張雪松，李德鳳，薛姜珊，陳孜孟，李 卓，蒙健宗

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.自然資源部第三海洋研究所，福建廈門 361000；3.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)食品藥品研究院，廣西南寧 530007)

DNA復(fù)制在生命領(lǐng)域中是必不可少的生物學(xué)過程，DNA聚合酶在DNA復(fù)制過程中起著十分關(guān)鍵的作用，它確保了遺傳信息的準(zhǔn)確復(fù)制和傳遞。迄今報(bào)道的DNA聚合酶家族有7個(gè)，根據(jù)對其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的分析可劃分為A、B、C、D、E、X和Y家族[1-7]，其中D家族(Pol D)DNA聚合酶是在古菌中被發(fā)現(xiàn)的，并且只存在于古菌中[5]。1997年Uemori等[8]從超嗜熱古菌Pyrococcusfuriosus中克隆出Pol D DNA聚合酶基因，該聚合酶由DP1和DP2兩個(gè)亞基組成，大小分別為69 294 Da和143 161 Da，且兩亞基需要共表達(dá)或混合存在時(shí)才會(huì)各自表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性；1998年Ishino等[5]從古菌Methanococcusjannaschii中克隆表達(dá)了與P.furiosusDNA聚合酶同源的聚合酶蛋白，并發(fā)現(xiàn)其DP1亞基有3′→5′外切核酸酶活性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，相比于雙鏈DNA，DP1更容易降解單鏈DNA。研究發(fā)現(xiàn)大部分古菌中存在B家族(Pol B)與Pol D兩種DNA聚合酶，若將細(xì)胞內(nèi)的Pol B DNA聚合酶基因敲除，古菌依舊可以存活；若將細(xì)胞內(nèi)的Pol D DNA聚合酶基因敲除，則古菌無法存活[9]。由此可見Pol D DNA聚合酶在古菌DNA復(fù)制過程中的重要性。相比于Pol A、Pol B等家族的DNA聚合酶，國內(nèi)外對Pol D DNA聚合酶的研究仍然較少，多種古菌中Pol D DNA聚合酶的理化性質(zhì)和功能仍處于未知狀態(tài)。

我國自然資源部第三海洋研究所從采集的海底熱液口樣品中分離得到一株超嗜熱古菌Thermococcussp.4557 (CGMCC 1.517 2)，該菌是一種嚴(yán)格厭氧的超嗜熱硫還原古菌[10]，前期已克隆表達(dá)其小亞基DP1和大亞基DP2，并研究了DP1與Sld5和Psf1蛋白復(fù)合體(Sld5 and Psf1 Complex，GINS 51)、GINS關(guān)聯(lián)核酸酶(GINS-Associated Nuclease，GAN)等相關(guān)蛋白的體外相互作用[11]，但還未研究該P(yáng)ol D DNA聚合酶大、小兩個(gè)亞基的功能及其相互作用，以及GINS 51蛋白對小亞基外切酶活性的影響等。本研究分別純化重組表達(dá)Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶小亞基DP1和大亞基DP2，并利用熒光標(biāo)記核酸對其體外功能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 表達(dá)質(zhì)粒與重組蛋白

分別用于表達(dá)超嗜熱硫還原古菌Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶小亞基DP1和大亞基DP2的表達(dá)質(zhì)粒pET21a/His-PolD-(S)、pET21a/His-PolD-(L)[11]，以及純化的重組表達(dá)Thermococcussp.4557 GINS 51蛋白，均由自然資源部第三海洋研究所提供。

1.1.2 試劑

Ni-NTA樹脂、Q陰離子層析樹脂、DEAE樹脂和Butyl樹脂購自GE Healthcare Life Sciences，牛血清白蛋白(BSA)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，dNTP購自New England Biolabs，Trition X-100購自Takara Bio Group。

單鏈DNA模板ZXS001序列：5′-GTAACGC-

CAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAA-

CGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGC-

AGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCG-

AGC-3′。

熒光引物Cy3-ZXS002序列：5′-GCTCGGTAC-

CCGGGGATCCTCTAGAGTCGA-3′。

熒光底物Cy5-0A01序列：5′-GGGGCGAGTCCAGGTCAGGACCTTGCGGGG-3′。

熒光引物和熒光底物均從深圳華大基因股份有限公司訂購合成。

1.1.3 儀器

AKTA avant 25蛋白純化系統(tǒng)(GE Healthcare Life Sciences)，Typhoon掃描儀(GE Healthcare Life Sciences)，垂直電泳儀Mini-PROTEANR Tetra Handcast System [伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]，JS-3000凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)，Nano Drop微量核酸蛋白測定儀(ThermoFisher Scientific)，恒溫?fù)u床(上海知楚儀器有限公司)，Biosafer超聲破碎儀[賽飛(中國)有限公司]，高壓均質(zhì)機(jī)[永聯(lián)生物科技(上海)有限公司]，100 L自控式發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司)，Avanti J-26冷凍離心機(jī)(Beckman coulter)。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白表達(dá)

表達(dá)質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布到含100 μg/mL氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

Pol D DNA聚合酶小亞基DP1重組菌的表達(dá)：挑取單菌落在LB/Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩級(jí)種子，以2%的接種量轉(zhuǎn)接到3瓶2.5 L的LB/Amp液體培養(yǎng)基，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)6-8 h，待其OD600值達(dá)1.0時(shí)，加入終濃度為50 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8-10 h，離心收集菌體，-80℃凍存。

Pol D DNA聚合酶大亞基DP2重組菌的表達(dá)：由于DP2表達(dá)量較低，因而采用發(fā)酵罐進(jìn)行大量培養(yǎng)；挑取單菌落在 LB/Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)三級(jí)種子，以1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 L LB/Amp液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度37℃、轉(zhuǎn)速120 r/min、通氣量為0.5 vvm、罐壓0.05 MPa的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，待其OD600值達(dá)到1.0時(shí)，加入終濃度為50 mmol/L的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)8-10 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，用管式離心機(jī)離心收集菌體，-80℃凍存。

1.2.2 重組蛋白純化

(1)Ni-NTA柱層析。

取10 g表達(dá)Pol D DNA聚合酶小亞基DP1的菌泥重懸于50 mL Ni-NTA Binding Buffer，置70℃水浴熱處理20 min，使大部分非耐熱蛋白失活沉淀；用超聲波破碎儀破碎菌體后，于4℃、13 000 r/min離心40 min，收集上清；取160 g表達(dá)Pol D DNA聚合酶大亞基DP2的菌泥重懸于500 mL Ni-NTA Binding Buffer，置70℃水浴熱處理20 min后，用高壓均質(zhì)機(jī)在4℃下高壓研磨破碎菌體約10 min，4℃、13 000 r/min離心40 min，收集上清。

在AKTA avant25蛋白純化系統(tǒng)上進(jìn)行Ni-NTA柱層析純化，將細(xì)胞破碎液上清與5 mL平衡好的Ni-NTA樹脂結(jié)合，采用3倍柱體積的Binding Buffer清洗后，用咪唑濃度為0-250 mmol/L的線性梯度液進(jìn)行洗脫，洗脫液按20 mL/管進(jìn)行收集并置4℃冰箱暫存；取少量洗脫液進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用ImageJ軟件分析計(jì)算每管洗脫液中目的蛋白條帶的占比，根據(jù)電泳結(jié)果選取含有目的蛋白的樣品，用強(qiáng)陰離子吸附柱進(jìn)一步純化。

(2)強(qiáng)陰離子吸附柱(Q柱)層析。

將經(jīng)Ni-NTA純化后的含有目的蛋白的組分混合，用含25 mmol/L Tris (pH值為8.0)溶液進(jìn)行降鹽透析24 h，每6 h換一次透析液，使樣品中NaCl濃度降至10 mmol/L以下；取透析完成的樣品與5 mL Q陰離子交換樹脂結(jié)合，用NaCl線性梯度洗脫液進(jìn)行升濃度梯度洗脫，NaCl線性梯度液濃度為0-1 000 mmol/L，洗脫液按10 mL/管收集并置4℃暫存；取少量洗脫液樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果選取含有目的蛋白的樣品，分別用DEAE柱(DEAE樹脂)或疏水柱(Butyl樹脂)進(jìn)一步純化。

(3)弱陰離子交換柱層析

將經(jīng)Q柱純化后的含有重組Pol D DNA 聚合酶小亞基DP1的樣品混合，按(2)的方法透析；取透析完成的樣品與5 mL DEAE陰離子交換樹脂結(jié)合，用NaCl線性梯度洗脫液進(jìn)行升濃度梯度洗脫，NaCl梯度液濃度為0-1 000 mmol/L，洗脫液按5 mL/管收集并置4℃冰箱暫存；取少量洗脫液樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

(4)疏水柱層析。

將Q柱純化后含有重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2的樣品組分混合，計(jì)算并加入5 mol/L NaCl溶液，使樣品中NaCl濃度達(dá)到3.5 mol/L；將此樣品溶液與用3.5 mol/L NaCl溶液平衡過的5 mL Butyl樹脂結(jié)合，用NaCl線性梯度洗脫液進(jìn)行降濃度梯度洗脫，NaCl梯度液濃度為3 500-0 mmol/L，洗脫液按5 mL/管收集并置4℃暫存；取少量洗脫液樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

(5)蛋白的透析與保存。

將純化后的目的蛋白樣品混合，用含25 mmol/L Tris (pH值為8.0)、0.1 mmol/L EDTA、200mmol/L KCl、1 mmol/L DTT和50%甘油的Storage Buffer在4℃透析18 h，每6 h換一次Storage Buffe，透析完畢用微量核酸蛋白測定儀測定蛋白質(zhì)濃度，置-20℃保存。

1.2.3 重組Pol D DNA聚合酶大小亞基的功能實(shí)驗(yàn)

(1)重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2的延伸活性。

根據(jù)單鏈DNA模板ZXS001的序列設(shè)計(jì)和合成帶有5′-Cy3熒光標(biāo)記的引物Cy3-ZXS002，配制熒光引物-模板混合物(100 pmol Cy3-ZXS002、200 pmol ZXS001、7 mmol/L pH 值為8.0的Tris、50 mmol/L NaCl、7 mmol/L MgCl2)，沸水浴5 min后自然冷卻至室溫，使熒光引物互補(bǔ)配對結(jié)合到單鏈DNA模板；配制10 μL延伸反應(yīng)體系：20 mmol/L pH 值為8.0的Tris、10 mmol/L MgSO4、10 mmol/L KCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、0.1% Trition X-100、0.5 mmol/L dNTP、0.8 μL熒光引物-模板混合物、1 μL 不同濃度(0 pmol、0.1 pmol、0.2 pmol、0.5 pmol、1.5 pmol、5 pmol、15 pmol、40 pmol)的DP2或DP2與DP1的混合物，在70℃孵育2 min使熒光引物發(fā)生DNA復(fù)制延伸反應(yīng)；加入等體積的2×Stop Buffer (90%甲酰胺、10 mmol/L EDTA、10% TBE)終止反應(yīng)，接著煮沸5 min，冰水浴使其快速冷卻，此時(shí)未經(jīng)過延伸的熒光引物會(huì)與單鏈DNA模板分離，游離于體系內(nèi)；延伸反應(yīng)物在含8 mol/L尿素的TBE溶液中進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，最后用GE Typhoon掃描儀Cy3頻段掃描檢測。

(2)重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1外切酶活性。

合成5′-Cy5熒光標(biāo)記的單鏈DNA底物Cy5-0A01，構(gòu)建20 μL降解反應(yīng)體系：50 mmol/L pH 值為8.0的Tris，4 mmol/L MgCl2、100 μg BSA、2 pmol Cy5-0A01、1 μL 不同濃度(0 pmol、1.562 5 pmol、3.125 pmol、6.25 pmol、12.5 pmol、25 pmol、50 pmol、100 pmol)的DP1或DP1與DP2的混合物或DP1與GINS 51的混合物，ddH2O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)體系在70℃孵育一定時(shí)間(0 s、30 s、1 min、2 min、5 min、10 min、15 min、20 min)后加入等體積的2×Stop Buffer中止反應(yīng)，煮沸5 min，待其冷卻后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，最后用GE Typhoon掃描儀Cy5頻段進(jìn)行掃描檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Pol D DNA聚合酶大小亞基的純化

重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1先后經(jīng)過Ni-NTA柱、Q柱和DEAE柱層析純化，DP1在每次層析的收集組分中的占比依次增加。收集合并DEAE柱層析中DP1占比分別為77.9%、95.3%和98.6%的第5-7管組分，經(jīng)Storage Buffer透析后收得含DP1蛋白溶液22.5 mL，微量核酸蛋白測定儀測定其蛋白質(zhì)濃度為1.49 mg/mL。

重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2先后經(jīng)過Ni-NTA、Q柱和Butyl疏水柱層析純化，DP2在每次層析的收集組分中的占比依次增加。收集合并Butyl疏水層析后DP2占比分別為70.5%、82.4%、81.2%、91.5%、90.6%、79.0%的第11-16管組分，經(jīng)Storage Buffer透析后收得含DP2蛋白溶液11 mL，微量核酸蛋白測定儀測定其蛋白質(zhì)濃度為0.56 mg/mL。

將以上較高純度的DP1蛋白和DP2蛋白用于研究其功能。

2.2 重組Pol D DNA聚合酶大小亞基的功能

2.2.1 重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2的延伸活性

在延伸反應(yīng)體系中分別加入0-40 pmol的DP2蛋白反應(yīng)2 min后，其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，含有DP2蛋白的實(shí)驗(yàn)樣品完成了熒光核酸引物的復(fù)制延伸，DP2蛋白為零的對照樣品未完成熒光核酸引物的復(fù)制延伸，說明重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2具有核酸復(fù)制延伸活性，且延伸活性較強(qiáng)，在用量低至0.1 pmol時(shí)仍可完成熒光核酸引物的復(fù)制延伸。

圖1 DP2濃度對其延伸活性的影響

2.2.2 重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1的外切酶活性

在降解反應(yīng)體系中分別加入0-100 pmol的DP1蛋白降解反應(yīng)15 min后，其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，加入DP1蛋白后熒光核酸底物被降解而逐漸變短，且在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著DP1用量的增加，熒光核酸底物被降解得更短，表明Pol D DNA聚合酶小亞基DP1具有3′→5′外切核酸酶活性。

圖2 DP1濃度對其3′→5′外切核酸酶活性的影響

在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為50 pmol 的條件下，經(jīng)不同降解反應(yīng)時(shí)間后，其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，DP1對熒光核酸底物的降解程度逐漸增大。

圖3 DP1反應(yīng)時(shí)間對DP1降解核酸底物的影響

2.2.3 重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1對大亞基DP2延伸活性的影響

在延伸反應(yīng)體系中DP2蛋白用量為5 pmol 的條件下，分別加入0-40 pmol的DP1蛋白，延伸反應(yīng)2 min后，其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在DP1含量較低時(shí)，DP2的延伸活性仍可以使DNA鏈正常復(fù)制延伸，但DP1用量達(dá)到1.5 pmol時(shí)(第4泳道)已開始導(dǎo)致延伸鏈被降解，出現(xiàn)游離的熒光分子；當(dāng)DP1與DP2的量相當(dāng)時(shí)(第5泳道)，DP2延伸的DNA開始明顯被降解，但仍有完整的延伸鏈保留；當(dāng)DP1用量大于DP2時(shí)(第6，7泳道)，體系內(nèi)延伸復(fù)制的DNA和熒光引物都被降解。因此可以推測，至少在細(xì)胞外體系中，在Pol D DNA聚合酶執(zhí)行復(fù)制功能時(shí)，復(fù)制效率達(dá)到最高時(shí)的小亞基DP1與大亞基DP2的最佳濃度比低于0.3∶1，并且至少在DP1的量提高到與DP2的量相當(dāng)時(shí)(即1∶1)，就有必要使用其他的功能蛋白來抑制小亞基DP1的外切酶活性。

圖4 DP1濃度對DP2延伸活性的影響

2.2.4 重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2對小亞基DP1外切酶活性的影響

在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為20 pmol 的條件下，分別加入0-100 pmol 的 DP2蛋白，降解反應(yīng)2 min后，其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在無DP1的情況下，DP2自身不存在外切核酸酶活性，但DP2對DP1的外切核酸酶活性有影響，在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著DP2的增加，DP1對熒光核酸底物的降解更徹底，說明DP2對DP1的外切核酸酶活性具有促進(jìn)作用。

圖5 DP2濃度對DP1降解核酸底物的影響

在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為50 pmol的條件下，添加50 pmol的DP2蛋白，經(jīng)不同降解反應(yīng)時(shí)間后，其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖6所示。圖6與圖3比較可知，在DP2存在時(shí)DP1降解熒光核酸底物所需的時(shí)間明顯縮短，10-15 min已基本降解完畢，也進(jìn)一步表明DP2具有促進(jìn)DP1外切核酸酶活性的作用。

圖6 DP2存在時(shí)反應(yīng)時(shí)間對DP1降解核酸底物的影響

2.2.5 GINS 51蛋白對重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1外切酶活性的影響

古菌的GINS四聚體會(huì)與Cdc45、MCM(Minichromosome Maintenance)、Pol D、PCNA等蛋白發(fā)生相互作用[12-15]，是古菌細(xì)胞存活必需的蛋白復(fù)合物。在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為5 pmol的條件下，分別加入0-80 pmol的Thermococcussp.4557 GINS 51蛋白，降解反應(yīng)2 min后，其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，在無DP1的情況下，GINS 51自身不存在外切核酸酶活性，但GINS 51對DP1的外切核酸酶活性有影響，在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著GINS 51的增加，DP1對熒光核酸底物的降解呈減弱趨勢，說明GINS 51對DP1的外切核酸酶活性有抑制作用。

在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為50 pmol的條件下，添加50 pmol的GINS 51蛋白，經(jīng)不同降解反應(yīng)時(shí)間后，其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖8所示。圖8與圖3比較可知，相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，加入GINS 51后DP1降解核酸底物的條帶略有減少，也說明GINS 51對DP1的外切核酸酶活性有一定抑制作用。

圖7 GINS 51濃度對DP1降解核酸底物的影響

圖8 GINS 51存在時(shí)反應(yīng)時(shí)間對DP1降解核酸底物的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，純化的重組Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶大亞基DP2蛋白具有DNA復(fù)制延伸活性，小亞基DP1蛋白具有3′→5′外切核酸酶活性，這與此前人們對Pol D DNA聚合酶的認(rèn)識(shí)一致[16]。在DNA復(fù)制過程中，DNA聚合酶會(huì)對復(fù)制錯(cuò)誤的片段進(jìn)行降解，以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。有研究表明Pol D DNA聚合酶是由小亞基DP1和大亞基DP2以1∶1形成的二聚體[17]，本研究發(fā)現(xiàn)Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶小亞基DP1的3′→5′外切核酸酶活性較強(qiáng)，在與大亞基DP2以1∶1的比例結(jié)合時(shí)，大亞基DP2復(fù)制延伸的DNA被明顯降解，表明單獨(dú)按1∶1形成的小亞基DP1和大亞基DP2二聚體無法完成DNA的復(fù)制延伸；由于GINS 51對小亞基DP1的外切核酸酶活性有抑制作用，因此推測Pol D DNA聚合酶完成DNA的復(fù)制延伸功能時(shí)可能有GINS 51參與調(diào)控小亞基DP1的外切核酸酶活性。Lu等[18]對Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶與GINS、GAN等蛋白進(jìn)行了分子篩互作分析，并提出了名為Pol D-GINS-GAN的古菌DNA復(fù)制復(fù)合體模型；該研究表明，單獨(dú)的Pol D DNA聚合酶大亞基DP2與GINS、GAN等蛋白不發(fā)生互作，而單獨(dú)的Pol D DNA聚合酶小亞基DP1可以與GINS 51發(fā)生互作，并且單獨(dú)的GINS 51與GAN發(fā)生互作，因此大亞基DP2需要借助小亞基DP1才能與復(fù)制叉上的復(fù)制復(fù)合體連接。結(jié)合本研究結(jié)果，可以進(jìn)一步推測Pol D DNA聚合酶在DNA復(fù)制過程中的功能與機(jī)理：GINS 51與小亞基DP1結(jié)合在一起，通過DP1再與大亞基DP2連接；大亞基DP2與DNA底物結(jié)合并行使復(fù)制延伸功能；GINS 51通過抑制小亞基DP1的3′→5′外切核酸酶活性來保證大亞基DP2可以順利進(jìn)行新鏈的復(fù)制延伸；同時(shí)，當(dāng)大亞基DP2正在合成的新鏈出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí)，小亞基DP1的3′→5′外切核酸酶活性被激活，迅速切除錯(cuò)配片段，從而保證DNA復(fù)制順利進(jìn)行。DNA復(fù)制錯(cuò)配發(fā)生時(shí)GINS 51對小亞基DP1的3′→5′外切核酸酶活性的抑制作用如何解除，復(fù)制過程中GAN、PCNA、SSB等其他復(fù)制因子、調(diào)控因子如何結(jié)合并參與調(diào)控，仍然有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

利用熒光標(biāo)記核酸引物進(jìn)行的DNA復(fù)制延伸實(shí)驗(yàn)和熒光標(biāo)記核酸底物進(jìn)行的DNA降解實(shí)驗(yàn)表明，純化的重組Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶大亞基DP2蛋白具有DNA復(fù)制延伸活性；純化的重組Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶小亞基DP1蛋白具有3′→5′外切核酸酶活性。DP2蛋白的延伸活性受到DP1蛋白的影響，若DP1與DP2濃度比例小于0.3∶1時(shí)，DP2能完成熒光核酸引物的延伸；DP1提高到與DP2含量相當(dāng)(1∶1)時(shí)，出現(xiàn)明顯的延伸產(chǎn)物和熒光引物降解現(xiàn)象；DP1與DP2的濃度比進(jìn)一步提高到3∶1時(shí)，可將延伸產(chǎn)物和熒光引物完全降解。Thermococcussp.4557的DP2蛋白和復(fù)制相關(guān)蛋白GINS 51對DP1蛋白的外切核酸酶活性有不同的作用，DP2蛋白對DP1蛋白的外切核酸酶活性有促進(jìn)作用，而GINS 51對DP1蛋白的外切核酸酶活性有抑制作用。