胡志玲 陳 潔 代地林 胡邦望 張 艷 吳 園 舒 玲 包明威

肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)因其起病隱匿、病因眾多、病理生理機(jī)制復(fù)雜、臨床預(yù)后差，有“心血管疾病中的癌癥”之稱。PH以肺動脈壓力和肺血管阻力進(jìn)行性升高，肺血管重構(gòu)為特征，最終導(dǎo)致右心力衰竭(right ventricular failure, RVF)[1]。目前PH全球患病率約為1%，65歲以上人群中患病率增加至10%[2]。PH患者的臨床癥狀、生活質(zhì)量及遠(yuǎn)期預(yù)后取決于右心室(right ventricular, RV)代償能力。在代償階段，RV通過向心性肥大，增加心肌收縮力，以維持心排出量。然而，持續(xù)升高的肺動脈壓力使得RV失代償，導(dǎo)致RV重塑和功能障礙，RV功能障礙是 PH 病死率的最強(qiáng)預(yù)測因子。盡管PH藥物取得了長足的進(jìn)步，主要靶向藥物有內(nèi)皮素受體拮抗劑、前列環(huán)素、磷酸二酯酶抑制劑等，以擴(kuò)張肺血管、改善內(nèi)皮功能為主[3]。目前可用PH 療法都沒有直接針對RVF，PH所致RVF 3 年生存率僅為55%[4]。

研究顯示，交感神經(jīng)系統(tǒng)(sympathetic nervous system, SNS)持續(xù)激活在PH的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。CH暴露引起SNS激活，而SNS持續(xù)激活是PH遠(yuǎn)期預(yù)后的獨立危險因素。肺動脈主干和分叉周圍的脂肪和結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)豐富的交感神經(jīng)，例如酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)纖維、神經(jīng)肽Y1(neuropeptide-Y type 1, NPY1)陽性神經(jīng)纖維[5]。SNS激活時，血漿中去甲腎上腺素(norepinephrine， NE)和NPY1含量增加，刺激肺動脈上α1腎上腺素受體(α1-adrenergic receptor 1，α1-AR)和 NPY1受體，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如Cyclin A、Cyclin E的表達(dá)，使細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入G2/M+S期，加速了細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)肺動脈平滑肌增殖，進(jìn)而使肺血管重塑惡化，肺動脈壓進(jìn)行性增高，最終導(dǎo)致RVF[5, 6]。

頸動脈竇是人體壓力感受器，其產(chǎn)生的興奮由頸動脈竇神經(jīng)傳入大腦延髓心血管中樞，進(jìn)而精密調(diào)節(jié)植物神經(jīng)功能。頸動脈竇電刺激(carotid baroreceptor stimulation,CBS)可以增強(qiáng)傳入神經(jīng)到延髓心血管中樞的刺激，從而持久有效地降低交感神經(jīng)張力[7, 8]。在高血壓、心力衰竭等伴有SNS張力升高的心血管疾病的治療中，CBS有確切效果[9, 10]。因此，筆者假設(shè)CBS 通過抑制SNS張力，抑制PH大鼠RV重塑，改善右心功能。

材料與方法

1.CH誘導(dǎo)PH模型的建立和分組：SD雄性大鼠(180～200g，6周齡)32只，動物實驗方案經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(倫理審批號：WDRM20191201)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后植入CBS。術(shù)后恢復(fù)1周，于第 2 周末，Con-sham組和Con-CBS 組置于SPF環(huán)境(21%±1% O2)，CH-Sham 組和 CH-CBS 組置于缺氧箱(10%±1% O2)，Con-CBS組和CH-CBS組開啟CBS電刺激，Con-Sham和CH-Sham組不開啟電刺激。于第8周末行心臟超聲檢查后處死大鼠，分離RV行相應(yīng)檢測。

2.頸動脈竇電刺激儀的植入：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉后，通過股動脈穿刺插管記錄動脈壓。分離頸動脈竇，用金屬電極包繞，連接電刺激儀(中國杰升生物科技有限公司)。采用脈寬 2ms，頻率20Hz，上下移動電極，尋找可迅速引起血壓和心率下降的部位，固定電極。將電刺激儀(脈寬 2ms，頻率 20Hz，電壓 0～30V 可調(diào)，刺激 10min 間隔 20min)埋藏于頸背部皮下。調(diào)試電壓，選擇可引起血壓下降的最低電壓的 80%刺激頸動脈竇。術(shù)后1周Con-CBS組和CH-CBS組開啟CBS，Con-Sham組和CH-Sham組不開啟CBS。

3.DHE免疫熒光：RV組織用 PBS沖洗后，放置于-80℃ 冰箱冷藏后制作冷凍切片(10μm)，與10μmol/L的二氫乙啶(dihydroethidium，DHE) 在37℃避光孵育30min，在熒光顯微鏡400倍下每個樣品隨機(jī)選取5個視野拍照，并用Image Pro Plus 6.0軟件分析RV中ROS 的平均光密度(IOD/AREA)。

4. RT-PCR：使用Trizol 試劑提取RV組織總RNA。采用Prime-Script衰減轉(zhuǎn)錄試劑盒對 RNA(0.2～0.5μg)進(jìn)行衰減轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。SYBRs Premix Ex TaqTM(DRR42OA，日本TaKaRa公司)和ABI 7300系統(tǒng)用于定量分析。PCR循環(huán)參數(shù)如下：95℃初始孵育10min，然后95℃變性(15s)40個循環(huán)，60℃退火(60s)。比較Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。GAPDH用于標(biāo)準(zhǔn)化mRNA的表達(dá)。引物序列詳見表1。

表1 引物序列

5.TUNEL染色：采用凋亡檢測試劑盒進(jìn)行TUNEL染色。在光學(xué)顯微鏡400倍下每個樣品隨機(jī)選取5個視野拍照，計算TUNEL陽性心肌細(xì)胞百分比。

6.Western blot法檢測：RV組織均質(zhì)化勻漿用于提取和分析GADPH和Bcl-2。BCA 蛋白質(zhì)測定用于測定總蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)(50μg樣品)加載到梯度凝膠上，轉(zhuǎn)移至膜封閉。加入相應(yīng)抗體后在 4℃孵育過夜。抗GADPH 1∶1000稀釋，抗Bcl-2 1∶1000 稀釋。

7.大鼠心臟超聲檢測：大鼠采用異氟烷麻醉后，使用VINNO6VET型超聲心動儀15Hz的大鼠超聲探頭進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。通過胸骨旁軸測量RVEDT，通過心尖四腔心切面測量并計算RVFAC。

結(jié) 果

1.CBS對PH大鼠RV氧化應(yīng)激的影響：DHE染色示，與Con-Sham 組比較，CH-Sham組ROS表達(dá)明顯升高(19.97±0.65 vs 25.64±1.57，P=0.00，圖1)。與CH-Sham組比較，CH-CBS組ROS表達(dá)減少(25.64±1.57 vs 22.75±1.47，P=0.014，圖1)。CBS干預(yù)可減少PH大鼠RV中ROS產(chǎn)生，從而抑制氧化應(yīng)激對心肌細(xì)胞的損害。

圖1 右心室ROS表達(dá)A.右心室DHE染色圖(×400);B.右心室DHE染色統(tǒng)計結(jié)果。與Con-Sham組比較，*P<0.05；與CH-Sham組比較，#P<0.05

2.CBS對PH大鼠RV纖維化、肥大的影響：RT-PCR結(jié)果顯示，與Con-Sham組比較，CH-Sham組MMP2 mRNA表達(dá)明顯增加(1.14±0.27 vs 1.76±0.54，P=0.004，圖2A)、MMP9 mRNA表達(dá)明顯增加(0.79±0.19 vs 1.11±0.20，P=0.001，圖2B)、MYH7 mRNA表達(dá)明顯增加(1.14±0.27 vs 1.76±0.54，P=0.005，圖2C)。與CH-sham組比較，CH-CBS組MMP2 mRNA表達(dá)減少(1.76±0.54 vs 1.33±0.35，P=0.041，圖2A)、MMP9 mRNA表達(dá)減少(1.11±0.20 vs 0.89±0.23，P=0.017，圖2B)、MYH7 mRNA表達(dá)減少(1.76±0.54 vs 1.25±0.38，P=0.017，圖2C)。CBS干預(yù)可減輕PH大鼠RV纖維化、肥大，進(jìn)而延緩RV重構(gòu)。

圖2 右心室MMP2、MMP9、MYH7 mRNA表達(dá)量A.MMP2 mRNA表達(dá)量;B.MMP9 mRNA表達(dá)量;C.MYH7 mRNA表達(dá)量。與Con-Sham組比較，*P<0.01；與CH-Sham組比較，#P<0.05

3.CBS對PH大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響：TUNEL染色結(jié)果顯示，與Con-Sham組比較，CH-Sham組RV中TUNEL染色陽性細(xì)胞明顯增加(4.02%±0.85% vs 29.84%±4.43%，P=0.001，圖3)；蛋白印跡結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白含量減少(0.73±0.16 vs 0.49±0.08，P=0.019，圖4)。與CH-Sham組比較，CH-CBS組RV中TUNEL染色陽性細(xì)胞明顯減少(29.84%±4.43% vs 5.58%±1.22%，P=0.001，圖3)；Bcl-2蛋白表達(dá)增加(0.49±0.08 vs 0.68±0.06，P=0.019，圖4)。CBS干預(yù)可減輕PH大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

圖3 右心室TUNEL染色A.右心室TUNEL染色圖(×400);B.右心室TUNEL染色統(tǒng)計結(jié)果。與Con-Sham組比較，*P<0.01；與CH-Sham組比較，#P<0.01

圖4 右心室Bcl-2蛋白表達(dá)量A.Western blot法條帶圖;B.右心室Bcl-2統(tǒng)計結(jié)果。與Con-Sham組比較，*P<0.05；與CH-Sham組比較，#P<0.05

4.CBS對PH大鼠右心功能的影響：心臟彩超結(jié)果顯示，與Con-Sham組比較，CH-Sham組RVEDT明顯增加(0.61±0.06mm vs 0.86±0.05mm，P=0.001，圖5A)；RVFAC明顯減少(43%±30% vs 31%±2%，P=0.008，圖5B)。與CH-sham組比較，CH-CBS組RVEDT減少(0.86±0.05mm vs 0.72±0.07mm，P=0.029，圖5A)，RVFAC增加(31%±2% vs 40%±3%，P=0.032，圖5B)。CBS干預(yù)可改善PH大鼠右心功能。

圖5 心臟超聲A.右心室舒張末期厚度;B.右心室面積變化率。與Con-Sham組比較，*P<0.01；與CH-Sham組比較，#P<0.05

討 論

本研究結(jié)果顯示，CBS干預(yù)可改善PH大鼠的氧化應(yīng)激、纖維化、肥大、心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善右心室重塑和右心功能。PH時，肺循環(huán)血流動力學(xué)變化，缺氧誘導(dǎo)的化學(xué)感受器反射增強(qiáng)，右心室后負(fù)荷增加及心肌張力改變等均可促進(jìn)SNS興奮。PH患者SNS活性增加，循環(huán)血NE和NPY1含量較高、尿中腎上腺素排泄明顯增加、肌肉交感神經(jīng)活動(muscle sympathetic nerve activity, MSNA)頻繁[5, 11]。MSNA 是PH患者嚴(yán)重惡化的唯一獨立預(yù)測因子，MSNA活動每增加1次，患者死亡風(fēng)險就會增加6%[11]。肺動脈去神經(jīng)術(shù)可通過抑制交感神經(jīng)活性，從而降低PH患者肺動脈壓，改善右心功能、提高6min步行距離，減少再住院率[5, 12]。

右心功能決定PH患者的臨床癥狀及遠(yuǎn)期預(yù)后，右心室射血分?jǐn)?shù)降低 1%，PH患者臨床惡化風(fēng)險增加 4.9%、死亡風(fēng)險增加 2.1%[13]。相對左心室而言，RV的特點是壁薄，冠狀動脈血流持續(xù)，與肺循環(huán)相連接。通常肺循環(huán)壓力<20mmHg，PH時肺循環(huán)壓力明顯增加，是RV適應(yīng)性肥大的首要觸發(fā)因素，而PH時SNS過度激活是RV重塑和RVF的重要病理生理機(jī)制。長期SNS過度激活導(dǎo)致進(jìn)入循環(huán)血中NE增多，而NE以濃度依賴的方式增加心肌細(xì)胞內(nèi)ROS， ROS堆積直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和凋亡增加，這種效應(yīng)可被哌唑嗪阻斷[14]。細(xì)胞水平的ROS增加會促進(jìn)氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激可氧化修飾心肌收縮蛋白、干擾新陳代謝和細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)、破壞線粒體、促進(jìn)心肌細(xì)胞死亡，進(jìn)而導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)、功能障礙。

氧化應(yīng)激還可以加速基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 9, MMP9)的轉(zhuǎn)錄，抑制ROS產(chǎn)生可減少基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)的活化[15]。MMP2和MMP9通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)參與心室纖維化和肥大進(jìn)程，在心室重塑中發(fā)揮核心作用。在心力衰竭中MMPs表達(dá)、活性、豐度增加，可反映心室重塑的嚴(yán)重程度，并且血漿MMPs水平可以評估心力衰竭患者的遠(yuǎn)期預(yù)后[16]。擴(kuò)張型心肌病患者M(jìn)MP2表達(dá)增加與血漿NE水平升高有關(guān)，NE通過β-腎上腺素受體激活ERK1/2通路，促進(jìn)MMP2、MMP9的表達(dá)[15, 17]。NE還可以促進(jìn)心臟肥大標(biāo)志物β-肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain 7, MYH7)的表達(dá)，MYH7沉默顯著抑制了異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大[18]。

RV肥大是PH的標(biāo)志，實驗結(jié)果提示MYH7 mRNA表達(dá)上調(diào)，RVEDT增加，表明RV肥大、順應(yīng)性下降。RV從代償性肥大到失代償功能障礙的轉(zhuǎn)變過程中，心肌細(xì)胞大量壞死和凋亡。Bcl-2作為細(xì)胞病理性凋亡的內(nèi)在調(diào)節(jié)因子，在決定細(xì)胞存活方面發(fā)揮著核心作用。在離體心肌細(xì)胞中，NE抑制經(jīng)典抗凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄、翻譯，以劑量-時間依賴性誘導(dǎo)新型促凋亡蛋白Axud1表達(dá)，Axud1通過激活Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[19]。CBS干預(yù)減輕PH大鼠RV氧化應(yīng)激、纖維化、肥大、心肌細(xì)胞凋亡，從而改善RV重塑。RVFAC 是反映RV 收縮功能的敏感指標(biāo)，實驗結(jié)果顯示，PH大鼠RVFAC減少， CBS干預(yù)可增加RVFAC。CBS干預(yù)還可降低RV舒張末期前后徑及RV流出道內(nèi)徑[20]。這表明CBS干預(yù)可改善PH大鼠右心功能。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)CBS干預(yù)可以改善PH大鼠RV重塑及右心功能，其機(jī)制與抑制SNS過度激活、調(diào)節(jié)局部神經(jīng)激素受體異常表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。與其他藥物或非藥物的植物神經(jīng)功能干預(yù)手段比較，CBS 可直接、靶向抑制SNS，干預(yù)強(qiáng)度可精確調(diào)節(jié)。CBS為PH的治療提供了一種新選擇，但目前CBS的臨床轉(zhuǎn)化仍然面臨困擾，需要開展進(jìn)一步探索。