王媛 劉晟楠 馬姣姣 郝娜 姜紅 李立萍 張勤增 解麗君

缺血性心臟病是引起人類死亡的主要疾病，世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的數(shù)據(jù)顯示，2015年缺血性心臟病死亡人數(shù)占全球死亡人數(shù)的15.5%[1]。氧化應(yīng)激在心肌缺血損傷早期發(fā)揮著重要的作用,硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interaction protein，TXNIP)/硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)是機體內(nèi)重要的抗氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)[2]。硫化氫(H2S)作為一種新型氣體信號分子，在體內(nèi)主要由L-半胱氨酸和同型半胱氨酸等為底物在胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)作用下生成。本實驗室前期研究證實H2S/CSE體系參與了大鼠急性心肌缺血的病理生理過程，H2S供體可通過抗氧化應(yīng)激，抑制心肌細胞凋亡減輕心肌缺血損傷[3,4]。五味子乙素是中藥五味子的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗癌、保肝等藥理作用[5]，還有研究報道五味子乙素可以減輕血管緊張素Ⅱ及高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷[6]。本研究通過建立大鼠急性心肌缺血模型探討Sch B對心肌缺血損傷的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體重(230±20)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司供，許可證號：SCXK(京)2019-0008，適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1周。

1.2 實驗儀器及試劑 五味子乙素(Schisandrin B)(上海融禾醫(yī)藥公司，200809，純度：99.23%)；2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC)(Sigma，T8877-25G)；TXNIP兔單克隆抗體(華安生物，ET1705-72)；TRX兔多克隆抗體(Proteintech，14999-1-AP)；NOX-4兔單克隆抗體(Abcam，ab13303)；Caspase-3兔多克隆抗體(Proteintech，19677-1-AP)；LPO、GSH、考馬斯亮蘭法蛋白測試盒(南京建成，批號：A106-1-2，A006-2-1，A045-2-2)；硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性檢測試劑盒(索萊寶，BC1155)；硫化氫(H2S)含量檢測試劑盒(索萊寶，BC2055)；通用SP試劑盒(中杉金橋，SP-9000)；Powerlab8/s多通道生理記錄儀(ADInstruments公司)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)移電泳儀以及轉(zhuǎn)移電泳槽(Bio-Rad公司)；全波長酶標儀(BioTek公司)；全自動顯微照相系統(tǒng)(Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組:大鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組(n=12)：對照組(C組)，心肌缺血模型組(M組)，五味子乙素低劑量組(Sch B 20 mg·kg-1·d-1，M + L Sch B組)、中劑量組(Sch B 40 mg·kg-1·d-1，M + M Sch B組)和高劑量組(Sch B 80 mg·kg-1·d-1，M + H Sch B組)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給藥組大鼠分別給予1%羧甲基纖維素鈉與相應(yīng)劑量Sch B制成的混懸液，對照組和模型組2組均給予1%羧甲基纖維素鈉，10 ml/kg，1次/d，連續(xù)14 d。

1.3.2 大鼠心肌缺血模型建立:末次給藥2 h后1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，記錄標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖；無創(chuàng)氣管插管，呼吸機調(diào)節(jié)為RR 40～60次/min，VT10～12 ml。左側(cè)三四肋間開胸，分離心包膜，暴露心臟。6～0帶針縫合線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，以心臟左前壁呈紫紺或Ⅱ?qū)?lián)S-T段弓背向上抬高>0.15 mV并持續(xù)>0.5 h為結(jié)扎成功標志，3 h后處死大鼠，對照組只穿線不結(jié)扎。

1.3.3 大鼠血流動力學(xué)指標:5組大鼠于缺血末右頸總動脈插管，Powerlab/8s生理記錄儀記錄平均動脈壓(MAP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓上升/下降的最大速率(±dp/dtmax)，計算左心室發(fā)展壓(LVDP=LVSP-LVEDP)。

1.3.4 血清中H2S含量:大鼠腹主動脈取血，取血清，酶標儀測定波長665 nm，測各樣品吸光度計算含量。

1.3.5 心肌組織CSE的活性:心肌組織稱重，按1∶10加入50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值=6.8)勻漿，4℃、4 000 r/min離心10 min，取上清備用。25 ml錐形瓶中央體積為1 cm3的中央室中，加入0.1 ml心肌組織勻漿和0.9 ml反應(yīng)液(含100 mmol/L磷酸鉀緩沖液、10 mmol/L L-半胱氨酸、2 mmol/L 15’-磷酸吡多醛，pH值7.4)。37℃恒溫搖床孵育90 min后向反應(yīng)體系中加入0.5 ml 50%三氯醋酸終止反應(yīng)。中央室內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到試管中，加入3.6 ml蒸餾水、0.5 ml 7.2 mol/L鹽酸(含20 mmol/L N,N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽)和0.4 ml 1.2 mol/L鹽酸(含30 mmol/L三氯化鐵)，混勻，室溫靜置20 min，波長665 nm測吸光度。根據(jù)NaHS標準曲線計算溶液中H2S的含量，組織中CSE活性以每毫克組織在單位時間內(nèi)生成H2S的量表示，單位為nmol·min-1·mg-1。

1.3.6 心肌組織中LPO、GSH含量:實驗?zāi)┤∽笮氖仪氨谛募〗M織，按試劑盒說明書操作，酶標儀(測定波長分別為586、420 nm)，測得吸光度計算含量。

1.3.7 心肌組織中TrxR活性:實驗?zāi)┤∽笮氖仪氨谛募〗M織，剪碎，每0.1克加入1 ml提取液冰上研磨，10 000 r/min，4℃離心10 min，取上清，酶標儀調(diào)節(jié)波長至412 nm，按每個樣本每分鐘生成1 nmol TNB為1個酶活力單位，測定樣本5 min內(nèi)的TrxR活力。

1.3.8 大鼠心肌梗死面積：實驗?zāi)┱〈笫笮呐K，-80℃速凍5 min，切片，采用1% TTC 37℃避光溫浴染色20 min，拍照， ImageJ軟件計算切片梗死面積。

1.3.9 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察:取心肌組織常規(guī)固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，于光學(xué)顯微鏡下(×200)觀察。

1.3.10 透射電鏡觀察心肌組織的形態(tài)學(xué)變化:取心尖部組織，冰臺上切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，4%戊二醛固定，環(huán)氧樹脂浸透，包埋，超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.11 免疫組織化學(xué)染色方法觀察TXNIP、TRX、Caspase-3表達:心肌組織石蠟切片，按照SP9000試劑盒說明書操作，一抗的稀釋倍數(shù)分別為：TXNIP(1∶100)、TRX(1∶100)、Caspase-3(1∶100)，DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.12 Western blotting法檢測心肌組織中TXNIP、TRX、Caspase-3、NOX-4表達:心尖組織提取蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉，分別加入一抗TXNIP(1∶3 500)、TRX(1∶3 000)、Caspase-3(1∶2 000)、NOX-4(1∶2 000)，4℃搖床過夜。加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液顯色，Image J軟件分析。以目的蛋白條帶灰度值比β-actin條帶灰度值計算。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血流動力學(xué)指標測定 與C組相比，M組大鼠心功能指標MAP、LVDP、±dp/dtmax均明顯降低，LVEDP明顯升高(P<0.01)。與M組相比，SchB中、高劑量組大鼠心功能指標MAP、LVDP、±dp/dtmax明顯升高，LVEDP明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 SchB對心肌缺血大鼠心功能的影響

2.2 大鼠血清中H2S含量的測定和心肌組織中CSE活性的變化 與C組相比，M組血清中H2S含量和心肌組織CSE活性降低(P<0.01)，與M組相比，Sch B各組大鼠血清中H2S含量和心肌組織CSE活性增加(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.3 大鼠心肌組織中LPO和GSH含量測定 與C組相比，M組大鼠心肌組織中LPO含量明顯增加(P<0.01)、GSH含量減少(P<0.01); 與M組相比，Sch B各組大鼠心肌組織中LPO含量明顯減少(P<0.01)，GSH含量明顯增加(P<0.05)。見表2。

2.4 大鼠心肌組織中TrxR的活性的測定 與C組相比，M組大鼠心肌組織中TrxR的活性明顯降低(P<0.01)，與M組相比，Sch B各組大鼠心肌組織中TrxR的活性明顯升高(P<0.05或<0.01)。見表2。

表2 Sch B對大鼠心肌組織中H2S、CSE、GSH、LPO及TRX含量的影響

2.5 大鼠心肌梗死面積的測定 TTC染色后，梗死區(qū)顯示為白色，非梗死區(qū)顯示為紅色。與C組相比，M組和Sch B各組心肌梗死面積均明顯增加(P<0.05)，與M組相比，Sch B各組不同劑量給藥后心肌梗死面積逐漸減少(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 5組大鼠的心肌梗死面積

圖1 5組大鼠的心肌梗死面積

2.6 大鼠心肌組織病理學(xué)改變 C組心肌組織未見異常，心肌細胞排列整齊，形態(tài)正常，M組大鼠心肌缺血后，心肌細胞水腫，肌原纖維松弛斷裂，有大量心肌細胞壞死，壞死處由炎性細胞浸潤填充。而SchB各劑量組給藥后心肌組織改變顯著減輕。見圖2。

2.7 透射電鏡觀察心肌組織的形態(tài)學(xué)變化 C組大鼠心肌纖維排列整齊，線粒體嵴和膜完整，核周隙稍擴張。M組大鼠心肌纖維排列紊亂，核質(zhì)和核周高度水腫，核膜局部消失；線粒體嵴和膜嚴重腫脹變形，溶解，消失。與M組相比，Sch B各劑量組大鼠心肌損傷明顯減輕，尤其是M+H Sch B組，肌纖維排列稍紊亂，線粒體基質(zhì)輕微水腫。見圖2。

圖2 Sch B對I/R大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變的影響；A 缺血3 h后心肌組織HE染色(×200)；B 缺血3 h后心肌組織的電鏡觀察(×30 000)；C 缺血3 h后心肌組織的電鏡觀察(×10 000)

2.8 免疫組化和Western blotting法檢測各組蛋白表達變化 與C組相比，M組大鼠心肌組織中TXNIP、Caspase-3、NOX-4蛋白表達水平增加，TRX蛋白表達水平下降(P<0.01)，與M組相比，Sch B中、高劑量組，TXNIP、Caspase-3、NOX-4蛋白表達水平降低，TRX蛋白表達水平升高(P<0.05)。見表4，圖3、4。

表4 Sch B對大鼠心肌組織中TXNIP、Caspase-3、NOX-4、TRX表達的影響

圖3 免疫印跡檢測TXNIP、Caspase-3、NOX-4、TRX蛋白表達變化

3 討論

缺血性心臟病是心血管疾病患者的重要死因[3，4]。氧化應(yīng)激和凋亡被認為是心肌缺血重要的發(fā)病機制，氧自由基(oxygen free radical，OFR)介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物過度激活是造成心肌缺血損傷的關(guān)鍵因素。氧化應(yīng)激發(fā)生時，血管壁產(chǎn)生過量的活性氧，OFR大量釋放，引發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷細胞膜、細胞器乃至細胞核酸，導(dǎo)致細胞凋亡、壞死，從而造成心肌細胞急性或慢性損傷[7]。機體內(nèi)存在復(fù)雜的氧化還原調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，TRX一種巰基抗氧化蛋白，具有直接清除自由基和氧化還原功能。TXNIP是TRX的內(nèi)源性抑制劑, 通過與TRX 的結(jié)合與解離調(diào)節(jié)機體的氧化應(yīng)激，TXNIP/TRX是機體內(nèi)重要的抗氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)，參與多種細胞或器官的保護[2]。心肌缺血時，活性氧生成和抗氧化防御系統(tǒng)之間存在不平衡，氧化應(yīng)激發(fā)生，導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的激活和細胞凋亡的啟動[8,9]。

圖4 免疫組化法檢測TXNIP、TRX、Caspase-3在心肌組織中的表達(免疫組化×200)

H2S在神經(jīng)、心血管、免疫等多個系統(tǒng)發(fā)揮著重要的生理和病生理調(diào)節(jié)作用。CSE主要分布在心臟和血管平滑肌組織[10]。本研究室前期研究表明內(nèi)源性H2S參與了急性心肌缺血的病理生理過程，H2S后處理可以減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制心肌細胞凋亡，從而減輕保護缺血心肌。關(guān)于H2S與TXNIP/TRX、MAO等研究表明內(nèi)源性H2S可以調(diào)節(jié)TXNIP/TRX系統(tǒng)，促進TRX與TXNIP解離，提高細胞抗氧化損傷能力，保護腎臟足細胞免于阿霉素所致?lián)p傷[11]。在肝細胞，抑制H2S產(chǎn)生的酶CSE活性可以使TRX活性降低，促進TXNIP/TRX的相互作用從而加速細胞的死亡[12]。說明H2S抗氧化活性的發(fā)揮與TXNIP/TRX系統(tǒng)密切相關(guān)。

五味子乙素是從五味子中提純出來的活性單體二苯并環(huán)十八二烯木聚糖，研究表明五味子乙素在體內(nèi)外具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等活性[13,14]。本研究通過建立急性心肌缺血模型給予不同劑量五味子乙素干預(yù)，觀察五味子乙素的抗氧化作用以及對內(nèi)源性H2S和TXNIP/TRX系統(tǒng)的的影響，進一步明確五味子乙素的心肌保護機制。

本結(jié)果表明，大鼠心肌缺血時給予40、80 mg/kg的Sch B干預(yù)，能夠改善大鼠心臟功能，降低心肌梗死面積，減輕心肌組織的形態(tài)學(xué)損傷。本研究結(jié)果還顯示給予Sch B預(yù)處理可以增加心肌組織中CSE酶的活性和血清中H2S的含量，同時維持了心肌缺血大鼠心肌GSH的水平并減少了LPO的過度累積，下調(diào)心肌組織中TXNIP蛋白的表達以及上調(diào)TRX蛋白的表達，抑制活性氧生成酶NOX-4及細胞凋亡效應(yīng)分子和執(zhí)行者Caspase-3的表達，從而減輕了心肌缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用。