影響RD細(xì)胞活性及狀態(tài)（見圖4A）。

圖4 高分子量透明質(zhì)酸對RD細(xì)胞中CD44定位及微絲分布的影響Fig.4 CD44 localization and microfilament distribution in RD cells impacted by high molecular weight hyaluronic acid

上述結(jié)果表明，CD44表達(dá)變化可能參與調(diào)節(jié)微絲動態(tài)裝配過程，通過影響偽足形成而降低細(xì)胞遷移運動。

3 討論

為明確高分子量透明質(zhì)酸在RD細(xì)胞中可能的作用受體，本研究采用熒光定量RT-PCR法檢測不同透明質(zhì)酸的表達(dá)受體，HMMR、LAYN、HARE、Siglec9、TLR2和TLR4，結(jié)果表明CD44在RD細(xì)胞中表達(dá)水平最高，高分子量透明質(zhì)酸處理顯著下調(diào)CD44表達(dá)。Western blot蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果與熒光定量結(jié)果相符，即高分子量透明質(zhì)酸可下調(diào)CD44蛋白表達(dá)水平，提示在RD細(xì)胞中，CD44可能作為高分子量透明質(zhì)酸作用的靶點而影響細(xì)胞行為。

CD44屬于單次跨膜的非激酶型糖蛋白，其在胚胎干細(xì)胞及多種細(xì)胞類型包括結(jié)締組織和骨髓中表達(dá)[11]。CD44在多種癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志分子[12]。透明質(zhì)酸作為CD44配體，通過結(jié)合CD44胞外結(jié)構(gòu)域，將細(xì)胞信號傳遞至CD44胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起細(xì)胞增殖、黏附、遷移及侵襲[13]。研究表明，腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial mesenchymal transition，EMT）時，CD44表達(dá)上調(diào)[14]。臨床病理學(xué)研究表明CD44可能是癌癥治療新靶點[15]。此外，CD44在維持腫瘤干細(xì)胞干性和治療后腫瘤再生中發(fā)揮促進(jìn)作用，提示其可能是一個重要腫瘤預(yù)后標(biāo)志分子[16]。研究表明，橫紋肌肉瘤組織中CD44表達(dá)與患者預(yù)后直接相關(guān)[17]。但CD44在橫紋肌肉瘤進(jìn)展中作用尚不明確。

細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果表明，不同濃度高分子量透明質(zhì)酸特別是200 μg·mL-1可顯著抑制RD細(xì)胞遷移。免疫熒光染色的超高分辨觀察結(jié)果表明，CD44高表達(dá)時，細(xì)胞內(nèi)微絲主要集中在緊貼細(xì)胞質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，交聯(lián)為絲狀或分枝狀的結(jié)構(gòu)，表明其可能作為細(xì)胞絲狀或片狀偽足參與細(xì)胞遷移和運動。Rho家族小GTP酶作為分子開關(guān)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和運動。Rho家族小GTP酶包括3個家族成員：Rac，Cdc42和Rho[18]。其中，Cdc42位于細(xì)胞運動前端，參與細(xì)胞遷移極性和方向。細(xì)胞外信號可在特定方向上激活細(xì)胞質(zhì)膜附近的Cdc42，使細(xì)胞產(chǎn)生極性，發(fā)展為細(xì)胞運動前緣，同時可使微管骨架和內(nèi)膜系統(tǒng)也產(chǎn)生極化。Cdc42通過WASP蛋白激活A(yù)rp2/3復(fù)合物，刺激分枝狀微絲（片狀偽足）的裝配，而片狀偽足是推動細(xì)胞前緣向前運動的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[19]。研究表明Arp2/3復(fù)合物通過誘導(dǎo)肌動蛋白聚合為微絲，對促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移和侵襲至關(guān)重要，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散能力[20]。

研究結(jié)果顯示，CD44高表達(dá)時，微絲主要以絲狀或分枝狀形式存在于細(xì)胞質(zhì)膜前端，推測其與RD細(xì)胞較強(qiáng)遷移能力有關(guān)。高分子量透明質(zhì)酸處理后，CD44表達(dá)量極低，微絲改變其分布形式，貫穿于整個細(xì)胞，以應(yīng)力纖維形式存在，使細(xì)胞形態(tài)更為鋪展，提示其可能抑制細(xì)胞遷移，與蛋白表達(dá)檢測結(jié)果相符，即CD44表達(dá)下調(diào)同時，Cdc42和Arp2/3表達(dá)量也顯著降低，提示高分子量透明質(zhì)酸處理可影響RD細(xì)胞偽足形成，抑制細(xì)胞遷移。但高分子量透明質(zhì)酸為何下調(diào)CD44表達(dá)，是否通過轉(zhuǎn)錄水平抑制CD44表達(dá)，以及RD細(xì)胞中微絲分布變化與CD44表達(dá)關(guān)系的詳細(xì)分子機(jī)制，仍待深入探索。高分子量透明質(zhì)酸對于RD細(xì)胞遷移的抑制，可為研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和運動遷移提供新思路，具有重要應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

高分子量透明質(zhì)酸可降低RD細(xì)胞中透明質(zhì)酸受體CD44表達(dá)，通過抑制細(xì)胞偽足形成而抑制RD細(xì)胞遷移和運動，為橫紋肌肉瘤疾病治療提供新策略。