金紅梅,張 亮

吉林省龍井市智新鎮(zhèn)綜合服務(wù)中心，吉林龍井 133400

1 精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的發(fā)展

1.1 精子可結(jié)合外源DNA

1944年Avery,Macleod和McCarty發(fā)現(xiàn)了DNA是遺傳信息的遺傳庫(kù)，而不是蛋白質(zhì)[1]。1953年Watson和Crick提出了DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，這些影響了現(xiàn)代生物學(xué)的方向，并為當(dāng)前基因組學(xué)研究的暴發(fā)提供了基礎(chǔ)。動(dòng)物體的遺傳性狀和細(xì)胞特性都可以通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移外源DNA片段來(lái)修飾。利用外源DNA對(duì)細(xì)胞性狀進(jìn)行基因修飾的實(shí)驗(yàn)反映了自然界中目前存在的一種稱為水平或橫向基因轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，它包括遺傳信息跨越遠(yuǎn)親生物（如真核生物和低等真核生物）之間的交配障礙的傳遞，隨著不斷地研究，動(dòng)物中也有報(bào)道[2]。

在眾多已被證明可接受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，成熟的精子一直是一個(gè)例外。精子細(xì)胞在基因傳遞實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有被測(cè)試為可能的受體細(xì)胞，甚至在理論上也沒(méi)有被認(rèn)為是外源DNA傳染的合理候選者。這種先入為主的排斥長(zhǎng)期以來(lái)一直沒(méi)有受到科學(xué)界的質(zhì)疑，但后來(lái)被認(rèn)為是一種不需要實(shí)驗(yàn)證明就能解釋的證據(jù)，即精子是高度緊湊的細(xì)胞、代謝緩慢、外源分子幾乎無(wú)法穿透。這種觀點(diǎn)是由于精子與其它體細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上截然不同導(dǎo)致的，這種形態(tài)上的不同包括：提供運(yùn)動(dòng)能力的長(zhǎng)管狀鞭毛，其內(nèi)幾乎完全無(wú)細(xì)胞質(zhì)、高度濃縮的染色質(zhì)組織緊密包裹在精子頭部的核-精蛋白復(fù)合體。這些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征似乎與復(fù)雜的生物化學(xué)功能或細(xì)胞活動(dòng)不相容，這導(dǎo)致了精子是代謝緩慢細(xì)胞的想法[3]。其獨(dú)特的和唯一的功能是受精過(guò)程中傳遞父系基因組。隨著對(duì)精子細(xì)胞深入研究，應(yīng)用微球菌和胰腺核酸酶消化法處理海膽精子染色質(zhì)組織中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是使用基于細(xì)胞核分離的經(jīng)典方案，還是通過(guò)簡(jiǎn)單地將核酸添加到緩沖的海水中（完整的精子具備活性），染色質(zhì)裂解都能同樣良好地產(chǎn)生，在后一種情況下，精子迅速停止移動(dòng)，DNA提取后，產(chǎn)生經(jīng)典的核小體。這些觀察結(jié)果表明，在沒(méi)有任何處理精子的情況下，添加到培養(yǎng)基中的核酸酶能夠穿過(guò)血漿和核膜，并獲得活精子的染色體DNA。

1.2 精子具有結(jié)合外源DNA的能力

盡管精子的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)明顯是惰性的，但它實(shí)際上儲(chǔ)存了大量的異質(zhì)RNA種群，其中包括數(shù)前信使RNA和micRNA。成熟精子中轉(zhuǎn)錄序列的鑒定與異質(zhì)RNA也存在轉(zhuǎn)錄因子集合的發(fā)現(xiàn)是一致的，這種RNA的一部分被認(rèn)為是通過(guò)線粒體核糖體裝備在精子細(xì)胞內(nèi)，另一部分則是在受精時(shí)被傳遞到卵母細(xì)胞中，這意味著精子對(duì)合子的貢獻(xiàn)不限于父代的基因組，還包括基本的RNA細(xì)胞[4]。事實(shí)上，現(xiàn)在人們已經(jīng)承認(rèn)受精過(guò)程中精子在遺傳信息的傳遞過(guò)程中扮演者重要的作用及角色。例如，發(fā)現(xiàn)精子RNA分子可介導(dǎo)小鼠表觀遺傳性狀的非孟德?tīng)栠z傳，就引出了這種復(fù)雜的作用。此外，精子內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶依賴機(jī)制可以在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生和繁殖具有轉(zhuǎn)錄能力的逆轉(zhuǎn)錄基因。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：是指應(yīng)用特定的轉(zhuǎn)基因方法改變動(dòng)物遺傳信息進(jìn)而導(dǎo)致表觀特征的發(fā)生改變。現(xiàn)今，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物廣泛的應(yīng)用于臨床疾病的診治及藥物的開(kāi)發(fā)中，小鼠作為臨床上應(yīng)用最為廣泛及常見(jiàn)的動(dòng)物模型，有著諸多的局限性。例如，壽命、體型、生理及病理特性和組織結(jié)構(gòu)等。而豬和牛作為大型哺乳類動(dòng)物，在生理及病理學(xué)上更加接近人，為人類疾病的研究及診治提供了更好的生物模型。因此開(kāi)發(fā)出穩(wěn)定便捷高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，生產(chǎn)出大型轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可進(jìn)一步了解疾病的發(fā)病機(jī)理及機(jī)制，為治療提供了有效的動(dòng)物模型。

SMGT是基于精子在受精過(guò)程中結(jié)合、內(nèi)化和轉(zhuǎn)運(yùn)外源DNA到卵母細(xì)胞的能力。研究表明，精子可自發(fā)的與外源DNA結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到卵母細(xì)胞，后代可表達(dá)外源DNA。SMGT或多或少的參與了轉(zhuǎn)基因胚胎和動(dòng)物的生產(chǎn)，雖然已經(jīng)使用SMGT獲得了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但這種技術(shù)的重復(fù)性極低[5]。此外，外源性DNA在精子內(nèi)結(jié)合和轉(zhuǎn)化的機(jī)制、受精時(shí)的傳播方式及外源DNA在胚胎、胎兒和后代中的持久性，這些問(wèn)題尚未完全闡明。

2 畜牧業(yè)中SMGT的應(yīng)用

2.1 精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)

在轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)中，外源性DNA可與精子結(jié)合，應(yīng)用SMGT技術(shù)可繁育出轉(zhuǎn)基因胚胎或犢牛，但外源性DNA與精子的結(jié)合和內(nèi)化機(jī)制尚不明確，且生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率極低、相關(guān)研究結(jié)論差異較大。為增加介導(dǎo)效率及探究作用機(jī)制，人們應(yīng)用電穿孔轉(zhuǎn)染、化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑（脂質(zhì)體、FuGene6）方法來(lái)增加外源DNA進(jìn)入精子的吸收和融和能力。Gagne等應(yīng)用電穿孔轉(zhuǎn)染方法增強(qiáng)了外源DNA進(jìn)入牛精子的能力，且使質(zhì)粒結(jié)合的百分比增加了5倍。Rieth等也得出了相似的結(jié)果，但發(fā)現(xiàn)電穿孔轉(zhuǎn)染后精子活力明顯下降。Hoelker等研究表明，脂質(zhì)體處理并不能提高精子結(jié)合外源DNA的能力，但應(yīng)用FuGene6可顯著提高結(jié)合能力。但也有報(bào)道表明，脂質(zhì)體或FuGene6均能提高轉(zhuǎn)染率，這兩種不同的處理方法對(duì)卵裂率和囊胚率均無(wú)影響，盡管應(yīng)用FuGene6時(shí)，轉(zhuǎn)染率提高了7～8倍。根據(jù)以上結(jié)果表明，精子質(zhì)膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)可能影響外源DNA的結(jié)合。

在已經(jīng)確認(rèn)影響SMGT效率的因素中。已知哺乳動(dòng)物的精漿可阻斷外源DNA的結(jié)合，附睪精子與牛精子的結(jié)合比例較高。有報(bào)道指出，液氮保存牛精子在解凍后結(jié)合外源DNA的效果高于新鮮精子，這直接導(dǎo)致了低溫保存誘導(dǎo)質(zhì)膜發(fā)生變化的假說(shuō)，從而促進(jìn)了外源DNA的結(jié)合和內(nèi)化。應(yīng)用流失細(xì)胞儀檢測(cè)了牛精子結(jié)合外源DNA能力和活力動(dòng)態(tài)，這使我們能夠確定攜帶外源DNA牛活精子數(shù)量，這些精子可以在傳統(tǒng)的體外受精或人工智能系統(tǒng)中使卵母細(xì)胞受精。這些研究表明，一部分精子可以結(jié)合外源DNA（大約15%的精子群體具備這種能力）。在結(jié)合能力研究表明，精子與外源DNA的結(jié)合可能需要超過(guò)30 min的孵育時(shí)間。然而在牛精液能更快地結(jié)合外源DNA，這個(gè)過(guò)程在30 min內(nèi)完成。這些結(jié)果表明，在授精前與外源DNA進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的孵育并不是獲得最大受精結(jié)果的必要條件，特別是考慮到長(zhǎng)時(shí)間的孵育會(huì)對(duì)精子活力產(chǎn)生負(fù)面影響。精子在與外源DNA的結(jié)合能力上，雄性精子之間觀察到顯著的差異。目前外源DNA對(duì)精子功能的影響尚不明確。運(yùn)動(dòng)性是精子的一種特殊特性，它對(duì)精子的生物學(xué)功能是絕對(duì)必要的。假設(shè)DNA結(jié)合對(duì)運(yùn)動(dòng)的負(fù)面影響可以解釋許多SMGT的失敗。之前的研究報(bào)道了與DNA效果相反的結(jié)果，已有研究報(bào)道指出牛精子與外源DNA結(jié)合后，精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)曲線速度、直線速度、平均路徑速度、曲線軌跡的線性都等均降低。

2.2 精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)

近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因豬已成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具，例如異種器官移植研究及人類疾病動(dòng)物模型等。但目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)主要依賴原核顯微注射、病毒載體及核移植技術(shù)，這些方法均需要昂貴的設(shè)備及熟練的技術(shù)，在大型農(nóng)場(chǎng)中使用的效率極低。因此應(yīng)用SMGT在大型農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是未來(lái)發(fā)展的方向。Gandolfi等在1989年首次在豬中應(yīng)用了SMGT技術(shù)，并在生產(chǎn)的子代中檢測(cè)出了外源DNA表達(dá)。但往后的子代中并無(wú)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。而Sperandio等表明通過(guò)人工授精技術(shù)，將應(yīng)用SMGT方法攜帶外源DNA的精子注入母豬中，在動(dòng)物胚胎中有0%～5.7%具有轉(zhuǎn)基因，且轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因可穩(wěn)定遺傳。Lavitrano等也通過(guò)人工授精導(dǎo)入通過(guò)SMGT處理的精液生產(chǎn)出了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但在70～90 d過(guò)后外源DNA消失，他們猜測(cè)這是由于胎兒發(fā)育早期階段對(duì)DNA進(jìn)行了修復(fù)。

幾種因素可以決定使用該技術(shù)的成功率，包括豬供體、使用的結(jié)構(gòu)物、培養(yǎng)基等，這種技術(shù)的效率取決于所使用的結(jié)構(gòu)類型和DNA數(shù)量。因此，Sciamanna等在2000年報(bào)道稱，大于50～100 ng DNA/106個(gè)精子會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生致命的影響，并減少人工授精后產(chǎn)仔數(shù)量。眾所周知，外源DNA的存在會(huì)對(duì)精子功能產(chǎn)生毒性作用。但在其他的研究中發(fā)現(xiàn)，精子與外源DNA的孵育并不涉及精子參數(shù)的改變。這種不同結(jié)果的產(chǎn)生需要更多的研究進(jìn)行驗(yàn)證并證明。

3 結(jié)語(yǔ)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)對(duì)人類疾病的診治及藥物開(kāi)發(fā)具有重要意義，且對(duì)畜牧業(yè)動(dòng)物的發(fā)展具有促進(jìn)作用。目前生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所需的技術(shù)過(guò)于繁瑣且價(jià)格昂貴，在大型牧場(chǎng)應(yīng)用率極低。而應(yīng)用SMGT來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有明顯的優(yōu)勢(shì)，是未來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)展的方向。