蘭國玉 湯守元 黃耿 朱鐘鐘 李新明 羅海平 姜進平

1鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院胃腸外科，黃石 435000；2鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院泌尿外科，黃石 435000

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，是癌癥相關(guān)死亡的重要原因［1］。胃癌缺乏早期診斷和治療的標志物，許多患者確診時已處于晚期，導致胃癌患者的5年總生存率很低［2］。探究新的分子靶點對胃癌的診療具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類非蛋白編碼的單鏈小RNA，長度為19～25個核苷酸，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達［3］。miRNA通過影響細胞的代謝、分化、增殖、侵襲等生物學過程，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要功能［4］。miR-4795-3p長度為22個核苷酸，其在疾病中的作用尚未見報道。本研究于2020年6月至12月探究miR-4795-3p對胃癌細胞增殖和侵襲能力的影響及可能的調(diào)控機制。

材料與方法

1、細胞株與主要試劑

胃癌細胞株BGC823購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；淋巴細胞增殖檢測（MTS）試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；陰性對照模擬物、miR-4795-3p模擬物、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）野生型（EGFR-WT）重組質(zhì)粒、EGFR突變型（EGFR-MT）重組質(zhì)粒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購于美國Invitrogen公司；超敏ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司；一抗和辣根過氧化物酶標志的二抗購于美國BD公司。

2、細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

BGC823采用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，在6孔板接種對數(shù)生長期BGC823細胞，采用Lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染陰性對照模擬物或miR-4795-3p模擬物，標記為陰性對照組和miR-4795-3p組，12 h后更換培養(yǎng)基。

3、qRT-PCR檢測miR-4795-3p、EGFRmRNA表達情況

采用TRIzol法提取兩組對數(shù)生長期細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行qRT-PCR反應(yīng)，以U6為miR-4795-3p的內(nèi)參基因，以GAPDH為EGFR的內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法計算miR-4795-3p、EGFR mRNA表達情況。EGFR正向引物：5’-AGGCACGAGTAACAAGCTCAC-3’，反 向 引 物5’-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3’；U6正 向 引 物：5’-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3’，反 向 引 物5’-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-4795-3p正向引物：5’-CAGAAGTGGCTAATAATA-3’，反向引物5’-CTTCATCAGCGTCAACAG-3’；GAPDH正 向 引 物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 引 物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

4、MTS法檢測BGC823細胞增殖情況

調(diào)整兩組BGC823細胞密度為6×103個/ml，以200μl/孔接種至96孔板，于第1、2、3、4天檢測BGC823細胞的增殖。加入20μl/孔MTS試劑，于培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標儀檢測每孔于450 nm波長處吸光度（A450）值，繪制BGC823細胞生長曲線。

5、Transwell實驗檢測BGC823細胞侵襲能力

用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整兩組BGC823細胞密度為1×105個/ml，以200μl/孔接種于Transwell上室，在下室加入600μl/孔含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，甲醇固定并采用結(jié)晶紫染色，于倒置顯微鏡下計數(shù)細胞侵襲數(shù)。

6、生物信息學軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-4795-3p的靶基因

采用miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-4795-3p的靶基因，EGFR可能是miR-4795-3p的靶基因。分別將EGFR-WT質(zhì)?；駿GFR-MT質(zhì)粒與陰性對照模擬物或miR-4795-3p模擬物共轉(zhuǎn)染至BGC823細胞，48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測每孔BGC823細胞熒光素酶的相對活性。

7、蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（Western blot）檢測靶基因蛋白的表達

用RIPA裂解液裂解BGC823細胞并提取總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜。室溫封閉后加入一抗，4℃孵育過夜。加入二抗，室溫孵育1 h，滴加ECL顯影液，采用凝膠成像儀曝光，觀察每組蛋白條帶。

8、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料均以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1、各組BGC823細胞中miR-4795-3p的表達情況

陰性對照組和miR-4795-3p組BGC823細胞中miR-4795-3p的表達分別為（1.02±0.11）和（11.04±1.23），miR-4795-3p組是陰性對照組的10.82倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.14，P＜0.01）。

2、高表達miR-4795-3p對BGC823細胞增殖能力的影響

與陰性對照組相比，miR-4795-3p組BGC823細胞在第2、3、4天的A450值顯著下降（均P＜0.05），表明miR-4795-3p能夠抑制胃癌BGC823細胞增殖能力（圖1）。

圖1 高表達miR-4795-3p對BGC823細胞增殖能力的影響

3、高表達miR-4795-3p對BGC823細胞侵襲能力的影響

陰性對照組和miR-4795-3p組BGC823細胞細胞侵襲數(shù)分別為（79.76±6.27）個和（31.38±5.46）個，差異有統(tǒng)計學意 義（t=5.82，P＜0.01），提示miR-4795-3p可抑制胃癌BGC823細胞的侵襲能力。

4、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-4795-3p的靶基因

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，陰性對照+EGFR-WT組和miR-4795-3p+EGFR-WT組BGC823細胞相對熒光素酶活性分別為（1.01±0.08）和（0.22±0.05），差異有統(tǒng)計學意義（t=8.58，P＜0.01），提示miR-4795-3p可靶向結(jié)合EGFR。

5、高表達miR-4795-3p對EGFRmRNA表達水平的影響

陰性對照組和miR-4795-3p組BGC823細胞中EGFR mRNA的表達分別為（1.00±0.03）和（0.35±0.04），證實miR-4795-3p可直接下調(diào)EGFR mRNA的表達（t=14.08，P＜0.01）。

6、高表達miR-4795-3p對EGFR蛋白的表達

Western blot結(jié)果表明，與陰性對照組相比，miR-4795-3p組BGC823細胞EGFR蛋白減少，EGFR/MAPK信號通路蛋白如p-MEK、p-ERK表達降低（圖2）。

圖2 高表達miR-4795-3p對EGFR蛋白表達的影響

討 論

研究表明，miRNA由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA前體通過Dicer酶加工合成，其表達具有明顯的細胞特異性［5］。miRNA通過表現(xiàn)為癌基因或抑癌基因作用，其上調(diào)或下調(diào)與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［6］。miRNA如miR-665［5］、miR-129-5p［7］等通過負性調(diào)控癌基因的表達，抑制胃癌的生長和轉(zhuǎn)移。miRNA如miR-301a-3p［8］、miR-223-5p［9］等通過下調(diào)抑癌基因的表達，促進胃癌的生長和轉(zhuǎn)移。miR-4795-3p在胃癌細胞中的作用并不清楚。本研究表明，高表達miR-4795-3p可顯著抑制胃癌BGC823細胞的增殖和侵襲能力，miR-4795-3p在胃癌細胞中發(fā)揮抑癌基因作用。

miRNA與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)互補配對，誘導靶基因mRNA的降解或抑制蛋白合成，進而在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控靶基因的表達［6］。本研究應(yīng)用生物信息學軟件miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，miR-4795-3p和EGFR mRNA存在互補配對的反應(yīng)元件。EGFR蛋白是一種糖蛋白，其在多種實體瘤中過表達，可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及血管生成［10］。高表達的EGFR與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)，是食胃癌患者的獨立預(yù)后因素，EGFR參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程［11］。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，miR-4795-3p可互補配對結(jié)合EGFR mRNA。本研究進一步證實，轉(zhuǎn)染miR-4795-3p后細胞中EGFR表達下降，表明miR-4795-3p可靶向負調(diào)控EGFR的表達，EGFR是miR-4795-3p的靶基因。EGFR/MAPK信號通路的激活可促進胃癌細胞的增殖和侵襲［12］。本研究顯示，miR-4795-3p下調(diào)EGFR表達后，BGC823細胞中EGFR/MAPK信號通路蛋白如p-MEK、p-ERK表達降低，EGFR/MAPK信號通路被抑制。

綜上所述，miR-4795-3p能夠通過靶向負調(diào)控EGFR表達，干擾EGFR/MAPK信號通路，抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力，本研究為miRNA在胃癌的靶向治療研究提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突