宋詩潔 朱 凌 王 琛** 楊延蓮**

（1）國家納米科學中心，北京 100190；2）中國科學院大學中丹學院，北京101400）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病。最新數(shù)據(jù)顯示，目前全球大約有包括AD 患者在內的5 000 萬癡呆患者，預計到2050 年，這一數(shù)字將達到1.52 億［1］。在20 世紀初，德國神經(jīng)學家Alois Alzheimer 首次發(fā)現(xiàn)一種疾病，其主要特征是認知的進行性和不可逆轉的衰退［2］，這種疾病后來被命名為AD。該疾病的主要病理特征表現(xiàn)為：a.β 淀粉樣蛋白（amyloid beta peptide，Aβ）過度沉積形成老年斑［3］；b.過度磷酸化的tau 蛋白聚集形成神經(jīng)原纖維纏結［4］。Aβ和tau蛋白的積累會導致大腦中與記憶相關的突觸和神經(jīng)元的大規(guī)模損傷，進而造成嚴重的記憶喪失和認知喪失。

AD 從發(fā)生到出現(xiàn)臨床癥狀耗時長達15～25年［1］。美國國立衰老研究所（National Institute of Aging，NIA）和阿爾茨海默病協(xié)會（Alzheimer’s Association，AA）提出的診斷標準認為，AD的發(fā)展是一個連續(xù)進展的過程［5］。該診斷標準將AD的進展分為3 個階段。a.臨床前期（preclinical）：蛋白質錯誤折疊、聚集并開始在大腦中的積累，神經(jīng)元的活性有所降低但是并沒有出現(xiàn)臨床癥狀；b.輕度認知障礙（mild cognitive impairment，MCI）：與記憶形成相關的海馬體功能受損并且出現(xiàn)腦萎縮和認知損傷等癥狀；c.癡呆（dementia）：記憶力嚴重損傷并伴隨全身性損傷，患者日常生活不能自理［6］。

目前，AD 的臨床診斷主要通過認知測試、影像學檢查以及腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）分析來實現(xiàn)［7］。認知測試往往會受到主觀因素的影響，因而診斷準確率不高。相比之下，影像學檢查是一種更直觀的檢查手段。AD診斷常用的醫(yī)學影像技術有用于海馬體成像的磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）以及評估Aβ在大腦皮層沉積的正電子發(fā)射型計算機斷層顯像（positron emission computed tomography，PET）技術［8?9］。然而，這些影像學診斷方法價格昂貴，檢測成本偏高。CSF分析則具有侵入性，給患者帶來極大的痛苦。因此迫切地需要一種具有非侵入性、操作簡單的低成本診斷方法。

目前發(fā)展的以血液為基礎的體外診斷技術，在AD 早期診斷方面突顯優(yōu)勢。近年來，質譜（mass spectrometry，MS）分析技術已經(jīng)應用于AD 生物標志物的篩選［10］和檢測［11］，成為以體液為基礎的AD早期診斷的有用工具［12］。為了獲得小型化、便攜式的AD體外診斷工具，研究者們積極發(fā)展基于納米技術的AD生物標志物的檢測平臺。納米材料和納米技術的高表面活性、獨特的光電特性、生物相容性好、易于表面修飾、小型化、集成化等特點，使得研發(fā)具有更高靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性的AD體外診斷技術成為可能。本文分別從生物標志物的富集、信號的轉導與增強、靈敏度的提高以及臨床價值等方面介紹納米技術在伏安/阻抗檢測、電導檢測、表面等離激元共振檢測、表面增強拉曼散射檢測以及電化學發(fā)光檢測等AD傳感檢測平臺中的應用（圖1）。

Fig.1 Schematic illustration of sensing platform for detection of AD biomarkers圖1 用于檢測AD生物標記物的傳感平臺示意圖

1 生物標志物

蛋白質錯誤折疊、聚集以及積累是AD等神經(jīng)退行性病的主要病理特征［13?15］。盡管這些蛋白質的序列、結構、大小以及功能各異，但在患者的大腦中都經(jīng)歷了由單體聚集形成小的寡聚體，再到大的原纖維、纖維的過程［16］（圖2）。起初，研究者們認為在大腦中大量沉積的蛋白質具有神經(jīng)毒性，但有越來越多的證據(jù)表明，由蛋白質錯誤折疊產(chǎn)生的可溶性寡聚體才是造成神經(jīng)毒性的關鍵因素［17?19］。錯誤折疊的聚集體小到二聚體，大到由數(shù)百個單體組成的原纖維［20?21］，這些異常變化的蛋白質聚集體逐漸被作為生物標志物應用于AD的早期診斷。

Fig.2 Amyloidogenic proteins aggregate via multiple pathways into different assembly structures［16］圖2 淀粉樣蛋白通過多種途徑聚集成不同的組裝結構［16］

Aβ 是一類最重要的早期診斷生物標志物。在正常人體內，淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein，APP）被α 和γ 蛋白酶切割，產(chǎn)生不具有神經(jīng)毒性的多肽片段。在AD 患者體內，APP 在β和γ 蛋白酶的作用下分解成具有39～43 個氨基酸的多肽，其中Aβ42和Aβ40這兩個片段與AD疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［2，22］。大量Aβ聚集形成的寡聚體會產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導致大腦內的神經(jīng)元和突觸受損，從而影響患者的記憶和認知［23］。最近，有觀點認為在眾多Aβ聚集體中，Aβ二聚體是最主要的毒性蛋白形式［24］，這可能開啟AD 研究的新階段。近年來，納米技術的發(fā)展使得AD 患者CSF 中Aβ的微量變化能夠被獲?。?5］，因此逐漸發(fā)展了眾多基于CSF 中Aβ 檢測的早期診斷技術。CSF 分析成本高，取樣困難，給患者帶來極大的痛苦。2018年，Nakamura等［26］提出血漿Aβ與CSF中Aβ濃度存在相關性，并且檢測結果與PET 的診斷結果吻合度達到90%，這意味著血液檢測有望成為替代CSF分析的新方法。隨后，逐漸發(fā)展了以血液標志物為基礎的檢測技術。

tau 蛋白是一種結合在微管上的蛋白質，其正常功能是維持微管的穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離。從微管上脫落的tau 蛋白在腦部聚集，形成的神經(jīng)纖維纏結被認為是AD 病理特征之一［27］。有研究者還發(fā)現(xiàn)，AD 患者腦部tau 蛋白會出現(xiàn)過度磷酸化的現(xiàn)象［28?29］，過度磷酸化會導致tau 正常生物活性的喪失，引起微管解體和軸突運輸功能的破壞［30］。另外，Aβ 能夠加速tau 蛋白的過度磷酸化［31］以及配對螺旋樣纖維（paired helical fibers，PHF）［32］的形成，并且能夠促進tau 蛋白的聚集和擴散［33?34］。

tau 蛋白中有85 個潛在的磷酸化位點，在AD大腦內檢測出了約45個特異磷酸化位點［35］，其中CSF 中p?tau181（phosphorylated tau181）［36］以及p?tau217（phosphorylated tau217）［37］被認為與AD病理相關。近期，研究者比較了p?tau217 與p?tau181 作為AD 生物標志物的有效性，PET 結果顯示p?tau217 能夠更準確地區(qū)分AD 和其他神經(jīng)退行性疾病［38］。越來越多的結果證明［39?41］，血漿中磷酸化的tau，尤其是p?tau217，與AD疾病進展密切相關。

目前已報道了許多新型的AD早期檢測生物標志物［42］，除了有構成神經(jīng)元細胞骨架的神經(jīng)絲蛋白L（neurofilament light，NFL）［43］、與tau mRNA代謝相關的交互反應DNA 結合蛋白43（transactive response DNA binding protein 43，TDP?43）［44］、影響Aβ 生成的去整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10）［45］，還有與炎癥和神經(jīng)元損傷相關的髓系細胞觸發(fā)受體2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）［46］、人幾丁質酶3 樣蛋白?1（chitinase 3?like 1 protein CHI3L1）［47］以及視錐蛋白樣蛋白1（visinin?like protein 1，VLP?1）［48］等。國際工作組（International Working Group，IWG）僅將Aβ和tau蛋白納入診斷標準之中，目前關于AD 早期診斷的研究也主要集中于Aβ、tau 蛋白以及與之相關的蛋白質。最新的AD診斷標準［1］認為，只有臨床表型陽性以及Aβ和tau蛋白生物標志物同時表現(xiàn)為陽性才可以確診為AD，因此未來多靶點檢測的方法將成為AD 早期檢測的重要手段。由于生物標志物陽性患者的異質性特點，目前依然無法給出一個確定的陽性判斷值，這進一步限制了生物標志物檢測方法在臨床上的應用。

2 納米技術在AD體外診斷中的應用

以納米技術為基礎的AD體外診斷技術是目前較為先進的檢測技術。納米技術不僅能夠實現(xiàn)低濃度生物標志物的富集，還能夠將生物反應轉化為光電信號并且將這些信號進一步放大，因此利用納米材料或者納米技術構建的納米生物傳感器平臺能夠在常規(guī)檢測技術無法檢測的濃度范圍內定量分析CSF和血液中AD相關的生物標志物。

盡早地識別AD有利于后續(xù)的治療，因此早期診斷成為AD研究領域一個備受關注的問題。目前AD的早期診斷迫切需要靈敏、精準、便捷、經(jīng)濟的檢測技術，AD 的納米體外診斷技術在早期診斷、預后判斷以及療效評估等方面展現(xiàn)了極大臨床應用潛力。

2.1 生物標志物的富集

通常情況下，目標蛋白在體液中的含量極低。例如，在CSF和血液中，Aβ和tau蛋白的濃度低至皮摩爾級別［49］。另外，復雜的體液環(huán)境為目標蛋白的檢測增加了難度。因此，許多檢測技術需要在檢測目標蛋白之前對其進行預富集和分離。

免疫捕獲是一種依靠抗原?抗體相互作用實現(xiàn)蛋白質、多肽等生物分子捕獲和濃縮的富集技術［50］。免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）是目前最常用的免疫捕獲新型生物納米材料。IMB實質上是一種表面覆蓋高分子或者化學小分子的磁性納米顆粒，表面修飾的氨基、羧基、巰基等能夠與抗體偶聯(lián)，磁性納米顆粒的超順磁性使其能夠在外加磁場的作用下定向移動。目前，免疫磁珠已經(jīng)可以用于細胞［51］、細胞外囊泡［52］、蛋白質［53］以及基因［54］的富集、分離和提純。

目前報道的許多AD相關生物標志物的檢測技術都使用IMB 對目標蛋白進行預富集。ADAM10是APP 的α 分泌酶，能夠通過裂解APP 來阻止Aβ的生成。研究表明，ADAM10的活性降低與AD病理相關［45］。在此基礎上，F(xiàn)aria 等［55］研制了一種用于CSF 和血漿中ADAM10 檢測的微流控平臺（圖3）。研究者首先使用羧基活化的免疫磁珠偶聯(lián)抗體，捕獲血漿樣本中的ADAM10，然后使用磁分離的方法將富含ADAM10 的免疫磁珠從血漿中分離出來，用于后續(xù)的檢測工作。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme?linked immune sorbent assays，ELISA）相比，使用該檢測方法能夠獲得更低的檢出限（limit of detection，LOD）。

Fig.3 Immunomagnetic capture of ADAM10 in a plasma sample and the detection using disposable microfluidic platform［55］圖3 血漿樣品中ADAM10的免疫磁性捕獲及一次性微流控平臺［55］

Tao 等［56］在使用滾環(huán)擴增電化學發(fā)光分析法檢測血漿中的Aβ40 和Aβ42 時，也使用了IMB 對目標蛋白進行預富集。在進行電化學分析之前，使用抗體功能化的IMB 捕獲血漿樣本中的Aβ。該方法獲得的Aβ40 和Aβ42 的LOD 分別是1.99 ng/L 和3.14 ng/L。此外，免疫捕獲還可以應用于目標蛋白的熒光檢測。Li等［57］使用氨基功能化的磁性納米顆粒和磁性納米棒偶聯(lián)不同抗體，分別捕獲CSF中的Aβ42 以及tau 蛋白。在進行熒光分子標記后，用全內反射熒光顯微鏡的電子倍增電荷耦合器件（electron?multiplying charge?coupled device，EMCCD）成像系統(tǒng)采集熒光信號，對CSF 中的Aβ42和tau蛋白進行定量分析。IMB的使用實現(xiàn)了對Aβ42和tau蛋白的預富集和純化，減少了CSF中其他成分對檢測信號的干擾，這大大提高了檢測的靈敏性和準確性。

2.2 納米生物傳感器的信號轉導與增強

生物傳感器是能夠將生物反應轉化為可測量信號的裝置，因其具有分析速度快、成本低、操作簡便等優(yōu)勢，成為生物醫(yī)學領域十分有前景的疾病診斷輔助工具［58］。納米技術的發(fā)展促進了生物傳感器的構成和性能提升［59］。納米材料和納米技術不僅可以促進生物信號轉換為可以量化的光電信號，而且可以憑借自身優(yōu)異的理化性質來提高生物傳感器的靈敏度，進而降低檢測極限。納米技術與生物傳感器的融合為AD生物標志物的檢測提供了更靈敏、更精準、更穩(wěn)定的檢測平臺。

2.2.1 電信號調控

電化學傳感器是生物傳感器領域的一個重要分支。電極與導電溶液接觸時會發(fā)生生物化學反應，電化學工作站通過監(jiān)測該過程的電流、阻抗和電導率的變化對分析物進行定量檢測［2］。

循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）是一種最常用的電化學分析方法。該方法主要是通過監(jiān)測溶液中發(fā)生的氧化還原反應實現(xiàn)對分析物的檢測，在AD 早期生物標志物的檢測中也有實用價值。例如，Costa?García等［60］在金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極上通過鏈霉親和素?生物素偶聯(lián)Aβ42，隨后加入Aβ 42和Aβ42抗體的混合溶液。由于抗體的結合位點有限，溶液中的Aβ42和電極上的Aβ42參與競爭反應。當反應達到平衡后，加入堿性磷酸酶耦合IgG抗體（Anti?IgG?AP）以及3?吲哚基磷酸鹽與銀離子的混合物（3?IP/Ag+）。在堿性磷酸酶催化作用下，溶液中發(fā)生酶促銀沉積反應，Ag+被還原成Ag0。此時進行CV 掃描，溶液中的氧化還原反應會引起峰值電流的變化，峰值電流的強度即可反映溶液中Aβ42 的濃度。研究結果表明，該免疫傳感器在為0.5～500 μg/L 范圍內可以對Aβ42 進行有效檢測，LOD為0.1 μg/L。

電化學阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）是另一個應用比較廣泛的電化學分析方法。Qin 等［61］制備了一種基于姜黃素的非酶電化學傳感器檢測Aβ 寡聚體（Aβ oligomer，AβO）。該工作利用姜黃素?鎳配合物修飾電極，鎳的存在增加了姜黃素的導電性。AβO 能夠阻礙電極表面的電子傳遞，導致電子轉移電阻明顯增加。實驗結果表明，在0.001～5 nmol/L的范圍內，姜黃素傳感器阻抗響應與AβO 的濃度呈現(xiàn)良好的線性對應關系。

方波伏安法（square?wave voltammetry，SWV）是一種快速、靈敏的電化學定量分析方法。SWV 可以用于AD 生物標志物tau441 的靈敏檢測。Guo 等［62］使用化學剝離的單層還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）修飾的電極進行tau 蛋白抗體功能化，隨后用于檢測AD 患者血清樣本中的tau441。tau441與電極表面抗體結合從而阻斷了電子的傳遞，因此隨著tau 蛋白濃度增加，SWV 峰值電流逐漸降低。該電化學傳感器在0.08～80 pmol/L的濃度范圍內與tau441的濃度有良好的線性關系，LOD為75 fmol/L。

差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）在物質痕量檢測分析中有著廣泛的應用。因其能夠降低背景的電流信號，表現(xiàn)出更高的靈敏度和更低的檢出限。Guo 等［63］研發(fā)了一種基于tau 蛋白抗體功能化金電極的電化學傳感器，用于檢測AD 患者血清樣本中的tau381。為了實現(xiàn)信號的進一步放大，研究者還制備了一種基于AuNPs的生物偶聯(lián)體，從而形成抗體?蛋白質?生物偶聯(lián)體的三明治結構。AuNPs 增加了電極表面的電子轉移效率，從而提高了DPV 電流峰值，進而起到信號放大的作用。該傳感器在0.5～100 μmol/L 范圍內能夠實現(xiàn)對tau381 的靈敏檢測，LOD為0.42 pmol/L。

2.2.2 光信號轉化

光學生物傳感器能夠將生物反應轉化為吸收、反射、散射和熒光等可量化的光學信號［2］。目前已經(jīng)發(fā)展了基于不同光學傳感技術的生物傳感器，用于檢測蛋白質、核酸和膽固醇等生物分子。表面等離激元共振（surface plasmon resonance，SPR）是一種重要的光學檢測技術，其工作原理是基于折射率（refractive index，RI）的變化來實現(xiàn)生物分子間相互作用的分析［64］。當生物分子與SPR 傳感芯片有結合時，芯片表面的質量增加引起RI的變化，進而SPR 角也隨之發(fā)生變化。因此SPR 角的動態(tài)變化即可反映生物分子間相互作用的特異性信號。SPR具有高通量、高靈敏度、無標記和實時監(jiān)測等優(yōu)點［65］，因此其在生物傳感檢測方面具有廣泛的應用。金納米薄膜和銀納米薄膜是制備SPR傳感芯片的常用材料，它們在近紅外和可見光范圍內能夠產(chǎn)生強烈的等離激元共振［66］。由于金納米薄膜具有很好的化學穩(wěn)定性和生物相容性，因此在SPR傳感器中更為常見。

借助金納米薄膜基底的SPR 傳感芯片，Homola課題組［67］實現(xiàn)了對CSF中tau?Aβ復合物的靈敏檢測。首先，端基為COOH?和OH?的硫醇分子在金基底上形成混合自組裝單分子膜（self?assembled monolayer，SAM），然后通過氨基偶聯(lián)的方法將tau蛋白抗體修飾在SAM上制備SPR傳感芯片。為了放大傳感器的檢測信號，研究者引入了AuNPs，實驗結果顯示，AuNPs能夠顯著增加不同濃度tau?Aβ 樣本的信號差異。該傳感器對CSF 中tau?Aβ復合物檢測的LOD為0.1 pmol/L。

為了提高受體與標志物的親和力，進而提高傳感器的特異性，近年來逐漸發(fā)展了抗體的替代品。例如，Yang課題組［68］使用類肽納米片層修飾的表面等離激元共振成像（SPR imaging，SPRi）傳感器實現(xiàn)對血清和血漿中Aβ的高靈敏高特異性檢測。具有識別環(huán)的類肽分子在外力作用下形成緊密堆積的納米片層（圖4），該納米片層能夠模擬抗體的功能，納米片層起到支撐作用，表面的識別環(huán)能夠與Aβ 發(fā)生特異性結合，從而產(chǎn)生SPR 響應信號。與抗體識別相比，類肽納米片層具有更高的穩(wěn)定性和更低的成本，并且在區(qū)分對照組和AD組血液樣本時，二者的信號差異更為顯著。實驗結果證明，該傳感器在區(qū)分對照組、MCI與AD組樣本時具有良好的效果，LOD低至皮摩爾級別。

Fig.4 Schematic illustration of the detection of Aβ42 in the serum or plasma by the loop-displaying peptoid nanosheets in combination with surface plasmon resonance imaging［68］圖4 環(huán)狀類肽納米片結合表面等離子體共振成像（SPRi）檢測血清或血漿中Aβ42的示意圖［68］

納米技術的發(fā)展為傳感器性能優(yōu)化奠定了基礎。近年來，在SPR技術的基礎之上，逐漸發(fā)展了另一種具有更高靈敏度的檢測技術，局域表面等離激元共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）技術［69］。與SPR類似的，該方法主要是通過檢測金屬納米結構上RI的變化引起共振波的偏移來檢測生物分子［70］。與SPR不同，LSPR傳感芯片表面不是金屬薄層，而是均勻分布的金屬納米結構，例如金納米球［71］、金納米星［72］和金納米棒［73］等納米結構。由于金屬納米結構和周圍介質之間界面處的RI變化會引起共振波長更大的偏移［70］，因此LSPR具有更高的靈敏度。

以均勻分散的AuNPs單層為基底，Ly等［74］制備了一種LSPR 傳感平臺，用來檢測AD 生物標志物蛋白Aβ42。在鏈霉親和素的幫助下，生物素功能化的Aβ42 單克隆抗體被固定在AuNPs 的Langmuir?Blodgett（LB）膜上，用于捕獲Aβ42。該傳感器能夠檢測到CSF 中微量的Aβ42，低至1 μg/L。

除了使用單一形狀的AuNPs，根據(jù)納米顆粒的形狀不同，LSPR 還可以對不同的生物標志物進行識別和檢測。在此基礎上，Kim 等［75］制備了一種形狀編碼的LSPR生物傳感器，用于檢測模擬血漿中的Aβ40、Aβ42以及tau蛋白。3種不同形狀的AuNPs 分別對Aβ40、Aβ42 以及tau 蛋白的抗體功能化，用于捕獲溶液中相應的生物標志物。隨后，研究者以不同的轉速對混合溶液進行離心，將分離產(chǎn)物分別進行LSPR 分析。該傳感器對3 種生物標志物檢測的LOD都達到了飛摩爾級別。

與LSPR 類似，拉曼光譜也是一種可以用于AD生物標志物檢測的光學傳感技術。拉曼散射效應本身的信號很弱，僅占整個散射光的千分之幾，因此很難將其直接應用。有研究者發(fā)現(xiàn)，粗糙表面能夠將其表面分子的拉曼光譜信號提高102～106倍［76］，這種效應被稱為表面增強拉曼（surface?enhanced Raman spectroscopy，SERS）效 應。SERS 包含分子的拉曼散射信息，通常稱之為“拉曼指紋”［77］?！袄讣y”可以用來識別目標蛋白，拉曼信號的強度則可以實現(xiàn)目標蛋白的定量分析。

SERS 是一種很有前途的生物分析傳感平臺，研究者已經(jīng)將SERS 應用于AD 早期生物標志物的檢測。為了進一步提高SERS的檢測性能，通過利用特殊納米結構來增加表面粗糙度，進而提高SERS 信號增強因子是一種有效途徑。Kim 等［78］使用一種銀納米間隙（silver nanogaps，AgNGs）作為納米探針，通過SERS 來檢測血液中的Aβ40和Aβ42。在進行AD 生物標志物檢測時，首先構建免疫磁珠?目標蛋白?AgNGs的三明治結構，利用免疫磁珠將其從血清樣本中分離出來，而后進行SERS分析。研究結果表明，AgNGs增加了原本銀納米顆粒（silver nanoparticle，AgNPs）的表面粗糙度，使SERS 信號強度增強高達7 個數(shù)量級，該傳感器的LOD可以低至0.25 μg/L。

僅靠肉眼觀察來區(qū)分正常人、AD患者以及其他癡呆患者的SERS譜圖是不可靠的。近幾年，人工智能的迅速發(fā)展為提高AD早期診斷的準確性帶來了新的希望。例如，Lednev 等［79］報道了一種SERS 與多元統(tǒng)計分析相結合的方法，借助人工神經(jīng)網(wǎng)絡（artificial neural network，ANN）對AD 患者血清樣本進行SERS譜的分析和分類，診斷靈敏度可以達到98%。

此外，電化學發(fā)光技術也可以實現(xiàn)AD生物標志物的靈敏檢測。電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）是在氧化還原反應中，發(fā)光基團通過電化學誘導產(chǎn)生光的過程［80］。ECL 傳感器可以通過數(shù)值變化來反映電極上的電荷轉移，從而定量分析待檢測物的濃度。釕（Ru）配合物是一種重要的電致發(fā)光材料，在光電傳感器中有廣泛的應用。Da 等［81］將其應用于Aβ42 聚集體的免疫檢測，開發(fā)了一種無標簽的紙基生物傳感器。在該傳感器中，［Ru（phen）2dppz］2+與Aβ42 聚集體鍵合后與溶液中的三丙胺發(fā)生氧化還原反應，導致電化學發(fā)光，最終的光信號由紙基雙電極電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)采集輸出，該方法可檢測到100 pmol/L Aβ42。石墨氮化碳納米片（graphitic carbon nitride nanosheet，g?C3N4NSs）具有良好的ECL 性質，并且具有比表面積大、導電性好和生物相容性高的優(yōu)點，在ECL 傳感器領域有良好的應用前景［82］。Deng 等［83］以AgNPs 改性的g?C3N4NSs 和Ru（bpy）32+摻雜的TiO2納米顆粒為發(fā)光元件（圖5），制備了一種用于檢測Aβ42的雙波長比率電化學發(fā)光傳感器。兩組發(fā)光元件分別在不同波長表現(xiàn)出穩(wěn)定的ECL 信號，使用兩個信號的比率作為檢測信號有利于排除外部的干擾，進而提高檢測的可靠性。該傳感器檢測Aβ42 的線性范圍為1×10-5至200 μg/L，LOD為2.6 ng/L。

2.3 檢測靈敏度的提高

碳納米材料，例如石墨烯（graphene）、碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）、碳納米纖維（carbon nanofibers，CNFs）等，具有良好的光學、電學以及力學性能，在能源、檢測和藥物遞送等領域具有重要的應用價值［84］。其中，石墨烯是一種極具影響力的碳材料，它是由單層碳原子排列成六角形或蜂窩狀晶格的二維碳納米材料，具有比表面積大、生物相容性好以及易于表面功能化等優(yōu)點［85］，對于提高檢測靈敏度非常有利，因此在納米生物傳感器領域有很大的實用價值。

借助石墨烯的優(yōu)良性質，Hwang 等［86］制備了一種氧化石墨烯場效應晶體管（graphene oxide field effect transistor，gFET）生物傳感器，對血漿中的Aβ42和tau蛋白進行超靈敏和多重檢測。還原氧化石墨烯（reduced graphene，rGO）為抗體的固定提供了大量結合位點，這大大增強了傳感器捕獲Aβ42和t?tau（總tau蛋白）的能力，進而提高了檢測的靈敏度。Awan 等［87］報道了另外一種用于檢測AD 的重要生物標志物凝聚素（clusterin）的gFET。該研究使用1?戊二酸丁二酰亞胺酯作為連接分子，將凝聚素抗體連接在退火石墨烯表面。實驗結果表明，該傳感器的最低檢出限為4 fmol/L。

Fig.5 Schematic illustration of preparation of dual-wavelength ratiometric electrochemiluminescence sensor［83］圖5 雙波長比率電化學發(fā)光傳感器制備示意圖［83］

CNTs 是由石墨烯卷曲形成的管狀結構，可分為單壁碳納米管（single?walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管（multi?walled carbon nanotubes，MWCNTs）。碳納米管擁有與石墨烯類似的性質，已經(jīng)被用于AD 早期生物標志物的檢測。例如，Park 等［88］研制了一種基于SWCNTs 薄膜的生物傳感器，用于同時檢測人體血漿中t?tau、p?tau181、Aβ42 和Aβ40 4 種AD 核心生物標志物。首先使用LB 膜方法制備了單層碳納米管薄膜，通過反復施加外力讓所獲得的單層碳納米管緊密堆積，單向排列（圖6）。緊密堆積的SWCNTs 結構為抗體的偶聯(lián)提供了更多有效活性位點，與隨機排列的碳納米管相比，可以將傳感器的檢測靈敏度提高1.88倍。

MWCNTs 也可以應用于AD 生物標志物的檢測。Yu 等［89］設計了一種用夾心法檢測Aβ 分子的高靈敏度的生物傳感器。該方法是以MWCNTs 和AuNPs 為基礎，依靠明膠蛋白來捕獲AD 大鼠CSF和腦組織中可溶性Aβ40 和Aβ42。一方面，MWCNTs 能夠加速電子的轉移；另一方面，巨大的比表面積為明膠蛋白提供更多的附著位點，這大大提高了檢測靈敏度。數(shù)據(jù)結果顯示，使用碳納米管能夠將電信號響應至少提高1倍［90］。

2.4 AD納米檢測技術的臨床價值

AD 生物標志物檢測平臺的構建以及性能優(yōu)化最終是為了滿足臨床應用的需求。臨床價值的體現(xiàn)是眾多傳感檢測平臺面臨的巨大挑戰(zhàn)。近年來，以納米技術為基礎的檢測平臺，在AD 的預后判斷、療效評估以及早期診斷等方面都顯現(xiàn)了實際應用價值。

2.4.1 疾病的預后判斷和療效評估

以納米科學為基礎的體外診斷技術具有操作簡單和便于攜帶的優(yōu)點，能夠實現(xiàn)對生物標志物的實時監(jiān)測。例如，Singh 等［91］開發(fā)了一種用于同時檢測Aβ40和Aβ42的生物傳感芯片。該芯片連接了便攜式讀取器并且將其與移動手機應用程序相結合，用于數(shù)據(jù)的分析和采集。盡管該設備并沒有應用于真實樣本的分析，但是提供了一種可視化AD生物標志物的實時監(jiān)測方法，可能用于藥物療效的評估。

Fig.6 Schematic illustration of a densely aligned CNT sensor array for AD biomarkers［88］圖6 AD生物標志物密集排列的CNT傳感器陣列示意圖［88］

盡管AD 治療藥物的研發(fā)工作［92?95］從未停止，但目前依然沒有能夠治療AD的特效藥物。目前已有AD治療藥物的有效成分主要都是乙酰膽堿酯酶抑制劑（acetylcholinesterase inhibitors，AChEIs）［96］，因此，檢測藥物對乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的抑制效果在藥物的研發(fā)過程中至關重要。rGO的能帶結構中，其布里淵區(qū)邊界的高對稱點上存在具有線性色散關系的上下錐形結構，這些錐形結構的頂點稱之為狄拉克點。狄拉克點的位移變化可以用來評估rGO 表面發(fā)生的化學反應。在此基礎上，Hwang等［97］制備了一種AChE 功能化的gFET。AChE 與乙酰膽堿（acetycholine，ACh）之間的酶催化反應會引起狄拉克點位移，從而可以推斷溶液中ACh 的濃度。作者使用該設備驗證了兩種常見的AChE 抑制劑，多奈哌齊和卡巴拉汀對AChE 有明顯的抑制效果。該工作提供了一種乙酰膽堿的檢測方法，并在藥療效評估方面具有一定的應用價值。

2.4.2 疾病的早期診斷

到目前為止，由于AD 的致病機理尚不清晰，臨床上針對AD 的治療方法只能延緩而不能阻止AD的發(fā)生。如果能夠在MCI期甚至臨床前期識別AD 風險人群，將對后續(xù)的治療有重要的指導意義。

由于rGO 具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，常被用于構建生物傳感器，對AD血液樣本進行分析。Hwang 等［98］制備了一種依賴于電阻變化的rGO傳感器。為了評估傳感器的檢測性能，作者應用該傳感器檢測血漿分離細胞外囊泡中的Aβ42，結果表明rGO傳感器在區(qū)分AD患者和正常對照組的臨床樣本時顯示出顯著的信號差異（P<0.001），這說明該傳感器在AD 診斷方面具有臨床應用潛力。

基于SWCNTs的生物傳感器也可以用于AD患者血液樣本的分析。Kim 等［88］借助緊密堆積的SWCNTs薄膜生物傳感器，提供了一種基于血液樣本的多靶點檢測方法。通過測量血液樣本中t?tau/Aβ42、p?tau181/Aβ42和Aβ42/Aβ40的檢測信號值，該傳感器能夠實現(xiàn)臨床診斷中AD患者與健康對照組的區(qū)分。該傳感器的平均靈敏度為90.0%，選擇性為90.0%，平均準確率為88.6%。

目前已經(jīng)有許多納米檢測技術應用于臨床樣本的分析，要想應用于對臨床樣本進行AD疾病進展的判斷，早日實現(xiàn)AD的早期診斷，還需要進一步提高檢測器靈敏度、準確性等檢測性能。

3 總結與展望

盡管人們對AD致病機制進行了長達近百年的探索，目前依然無法對AD 有一個透徹清晰的認識。這也是阻礙AD 特效藥物研發(fā)的一個關鍵因素。已經(jīng)獲得批準的AD治療藥物主要是用來延緩AD 疾病進展，而不能從根本上阻止AD 進展，因此，AD的早期診斷顯得至關重要。在眾多檢測方法中，納米體外診斷技術具有顯著的優(yōu)勢。納米技術不僅能夠將檢測信號轉換成光學、電學等易于檢測的信號，而且還能通過納米材料本身的性質優(yōu)化檢測設備的性能。

近年來報道的檢測方法主要聚焦于檢測靈敏度的提高，要想在CSF和血漿這樣成分復雜的體系中實現(xiàn)AD生物標志物的精準檢測，提高檢測靈敏度仍然是一個值得關注的話題。越來越多的研究結果表明，對單一生物標志物的檢測無法實現(xiàn)對AD進展的準確判斷。為了提高檢測的準確度，目前的研究方向逐漸從僅針對單一靶點的檢測過渡到多個靶點的同時檢測。另外，要想在CSF和血液等復雜的體液中準確定量生物標志物，受體的特異性識別能力也是影響檢測性能的關鍵因素。目前已經(jīng)發(fā)展了多肽、類肽、核酸適配體等可替代抗體的受體識別分子。未來還需要開發(fā)更多特異性更強的受體識別元件。同時，在進行復雜體液的檢測工作中，傳感器的信號穩(wěn)定性、重現(xiàn)性有待進一步研究。為了將目前的檢測技術早日應用于AD的臨床診斷，除了提高檢測靈敏度之外，診斷靈敏度也是一個值得關注的因素。人工智能的興起，提供了一種更為準確的AD 診斷輔助工具。為了更好地實現(xiàn)AD 的預后判斷，實時追蹤AD藥物的治療效果，小型化、集成化的傳感芯片有待開發(fā)。納米技術、微流控技術、芯片制造技術和人工智能技術等的有機結合將推動AD 體外診斷技術的快速發(fā)展，AD 早期診斷有望成為現(xiàn)實。