王冬雪，滿佳旭，武思敏，高梓琪，羅桂琴，張冬英

（云南農(nóng)業(yè)大學，云南 昆明 650201）

云南是我國茶葉的發(fā)源地、原產(chǎn)地，擁有豐富的茶葉資源以及大葉茶種資源，經(jīng)過數(shù)十年的調(diào)查和采集，已經(jīng)形成了世界上最大的全國大葉茶種質(zhì)資源基地［1］。云南大葉種茶樹最顯著的特征是“葉大，芽肥，多毫，梗嫩”［2］。目前，以大葉種茶為試樣的研究多集中于茶多酚、咖啡堿等含量的分析和測定上，對于酯型兒茶素的研究則多集中于生物合成、水解和含量分析等，其亞細胞水平的研究文獻相對較少［3-9］。因此，準確定位茶樹中酯型兒茶素的亞細胞對于研究酯型兒茶素的生物合成途徑、生理功能是十分必要的。由于普通的組織化學定位染色試劑不能特異性地識別酯型兒茶素，所以茶樹中酯型兒茶素的亞細胞定位一直存在爭議。免疫組織化學染色法是利用抗原與特異性抗體結(jié)合的原理，通過化學反應使帶有熒光素、酶、金屬離子、同位素等標記的特異性抗體結(jié)合，來確定組織細胞內(nèi)抗原的一種研究方法。就大葉種茶的酯型兒茶素定位而言，該方法相較于其他方法更可靠［10-16］。

本試驗通過高效液相色譜法(HPLC)對5種大葉種茶進行酯型兒茶素含量測定；探究了不同固定時間對茶葉中酯型兒茶素亞細胞定位的影響；觀察了不同染色法對茶葉組織的細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的處理效果；應用免疫組織化學染色法對茶樹中酯型兒茶素進行了亞細胞定位研究，以期明確酯型兒茶素的亞細胞定位，為大葉種茶資源的開發(fā)利用研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 試驗材料

選取云瑰、紫鵑、長葉白毫、云梅、短節(jié)白毫茶樣的1芽1~2葉，均來源于云南普洱茶樹良種場。

1.2 試劑

中性紅購于上海源葉生物科技有限公司；OCT包埋劑、ABC試劑盒、蘇木素均購于美國；多聚甲醛購于天津市科密歐化學試劑有限公司；中性樹膠購于中國上海標本模型廠；DAB試劑盒購于天根生化科技有限公司；PBS購于北京索萊寶科技有限公司；三氟乙酸購于德國MERCK；氯化鈣購于西隴化工股份有限公司；酯型兒茶素抗體，由本實驗室自制。

1.3 儀器

高效液相色譜儀，由安捷倫有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫培養(yǎng)箱，由上?！憧茖W儀器有限公司生產(chǎn)；冷凍切片機、熒光顯微鏡，均由Leica有限公司生產(chǎn)；烘片儀，由HESTION有限公司生產(chǎn)；低速離心機，由中佳有限公司生產(chǎn)；超聲波清洗機，由上?？茖С晝x器有限公司生產(chǎn)；漩渦混合器，由上海凡勁儀器設備有限公司生產(chǎn)；4 ℃、-80 ℃冰箱，由海爾特種設備有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 HPLC法測定茶樹中酯型兒茶素含量

將茶葉用清水沖洗，擦干后用液氮研磨至茶粉狀；取茶粉0.2 g放入10 mL的離心管中，加入5 mL 70%甲醇水溶液（70 ℃水浴鍋預熱），震蕩均勻后，立即放入70 ℃的水浴鍋，浸提10 min，冷卻至室溫，重復3次，離心10 min，轉(zhuǎn)速為3500 r/min，取上清液至10 mL的容量瓶中。重復上述步驟再次提取剩余物。將2次的萃取液混合到10 mL容量瓶搖勻，用0.45 μm有機相濾膜過濾。取2 mL上清液至另一個10 mL的容量瓶，用穩(wěn)定溶液定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的有機相濾膜過濾，待用。高效液相色譜條件參見文獻［16］。

2.2 不同染色法對茶葉組織的細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的處理效果

新鮮茶樣切片：將新鮮幼嫩茶葉固定于福爾馬林中24 h后，用UP水清洗3次，使用刀片將茶芽橫切，使用OCT包埋劑進行包埋。將包埋好的樣品置于-80 ℃冰箱中冷凍定型，定型后使用冷凍切片機將茶樣沿橫截面切成5~10 μm的薄片，并黏附于載玻片上，然后將載玻片置于37 ℃烘箱中烘干30 min，然后，置于流水輕輕沖洗15 min，除去多余的包埋劑。顯微鏡觀察，拍照。

中性紅染色法：取新鮮的茶樹芽樣品于福爾馬林中固定24 h，用刀片切至5 mm長的小段，用OCT包埋劑包埋，放在-80 ℃冰箱中冰凍，然后用冷凍切片機快速切片、展片。用蒸餾水沖洗，隨后用0.5%中性紅溶液染色，再用自來水緩慢沖洗20 min，顯微鏡觀察，拍照。

蘇木素染色法：取新鮮的茶樹芽樣品于福爾馬林中固定24 h后，用手術(shù)刀片切至5 mm長的小段，用OCT包埋劑包埋，放在-80 ℃冰箱中冰凍，用冷凍切片機快速切片、展片。用蒸餾水水洗，隨后用蘇木素染料染色，再用自來水緩慢洗滌，顯微鏡觀察，拍照。

2.3 不同固定時間對茶葉中酯型兒茶素亞細胞定位的影響

為了探究不同固定時間對酯型兒茶素亞細胞定位效果的影響，取新鮮的茶樹嫩芽芽樣，分成10份分別放入50 mL離心管中，分別固定1、3、5、7、11、15、20、28、35、42 d后，包埋冷凍切片，進行免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察，拍照。

2.4 酯型兒茶素亞細胞的定位

應用本實驗室自制的酯型兒茶素抗體進行染色。具體步驟：取新鮮幼嫩茶葉于福爾馬林中固定24 h，將固定好的茶葉置于UP水中清洗3次。用刀片切至5 mm長的小段，用OCT包埋劑包埋，在-80 ℃冰箱中冷凍定型；再用冷凍切片機快速切成5~10 μm的薄片，展片。將載玻片置于37 ℃烘箱中烘干30 min。用免疫組化筆劃定抗體鋪放區(qū)域［16］，用4% PFA在室溫下固定1 min，用PBS洗3次/2 min。用0.5% PBT在室溫下處理1 min，加過氧化物酶阻斷劑B，在37 ℃孵育箱中孵育20 min，再用PBS洗5 min。隨后用封閉血清封閉，在37 ℃孵育箱中孵育30 min，傾去血清，鋪一抗置于4 ℃冰箱中過夜，次日回收一抗，用PBS洗5 min。鋪生物素標記的二抗在37 ℃孵育箱中孵育30 min；用PBS洗5 min，加ABC試劑在37 ℃孵育箱中孵育30 min；用PBS洗5 min，加過氧化物酶底物（DAB）室溫避光孵育15 min，用流水緩慢沖洗5 min，蘇木素染色，流水緩慢沖洗15 min后，中性樹膠封片，烘片儀上烘干，顯微鏡觀察，拍照［17］。

2.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和整理，采用GraphPad Prism 8軟件進行聚類分析和方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 大葉種茶樹中酯型兒茶素含量的測定結(jié)果

酯型兒茶素主要由EGCG和ECG組成，是茶葉中主要的功能性成分，對茶樹的生長發(fā)育具有極其重要的作用。通過HPLC法測定，茶樹中酯型兒茶素的含量見表1。由表1可知，EGCG的含量大小依次為紫鵑（19.7%）＞云瑰（19.2%）＞長葉白毫（13.1%）＞短節(jié)白毫（10.4%）＞云梅（6.4%）。ECG的含量大小依次為云瑰（28.5%）＞紫鵑（6.1%）＞長葉白毫（5.1%）＞云梅（0.8%）＞短節(jié)白毫（0）。酯型兒茶素含量：云瑰最高，為47.7%；紫鵑、長葉白毫、云梅、短節(jié)白毫的酯型兒茶素含量分別為19.8%、18.2%、12.3%、11.2%。

3.2 不同染色法對茶葉組織的細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的處理效果

在本研究中，以核特異性染料蘇木精染色后可以觀察細胞核的大小、形態(tài)，中性紅染色后可以觀察細胞的液泡大小、形態(tài)（圖1）。從圖1A中可知，中間海綿組織、柵欄組織中含大量深紫色的粒子，為細胞核。圖1B中，暗紅色圓形小泡是液泡，大量液泡呈現(xiàn)暗紅色，輪廓清晰，染色效果良好。液泡周圍散布著許多小的橢圓形和不規(guī)則的葉綠體。圖1C為圖1B放大后，在10×100倍油鏡下觀察的效果圖，可以更清晰地觀察到中性紅染色后的液泡形態(tài)，同時也可以與葉綠體形態(tài)進行對比和鑒別。圖1D為新鮮葉片未進行染色，直接在10×100倍油鏡下觀察的液泡與葉綠體形態(tài)，為后期酯型兒茶素的亞細胞定位研究提供了細胞形態(tài)辨別的基礎。

表1 各品種鮮茶葉的酯型兒茶素含量 g/100 g

圖1 不同染色法對茶葉組織的細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的處理效果

3.3 不同固定時間對茶葉中酯型兒茶素亞細胞定位的影響

從組織學角度分析，固定可以維持細胞和組織固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而減少內(nèi)源或外源性酶之間的反應，防止細胞自溶、抗原擴散，保持組織的抗原性，避免免疫組化染色時背景顏色過深而影響免疫組化的最終效果和判斷。故不同固定時間對酯型兒茶素亞細胞定位會產(chǎn)生不同的影響，可以對其保存時間進行篩選，以確認茶葉的保存期限，即可以避免實驗只能短期內(nèi)進行的困擾，延長實驗周期。

不同固定時間酯型兒茶素染色效果見圖2。結(jié)合前期課題組的實驗結(jié)果，從圖2可以看出，茶葉切片中分布較多的黃綠色、橢圓形的部分是液泡，在不同固定時間下，液泡形態(tài)和抗體結(jié)合的效果都保持較好，無明顯差異。將固定時間延長至42 d，茶葉組織狀態(tài)無明顯差異，免疫組織化學染色法染色后抗體結(jié)合效果依舊良好，表明茶葉的固定時間至少為42 d，且對茶葉中酯型兒茶素亞細胞定位無影響。

圖2 不同固定時間對茶葉中酯型兒茶素的染色效果

3.4 酯型兒茶素在亞細胞中的定位

研究表明，酯型兒茶素可以在植物細胞的眾多部位積累，如光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、高爾基體、液泡、細胞壁甚至細胞核內(nèi)都有多酚類物質(zhì)的積累，但目前認為酯型兒茶素主要積累于葉綠體和液泡中，但茶樹中酯型兒茶素的亞細胞定位究竟是在葉綠體還是在液泡中則一直存在著爭議［16］。本文選取云南種云瑰（A）、云梅（B）、紫鵑（C）、長葉白毫（D）、短節(jié)白毫（E）5種大葉種的茶芽切片進行免疫組織化學染色。結(jié)果如圖3所示，在10×100倍油鏡下觀察，5種茶樣內(nèi)部剖面略有差別，在茶樹芽組織中，酯型兒茶素抗體結(jié)合部位均呈橢圓狀，與3.2中的中性紅染色后液泡結(jié)合位置一致；而葉綠體未著色，可以確定在亞細胞水平上，5種茶樣的酯型兒茶素在亞細胞水平上定位于液泡中。

圖3 茶芽中酯型兒茶素的亞細胞定位結(jié)果

4 討論

酯型兒茶素作為兒茶素的重要組成成分，是茶飲料的抗氧化、抗菌、抗病毒和抗動脈硬化等保健功效的主要成分。酯型兒茶素不能人工合成，茶葉是其唯一來源，茶樹中酯型兒茶素的生物合成途徑及其亞細胞定位研究也一直備受茶業(yè)界的關(guān)注。免疫組織化學法被廣泛應用于生物化學研究中，能定位細胞或組織中小分子物質(zhì)的特定表位。就茶樹中酯型兒茶素的亞細胞定位而言，免疫組織化學染色法非常適用于酯型兒茶素這種小分子的定位。徐歡歡［16］對大葉種云抗十號茶樹芽樣品進行了亞細胞定位研究，發(fā)現(xiàn)酯型兒茶素在亞細胞水平上在液泡中累積。本文在此基礎上選取了5種大葉種茶樹進行進一步實驗驗證，通過HPLC分析，確定了茶樹中酯型兒茶素的含量，并探究了不同固定時間對于酯型兒茶素的影響，將固定時間延長至42 d，細胞狀態(tài)保持較好，染色效果無差異，表明茶葉的固定時間至少為42 d，且對茶葉中酯型兒茶素亞細胞定位無影響。采用不同染色法對茶葉組織中的細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)處理的效果進行觀察，所獲結(jié)果為后期酯型兒茶素亞細胞定位研究奠定了基礎。應用免疫組織化學染色法對茶樣中酯型兒茶素進行亞細胞定位，根據(jù)植物學組織形態(tài)進行判斷，抗體結(jié)合位置與液泡位置重合度較高，說明茶樹中酯型兒茶素在亞細胞水平上主要定位于液泡中，這為酯型兒茶素的合成、運輸、儲存和生理作用的研究奠定了理論基礎，同時為大葉種茶葉的選育、品質(zhì)改善等提供了較好的參考依據(jù)［18-20］。