李 琦，支 愛，何學(xué)明，沈 飛 ，邢常瑞，F(xiàn)irew Tafesse Mamo

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，南京 210023) (江蘇高?，F(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心2，南京 210023) (巴赫達(dá)爾大學(xué)埃塞俄比亞生物技術(shù)研究所3，亞的斯亞貝巴 5954)

蛋白質(zhì)是人體細(xì)胞、組織和器官的重要組成成分，是人類飲食中的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在維持人體健康方面起著至關(guān)重要的作用[1]。與動(dòng)物蛋白相比，糧油植物蛋白的功能性相對(duì)較低，如水溶性差、對(duì)環(huán)境脅迫條件如酸度、鹽和溫度的敏感性及復(fù)雜性限制了其在各工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展[2]。但植物蛋白具有低脂、不含膽固醇，富含膳食纖維、活性物質(zhì)等優(yōu)勢(shì)，且攝入高質(zhì)量的植物蛋白可降低患多種代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。糧油植物蛋白主要來(lái)源于谷物(小麥、玉米、高粱等)、豆類(大豆、豌豆、蕓豆等)、油籽(花生、芝麻、油菜籽等)等農(nóng)作物及其副產(chǎn)品[4]，具有抗氧化性[4]、乳化性[5]、持水性和凝膠性[6]等功能，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品及包裝材料等領(lǐng)域。因此，植物蛋白質(zhì)被認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)成本低、環(huán)境友好型和可再生性的動(dòng)物蛋白質(zhì)的替代品[7]。我國(guó)的糧食作物含有較多植物蛋白，其中大豆蛋白占比較高，不僅是我國(guó)重要的糧食作物，還是植物中蛋白含量最豐富，氨基酸組成最均衡，最有望成為動(dòng)物蛋白替代品的農(nóng)產(chǎn)品。對(duì)于蛋白而言，其結(jié)構(gòu)決定功能，故合理有效的蛋白質(zhì)改性方法可改善其功能特性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官特性，進(jìn)而拓寬植物蛋白在各領(lǐng)域的應(yīng)用[8]。目前，蛋白質(zhì)的改性方法包括物理改性、化學(xué)改性、酶法改性和基因工程改性[3]，新興的幾種物理改性介紹如表1所示。

低溫等離子體是一種非熱、安全、環(huán)保的物理改性技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于污水凈化、高分子材料印刷、聚合材料改善等領(lǐng)域，是當(dāng)下食品非熱加工的一個(gè)研究熱點(diǎn)[15]。低溫等離子體是通過(guò)自身產(chǎn)生的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)、活性氮(Reactive Nitrogen Species，RNS)、自由基及高速電子打破蛋白質(zhì)中共價(jià)鍵并引發(fā)各種化學(xué)反應(yīng)而對(duì)食品表面進(jìn)行改性的方法[16]，適用于熱敏性食品[17]，可在無(wú)外源添加劑的條件下對(duì)食品進(jìn)行清潔、殺菌和改性[18]，既能較好保持食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也能改善食品功能特性。

表1 幾種蛋白質(zhì)物理改性方法介紹

因此，低溫等離子體技術(shù)在食品加工領(lǐng)域具有重要的探索意義，國(guó)外已廣泛將該技術(shù)用于植物蛋白改性，但國(guó)內(nèi)研究較少，故本文對(duì)該技術(shù)在植物蛋白質(zhì)改性中的應(yīng)用進(jìn)行了概述，并對(duì)低溫等離子體改性蛋白的機(jī)理及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系進(jìn)行了簡(jiǎn)要闡述，以期為今后進(jìn)行該領(lǐng)域的研究提供參考。

1 低溫等離子體作用原理

低溫等離子體(Cold plasma)是指中性氣體在室溫條件下，通過(guò)微波、光脈沖、交流電和直流電等多種激發(fā)源產(chǎn)生的帶電粒子(電子、離子)和不帶電粒子(分子、激發(fā)態(tài)原子、亞穩(wěn)態(tài)原子、自由基)以及紫外線、γ射線、β射線等，被稱為繼固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)之外的第四態(tài)[19,20]。目前，國(guó)內(nèi)在低溫等離子體改性蛋白質(zhì)領(lǐng)域進(jìn)行了諸多研究，但對(duì)蛋白質(zhì)改性的機(jī)制解析鮮見報(bào)道。因此，以現(xiàn)有低溫等離子體在食品殺菌、農(nóng)殘降解、材料改性等方面的研究為基礎(chǔ)，對(duì)低溫等離子體對(duì)蛋白質(zhì)改性機(jī)理進(jìn)行簡(jiǎn)要概括，其改性機(jī)理見圖1。

低溫等離子體對(duì)蛋白質(zhì)改性的機(jī)理一般包括ROS、RNS及自由基的氧化作用，紫外線的光子蝕刻作用，以及激發(fā)態(tài)或非激發(fā)態(tài)原子和分子的蝕刻作用，其具體作用為：

pH作用：經(jīng)研究，pH降低主要與幾個(gè)原因有關(guān)：1)等離子體中的ROS、RNS及自由基等一些活性成分直接或間接參與蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生酸性物質(zhì)[21]；2)空氣氣體經(jīng)電場(chǎng)作用產(chǎn)生氮氧化物與水作用生成亞硝酸(HNO2)和硝酸(HNO3)[22]；3)高能電子或離子轟擊蛋白質(zhì)溶液產(chǎn)生酸性離子(H3O+)[23]。這些物化反應(yīng)均會(huì)改變處理樣品的 pH。蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)處，蛋白質(zhì)溶解度最小，會(huì)發(fā)生變性沉淀[24,25]。當(dāng)溶液 pH 偏離蛋白質(zhì)等電點(diǎn) 0.5 pH單位以上時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度增加[24]。因此，蛋白質(zhì)在不同 pH 條件下會(huì)發(fā)生不同程度的變性，且環(huán)境中的酸性、堿性基團(tuán)也會(huì)在其他因素作用下與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)改性。但是，等離子體處理樣品時(shí)，pH 值作用多適用于液體樣品，通過(guò)水的電離及與CO2間的相互作用使溶液呈酸性進(jìn)而改性蛋白質(zhì)；所以，當(dāng)樣品水分含量低時(shí)，樣品 pH 幾乎不變，作用效果一般。

紫外光作用：等離子體形成過(guò)程會(huì)伴隨著光輻射，其中包括紫外線和可見光[20]。紫外光子的光解作用會(huì)打破蛋白質(zhì)分子間鍵，破壞其氨基酸的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)失活[26]。由于紫外線可被色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)等芳香族氨基酸吸收，所以紫外線輻射會(huì)誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)變化，產(chǎn)生化學(xué)修飾[27]。Kumar 等[28]證實(shí)了紫外光會(huì)誘導(dǎo)小麥粉中蛋白主鏈及其構(gòu)像改變，進(jìn)而影響小麥粉蛋白的功能性質(zhì)。有研究證明，正常條件下，紫外線極易被空氣和水等介質(zhì)吸收，所以對(duì)蛋白質(zhì)溶液改性的作用有限[29,30]。紫外線的產(chǎn)生需要低溫等離子體在高壓條件下激發(fā)，較低電壓的等離子體處理產(chǎn)生的紫外線極少，部分還被介質(zhì)吸收，故對(duì)蛋白改性的效果極微；較高電壓的等離子體處理可產(chǎn)生較多的紫外線，但較高電壓會(huì)對(duì)蛋白功能特性產(chǎn)生不利影響。因此，紫外光作用對(duì)蛋白改性具有局限性。

圖1 蛋白質(zhì)改性機(jī)理

活性粒子氧化作用：低溫等離子體體系中反應(yīng)物經(jīng)電場(chǎng)作用產(chǎn)生大量氧自由基(·O)、羥自由基(·OH)、臭氧(O3)、二氧化氮(NO2)等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)分子相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸殘基進(jìn)行修飾，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[31,32]。劉志偉等[33]在介質(zhì)阻擋放電等離子體處理誘導(dǎo)氧化降低 IgG/IgE 的結(jié)合能力并提高甘氨酸的功能性研究中表明，甘氨酸的IgG/IgE結(jié)合能力下降與氨基酸間肽鍵的氧化及敏感氨基酸(Trp、Tyr、Phe)的氧化有關(guān)，這些氧化修飾會(huì)破壞分子間氫鍵和氨基酸間的其他非共價(jià)相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)改性。低溫等離子體改性蛋白質(zhì)的關(guān)鍵物質(zhì)是活性氧與活性氮，它們可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)鍵的變化及氨基酸側(cè)鏈的氧化等結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)功能特性。蛋白質(zhì)與活性粒子間的相互作用通常發(fā)生在蛋白質(zhì)表面幾納米到幾十納米之間，故活性粒子的氧化作用多作用于蛋白質(zhì)表面，蛋白改性程度與蛋白質(zhì)和活性粒子接觸的比表面積有關(guān)。因此，利用等離子體處理蛋白粉末時(shí)，可采用過(guò)篩的方法控制蛋白粉末的粒徑，進(jìn)一步擴(kuò)大蛋白粉的比表面積，從而達(dá)到良好的改性目的。

高速粒子蝕刻作用：低溫等離子體的產(chǎn)生是一個(gè)能量不斷傳遞的過(guò)程，即外加電場(chǎng)使電子獲得能量撞擊周圍氣體，使氣體被激發(fā)電離形成大量電子，且系統(tǒng)中部分原子或分子在放電后期也會(huì)被激發(fā)生成一些高能活性粒子，這些粒子會(huì)與未被激發(fā)的粒子發(fā)生非彈性碰撞，并得到大量活性自由基[34,35]。高能活性粒子在電場(chǎng)作用下會(huì)不斷轟擊蛋白表面產(chǎn)生蝕刻現(xiàn)象，且會(huì)將自身能量傳遞給物質(zhì)表面，誘導(dǎo)物質(zhì)表面的共價(jià)鍵破裂或新化學(xué)鍵形成，進(jìn)而啟動(dòng)一系列化學(xué)反應(yīng)[36]，此現(xiàn)象導(dǎo)致的理化變化包括化學(xué)鍵的斷裂、化學(xué)降解和低分子質(zhì)量片段的去除等[37]。但共價(jià)鍵的破裂和新化學(xué)鍵形成等變化只能發(fā)生在蛋白質(zhì)表面，改性程度有所限制。研究表明，由于放電過(guò)程中的蝕刻作用影響，低溫等離子處理能夠增加聚合物表面的粗糙度或使蛋白表面產(chǎn)生空穴，進(jìn)而對(duì)蛋白進(jìn)行改性[38]。高速粒子蝕刻作用不僅會(huì)使蛋白產(chǎn)生空穴現(xiàn)象，還會(huì)使蛋白粒徑減小，從而加大蛋白與活性粒子的接觸面，更有利于蛋白的改性。

2 低溫等離子體對(duì)植物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)是由多種氨基酸按一定順序通過(guò)肽鍵彼此連接形成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)[39]。大多數(shù)蛋白質(zhì)分子至少存在 3 個(gè)水平的構(gòu)像結(jié)構(gòu)，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，具體結(jié)構(gòu)情況見圖2。蛋白質(zhì)功能特性可分為三類：蛋白質(zhì)與水相互作用，如溶解性、持水力等；蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，凝膠性、沉淀等；蛋白質(zhì)界面性質(zhì)，乳化性、起泡性等[40]。通常，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)行使功能性質(zhì)的基礎(chǔ)，而蛋白質(zhì)各種功能性質(zhì)又是其結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)。因此，在研究蛋白質(zhì)功能改性以拓寬其應(yīng)用時(shí)，應(yīng)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面探討。

圖2 蛋白質(zhì)構(gòu)像結(jié)構(gòu)

2.1 表面微觀結(jié)構(gòu)

低溫等離子體處理作為一種有效的表面改性技術(shù)，能顯著改變材料表面的形貌。如低溫等離子體產(chǎn)生的高能粒子在電場(chǎng)作用下會(huì)不斷撞擊蛋白質(zhì)分子表面，以改變蛋白質(zhì)外觀，對(duì)其產(chǎn)生一定的物理修飾作用[39]；存在的活性粒子及自由基會(huì)與蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基發(fā)生氧化反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)修飾，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)形態(tài)。通常采用掃描電子顯微鏡觀察低溫等離子體處理前后蛋白質(zhì)表面微觀結(jié)構(gòu)的變化。Dong 等[42]分別采用 50、75、100、125 V電壓的大氣低溫等離子體處理玉米蛋白粉，結(jié)果表明低溫等離子體處理后的蛋白質(zhì)表面粗糙，未處理樣品的表面光滑，隨處理電壓升高，光滑表面逐漸消失，出現(xiàn)不規(guī)則扭曲和破裂，處理電壓達(dá)到75 V 時(shí)，樣品表面出現(xiàn)明顯的空腔現(xiàn)象，是由低溫等離子體處理時(shí)產(chǎn)生的高速粒子碰撞造成，且隨電壓增大，粒子間碰撞越激烈，蛋白表面越粗糙，但功能性在高電壓下會(huì)變差。Sharafodin 等[43]探究介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體在大豆分離蛋白理化性質(zhì)修飾中的潛在應(yīng)用時(shí)，分別采用不同時(shí)間和電壓處理樣品，結(jié)果表明，等離子體處理的樣品表面根據(jù)處理電壓不同出現(xiàn)不同大小的孔穴，主要由高速等離子體流產(chǎn)生的太陽(yáng)風(fēng)使蛋白質(zhì)分子間相互碰撞及等離子體中的高能電子、離子和其他類型活性粒子與蛋白表面相互作用這兩種方式造成，并表明不是蛋白表面改性越大，蛋白功能特性越優(yōu)異，當(dāng)其電壓達(dá)到20 kV并處理15 min 時(shí)，蛋白功能特性出現(xiàn)顯著下降。低溫等離子體處理可通過(guò)蝕刻作用改變蛋白質(zhì)分子表面，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生物理修飾作用，但研究者需通過(guò)控制蛋白處理量及處理?xiàng)l件來(lái)達(dá)到相應(yīng)的改性效果。此外，低溫等離子體對(duì)蛋白表面的作用程度并不與蛋白的功能特性成正相關(guān)，且處理不同蛋白時(shí)的作用效果不同，故使用等離子體改性蛋白時(shí)應(yīng)對(duì)其處理?xiàng)l件進(jìn)行探索。

2.2表面疏水性

蛋白質(zhì)表面疏水性是指蛋白質(zhì)表面與極性溶液環(huán)境接觸時(shí)的疏水基團(tuán)數(shù)量，主要取決于芳香族和脂肪族氨基酸殘基的暴露程度[44]。疏水相互作用被認(rèn)為是維系蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，在三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中起著重要的作用[45]。蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)的數(shù)量會(huì)影響蛋白質(zhì)分子在水溶液中的膠束大小，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的溶解性。因此，蛋白質(zhì)表面疏水性是研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，通常采用 ANS 發(fā)射熒光探針測(cè)定蛋白質(zhì)表面的疏水性。Ji 等[46]采用 35 V 介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體分別對(duì)花生分離蛋白溶液處理 1、2、3、4 min 后發(fā)現(xiàn)，花生分離蛋白表面疏水性隨處理時(shí)間的增加逐漸降低，表明蛋白間疏水相互作用減少，親水作用增加，蛋白質(zhì)的溶解度也相應(yīng)增加，疏水性的降低是由蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露引起。經(jīng)研究證明，蛋白疏水性的變化主要由親水基團(tuán)的引入和蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露有關(guān)。此外，蛋白質(zhì)粒徑的大小也會(huì)因比表面積的變化來(lái)影響疏水基團(tuán)的暴露比，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的疏水性。Dong等[41]在接觸角分析中也得出相應(yīng)的結(jié)論。有研究認(rèn)為，低溫等離子體處理后親水性提高可能與樣品表面引入的含氧基團(tuán)有關(guān)，可增加了樣品表面的潤(rùn)濕性[47-49]。但是，低溫等離子體處理蛋白質(zhì)并不總是降低蛋白表面的疏水性，季慧等[50]在常壓低溫等離子處理提高花生分離蛋白水合性質(zhì)的研究中表明處理時(shí)間在3 min內(nèi)時(shí)，疏水性逐漸下降，花生分離蛋白對(duì)水的結(jié)合能力增強(qiáng)，其凝膠持水性(WHC)也相應(yīng)增強(qiáng)，但3 min后，由于蛋白質(zhì)分子展開，暴露更多內(nèi)部疏水基團(tuán)，使得蛋白質(zhì)疏水性又有所增強(qiáng)。因此，低溫等離子體不同處理?xiàng)l件對(duì)蛋白疏水性的影響也不同，且影響疏水性會(huì)受蛋白種類、粒徑、pH等因素的影響，但低溫等離子體可通過(guò)高壓電場(chǎng)作用產(chǎn)生的活性氧、活性氮等活性粒子對(duì)蛋白改性，故采用不同氣體包裝蛋白粉或在處理器中充斥不同氣體成分均會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生不同程度的改性，但尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究，后續(xù)研究應(yīng)針對(duì)不同氣體成分對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響進(jìn)行系統(tǒng)研究。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈借助氫鍵進(jìn)行自身盤繞折疊的方式，主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲，是蛋白質(zhì)形成立體結(jié)構(gòu)的前提[51]。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)是一種很好的生物分析方法[52]，可用于研究化學(xué)鍵的變化，故用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在 FTIR 光譜研究中通常選用酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)的變化分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，該區(qū)域代表了蛋白質(zhì)主干中最突出、最敏感的振動(dòng)帶[53]。研究表明，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)條帶為：α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)、β-折疊(1 618～1 640和1 670～1 690 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 660～1 670和1 690～1 700 cm-1)、無(wú)規(guī)則卷曲(1 645 cm-1)[54]。Ji 等[55]在大氣壓低溫等離子體(ACP)處理花生蛋白分離物的研究中表明，ACP 處理 3 min 時(shí)，處理組樣品與未處理組相比，β-轉(zhuǎn)角含量呈增加的趨勢(shì)，但β-折疊含量則出現(xiàn)明顯下降；當(dāng)處理時(shí)間超過(guò) 3 min 時(shí)，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲含量增加，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量有所下降，花生分離蛋白的結(jié)構(gòu)經(jīng)處理后被破壞，蛋白構(gòu)象從致密、折疊變成展開、松散，該研究的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化與 Misra 等[69]在大氣低溫等離子體處理小麥粉的研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的展開、松散與電場(chǎng)下高速粒子的蝕刻作用和活性粒子對(duì)蛋白基團(tuán)的氧化作用有關(guān)，在多種作用下，蛋白質(zhì)的化學(xué)鍵被打開、重新折疊或氧化，從而改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能特性。有研究結(jié)果表明α-螺旋、β-折疊均與樣品疏水性有關(guān)，α-螺旋含量越低、β-折疊含量越高其疏水性越大，溶解性就相對(duì)較差，乳化活性也就相對(duì)越好[73]。Ji 等[58]表明，較高的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量可以提高溶解度、持水性和起泡性。因此，并不是β-折疊含量高，其溶解性差，這還要根據(jù)其分子內(nèi)外的β-折疊含量比、疏水基團(tuán)與親水基團(tuán)間的比例等因素影響，結(jié)構(gòu)變化是對(duì)功能性的一種解釋手段，但是否存在必然關(guān)系，其關(guān)系如何需進(jìn)一步研究。大量研究表明，低溫等離子體處理過(guò)程中的蝕刻作用會(huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，產(chǎn)生的活性粒子也會(huì)氧化蛋白質(zhì)的氨基酸基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，最終起到改變蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)的作用。

2.4 游離巰基

巰基(-SH)和二硫鍵(S-S)是蛋白質(zhì)基食品中表達(dá)功能性質(zhì)的兩個(gè)重要功能基團(tuán)，二者間的轉(zhuǎn)換或變化代表著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[58]。維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力——二硫鍵，是蛋白質(zhì)分子中巰基氧化形成。氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)中含有對(duì)氧敏感的巰基和芳香基，易被活性粒子氧化，其中半胱氨酸最為敏感[59]。此外，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的共價(jià)鍵(S—S 鍵、C—S 鍵)之間的裂解能較低，在等離子體處理過(guò)程中很容易發(fā)生裂解[60]。巰基和二硫鍵的變化會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其功能特性，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，通常采用分光光度法測(cè)定。Segat 等[61]在大氣壓低溫等離子體(ACP)處理乳清分離蛋白模型溶液的研究中表明，與對(duì)照組相比，處理組樣品中的游離巰基隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，游離巰基的含量逐漸降低，在 ACP 處理 10 min時(shí)，-SH含量降到初始值的一半，故表明ACP會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在的半胱氨酸巰基丟失。研究結(jié)果表明，巰基經(jīng)過(guò)氧化會(huì)轉(zhuǎn)變成分子間的二硫鍵，從而加強(qiáng)分子間的穩(wěn)定性，與薄膜結(jié)構(gòu)間存在良好的相關(guān)性。季慧等[62]在低溫等離子體處理對(duì)花生分離蛋白溶解行為的研究中分別采用 1、2、3、4 min處理樣品，結(jié)果顯示，經(jīng)處理后花生蛋白中的總巰基含量逐漸減少，在處理3 min時(shí)，總巰基含量與未處理樣品相比，降低了50%，這與巰基被氧化成二硫鍵有關(guān)，隨后總巰基含量有所增加是因?yàn)楦吣芰Ｗ拥霓Z擊使生成的二硫鍵斷裂重新形成巰基。故低溫等離子體處理蛋白時(shí)，巰基含量的變化趨勢(shì)并不是一成不變的，當(dāng)處理?xiàng)l件不同時(shí)，不同的作用方式會(huì)對(duì)巰基含量產(chǎn)生不同的影響。游離巰基并不是隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而無(wú)限增加的，適當(dāng)?shù)牡入x子體處理會(huì)使蛋白分子中的巰基氧化生成二硫鍵，過(guò)度處理則會(huì)使形成的二硫鍵再次斷裂。而且，低溫等離子體是一個(gè)復(fù)雜的體系，其處理對(duì)蛋白質(zhì)的影響是相互作用的結(jié)果，故在用低溫等離子體改性蛋白時(shí)應(yīng)針對(duì)不同蛋白探索相應(yīng)的處理參數(shù)，并將該蛋白質(zhì)性能修飾到最佳效果。

2.5 分子質(zhì)量分布

蛋白質(zhì)大多是由多個(gè)亞基通過(guò)二硫鍵結(jié)合而成的大分子物質(zhì)，若二硫鍵被破壞，構(gòu)成蛋白質(zhì)的亞基分開，其結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量也會(huì)相應(yīng)發(fā)生改變。因此，測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的重要參數(shù)，通常采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定，表征蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和其組成。SDS-PAGE 可通過(guò)SDS消除蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異和分子形狀差異，從而使該電泳速度只取決于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小。Mahdavian 等[63]對(duì)草豆(甘草豆)分離蛋白(GPPI)納米顆粒分別采用 9.4、18.6 kVpp的大氣低溫等離子體處理300、600 s，其 SDS-PAGE 結(jié)果顯示，非還原條件下，草豆分離蛋白在高壓和長(zhǎng)時(shí)間處理后分子質(zhì)量發(fā)生改變，且在酸性和堿性條件下的亞基也存在不同程度的變化，還會(huì)出現(xiàn)新的亞基條帶，新亞基條帶的出現(xiàn)主要是由物理和化學(xué)蝕刻作用使原始蛋白聚集體破壞，使其碎片化造成的。根據(jù) Segat 等[59]的研究表明，蛋白分子質(zhì)量的變化主要與二硫鍵的變化或硫醇在等離子體處理過(guò)程中過(guò)度氧化有關(guān)。通常，蛋白質(zhì)是由肽鏈經(jīng)二硫鍵連接并折疊盤區(qū)而成的，二硫鍵的斷裂會(huì)使蛋白小亞基條帶增多，相反，二硫鍵的形成會(huì)出現(xiàn)較大亞基條帶，但二硫鍵的變化不會(huì)影響蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。這表明二硫鍵的斷裂會(huì)使原蛋白聚集體解聚，形成小分子亞基，但蛋白質(zhì)的主要條帶不變，即該處理不會(huì)改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，適當(dāng)?shù)蜏氐入x子體處理可在不改變蛋白質(zhì)分子主要條帶的前提下使蛋白質(zhì)分子展開，改善蛋白質(zhì)功能。但較高電壓或較長(zhǎng)處理時(shí)間的等離子體處理會(huì)因二硫鍵的再次形成而使較小分子亞基間鍵合形成較大亞基，但是否會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)分子主要條帶產(chǎn)生影響還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語(yǔ)及展望

在糧油食品加工過(guò)程中，由于低溫等離子體處理屬于非熱加工，所以對(duì)處理樣品的理化性質(zhì)及感官性質(zhì)影響較小，可最大程度的保持原有品質(zhì)。低溫等離子體改性蛋白質(zhì)的機(jī)理主要是高速粒子對(duì)蛋白表面的蝕刻作用和活性粒子與蛋白質(zhì)氨基酸殘基的相互作用，不會(huì)改變植物蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸組成，且植物蛋白中脂肪含量低，活性粒子的氧化作用并不會(huì)引起大量脂肪酸氧化，進(jìn)而影響植物蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及感官品質(zhì)。但低溫等離子體的作用機(jī)理均局限于蛋白表面，無(wú)法使蛋白徹底改性，且處理?xiàng)l件、處理樣品的種類及樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)均會(huì)影響蛋白質(zhì)的改性效果，故距離現(xiàn)實(shí)應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究。

隨著低溫等離子體(CP)在蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域的應(yīng)用，CP對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的作用機(jī)制需要更深入的探索。此外，單一 CP處理對(duì)蛋白質(zhì)的改性存在一定的局限性，可與一些傳統(tǒng)蛋白質(zhì)改性方法相結(jié)合，如酶法與CP處理結(jié)合、糖基化與CP處理結(jié)合等，以提高蛋白質(zhì)改性的效果。當(dāng)前，大多低溫等離子體改性蛋白的研究均采用介質(zhì)阻擋低溫等離子體，且多將樣品置于培養(yǎng)皿內(nèi)處理，其處理面積及作用效果均受到限制，后續(xù)可針對(duì)蛋白改性設(shè)計(jì)相應(yīng)的等離子體處理器，將樣品直接置于處理器內(nèi)，并向處理器中充入相應(yīng)的改性氣體，從而達(dá)到蛋白改性的目的。最后，CP改性后的蛋白質(zhì)是否存在過(guò)敏性、處理本身是否安全或是否會(huì)存在其他的安全隱患均需進(jìn)行大量毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，以確保 CP改性蛋白質(zhì)的食用安全及使用安全，進(jìn)而為大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展打下基礎(chǔ)。