丁銀亮 張凡云 孫懿 成杰 趙海燕 王文己

骨骼作為人體的主要物理支架，其完整性可因外傷、腫瘤、感染、畸形等多種原因而受到破壞[1]，骨折不愈合、骨缺損等問題嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。骨的修復(fù)和再生是復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，大致可分為炎癥期、修復(fù)期和重塑期3個(gè)階段，在整個(gè)過程中，多種細(xì)胞和細(xì)胞因子等發(fā)生相互作用[2]。骨修復(fù)和再生過程中的主要細(xì)胞來源是干細(xì)胞，該過程中，調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并進(jìn)一步發(fā)育為成熟骨細(xì)胞，從而發(fā)揮骨生成作用是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞來源外泌體對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化有至關(guān)重要的影響，并對成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞有一定調(diào)控作用。本文回顧相關(guān)文獻(xiàn)，對現(xiàn)階段巨噬細(xì)胞來源外泌體成骨作用的研究進(jìn)行綜述，為后續(xù)探究成骨作用機(jī)制和進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 巨噬細(xì)胞和外泌體

巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的常見效應(yīng)細(xì)胞，根據(jù)其來源可分為2類：一類來源于骨髓造血系統(tǒng)，即單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)[3]；另一類來源于胚胎時(shí)期擴(kuò)散到機(jī)體不同組織的常駐巨噬細(xì)胞（如肝Kupffer細(xì)胞、表皮Langerhans細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞群等）[4-5]。這2類巨噬細(xì)胞在體內(nèi)多數(shù)組織中可見共存狀態(tài)[6]。近年發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在機(jī)體發(fā)育、穩(wěn)態(tài)平衡、組織修復(fù)和再生中也具有重要作用[7]。巨噬細(xì)胞對骨折愈合過程有關(guān)鍵影響，其能夠調(diào)控和招募間充質(zhì)干細(xì)胞，完全參與骨修復(fù)和再生過程，巨噬細(xì)胞缺乏可導(dǎo)致明顯的骨折愈合障礙[8-9]。近年來越來越多的研究表明，相較于細(xì)胞因子，巨噬細(xì)胞可能更多地通過外泌體靶向作用于間充質(zhì)干細(xì)胞的方式調(diào)控成骨活動(dòng)。

外泌體是一類由多種細(xì)胞的質(zhì)膜或內(nèi)體膜通過出芽方式形成的30～200 nm的細(xì)胞外囊泡，其內(nèi)部富含核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸、糖復(fù)合物和代謝產(chǎn)物等多種物質(zhì)[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在細(xì)胞間的通訊中發(fā)揮極其重要的作用，親代細(xì)胞釋放的外泌體通過配體-受體特異型結(jié)合、膜融合或胞吞作用等方式作用于靶細(xì)胞，調(diào)控其生物學(xué)過程[12]。已有研究證實(shí)，外泌體與骨相關(guān)疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松癥、骨折和骨關(guān)節(jié)炎等）之間有著密切聯(lián)系，其對骨代謝和骨穩(wěn)態(tài)有重要影響[13-14]。近年來，巨噬細(xì)胞外泌體已成為繼間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體后又一個(gè)研究熱點(diǎn)。

2 巨噬細(xì)胞來源外泌體的成骨作用

2.1 不同極化亞型巨噬細(xì)胞外泌體的成骨作用

巨噬細(xì)胞具有極化特性，在不同的微環(huán)境因素刺激下可分化為2個(gè)不同亞型：促炎性的M1型巨噬細(xì)胞和抗炎性的M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞由脂多糖或輔助性T細(xì)胞（Th）1細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β等刺激分化而來，可分泌促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、腫瘤壞死因子（TNF）-α等。M2型巨噬細(xì)胞由Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-13等刺激分化而來，可分泌抗炎因子IL-10 、TGF-β等[15-16]。巨噬細(xì)胞主要通過調(diào)控和招募間充質(zhì)干細(xì)胞來促進(jìn)成骨作用，其不同極化亞型釋放的外泌體對間充質(zhì)干細(xì)胞的影響有明顯差異。

Xiong等[17]研究發(fā)現(xiàn)，分別用M1型巨噬細(xì)胞外泌體（M1D-Exos）和M2型巨噬細(xì)胞外泌體（M2D-Exos）與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，可見M2D-Exos組細(xì)胞的礦物質(zhì)沉積水平、堿性磷酸酶（ALP）活性和染色程度均明顯高于M1D-Exos組細(xì)胞，成骨相關(guān)基因如膠原蛋白I、ALP、骨鈣素（OCN）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）表達(dá)也更高；在小鼠骨折模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，M2D-Exos治療組骨折部位的骨痂體積更大，骨量更多，骨密度和成骨基因表達(dá)更高。該研究表明，M2D-Exos較M1D-Exos具有更好的成骨作用。不過，該研究沒有設(shè)立未極化的M0型巨噬細(xì)胞外泌體（M0D-Exos）對照組，無法得知2種極化巨噬細(xì)胞亞型與未極化亞型的成骨作用是否存在差異。Kang等[18]的研究則顯示，M0D-Exos和M2D-Exos均有明顯成骨作用，且兩者間無差異，而M1D-Exos相較前兩者表現(xiàn)出了成骨抑制作用。張程等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高糖、高胰島素條件下小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力明顯下降，而使用M2D-Exos干預(yù)則能緩解上述成骨抑制作用，間接證實(shí)M2D-Exos具有成骨作用。Li等[20]的研究也得到相似結(jié)果，即M2D-Exos具有更明顯的成骨作用。

雖然上述多項(xiàng)研究表明M2D-Exos具有更強(qiáng)的成骨作用，但另一些研究卻得出不同結(jié)論。Wu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，用M1D-Exos對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，與M0D-Exos組和陰性對照組相比，其ALP活性、茜素紅染色程度均明顯升高，成骨相關(guān)基因如ALP、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（OSX）和RUNX2的表達(dá)也顯著增加。他們認(rèn)為，M1D-Exos較M0D-Exos的促成骨分化作用更明顯。Xia等[22]的研究也得出類似結(jié)果。他們發(fā)現(xiàn)，與M0D-Exos和M2D-Exos比較，M1D-Exos表現(xiàn)出更明顯的成骨作用。

由此可見，不同極化亞型巨噬細(xì)胞外泌體之間有明顯的成骨作用差異，且在不同研究中同一亞型巨噬細(xì)胞外泌體也存在成骨作用差異。Xia等[22]研究認(rèn)為，這種差異可能來自巨噬細(xì)胞來源譜系和細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的影響，但其具體原因仍需進(jìn)一步探究。

2.2 外部因素對巨噬細(xì)胞外泌體成骨作用的影響

研究表明，糖尿病能夠增加骨折延遲愈合和不愈合的風(fēng)險(xiǎn)[23]。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠體內(nèi)微環(huán)境的改變可刺激巨噬細(xì)胞發(fā)生一定變化，其外泌體較正常巨噬細(xì)胞外泌體對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力被明顯抑制。體外研究顯示，細(xì)胞礦化比例下降，成骨相關(guān)基因表達(dá)明顯下調(diào)，體內(nèi)研究也得到相似結(jié)果[24]。史亞方等[25]研究發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌感染巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體能夠刺激小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)，抑制成骨能力。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Zn離子刺激對巨噬細(xì)胞外泌體的成骨作用有不同影響，ZnCl2溶液濃度為4 μmol/L時(shí)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨作用最強(qiáng)，而濃度為20 μmol/L時(shí)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷徙能力最強(qiáng)。Zhu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Mg離子能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的自噬作用和極化類型，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞外泌體對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用。Wei等[28]研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體表現(xiàn)出顯著的成骨作用。巨噬細(xì)胞外泌體的成骨能力受外部因素影響無庸置疑，而對于促進(jìn)或抑制巨噬細(xì)胞外泌體成骨能力的其他影響因素仍需進(jìn)一步探究，這對于臨床應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。

2.3 巨噬細(xì)胞外泌體在骨組織工程支架中的應(yīng)用

骨骼的自我修復(fù)和再生能力是有限的，通常需要人為干預(yù)來促進(jìn)該過程，為此骨組織工程學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。骨組織工程學(xué)通過組織工程支架將細(xì)胞或生長因子等植入病損區(qū)域，從而促進(jìn)骨修復(fù)和再生[29]。Wei等[28]將BMP-2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體整合到鈦納米管中制備成緩釋支架系統(tǒng)。他們發(fā)現(xiàn)，該支架系統(tǒng)不僅能增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化作用，還能調(diào)控其自噬作用和細(xì)胞因子的分泌。Sun等[30]利用3D打印技術(shù)將巨噬細(xì)胞經(jīng)不同濃度β-磷酸三鈣(β-TCP)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的外泌體分別組建入海藻酸鈉和透明質(zhì)酸基水凝膠支架中，發(fā)現(xiàn)該支架系統(tǒng)能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、黏附及成血管相關(guān)基因表達(dá)，其中25 mg/mL的β-TCP誘導(dǎo)后組建的支架系統(tǒng)能夠明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗炎和組織修復(fù)細(xì)胞募集作用，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附、增殖及成骨分化作用，上調(diào)其免疫抑制因子表達(dá)。由此可見，巨噬細(xì)胞外泌體作為載體植入骨組織工程支架，將是未來骨修復(fù)和骨缺損等疾病治療的另一可能方式，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

2.4 巨噬細(xì)胞外泌體調(diào)控成骨作用的機(jī)制

微RNA（miRNA）是一種小分子RNA，其通過靶向結(jié)合于目標(biāo)基因mRNA的方式抑制蛋白質(zhì)翻譯過程，進(jìn)而調(diào)控該基因的表達(dá)[31]。大量研究表明，miRNA是調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨作用的關(guān)鍵介質(zhì)，例如miR-217[32]、miR-291a-3p[33]等表達(dá)上調(diào)可明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，而miR-128-3P[34]、miR-381[35]等表達(dá)上調(diào)則會(huì)抑制其成骨能力。

Kang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，M1D-Exos和M2D-Exos富含的特異型miRNA有明顯不同，這些特異型miRNA在一些成骨相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。M1D-Exos富含的特異型miR-155通過作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)BMP2、BMP9、RUNX2等骨誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化；而M2D-Exos富含的特異型miR-378a則能夠通過上調(diào)BMP2和BMP9的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，M2D-Exos富含的miR-690能夠作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的胰島素受體底物-1(IRS-1)/TAZ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)成骨相關(guān)基因RUNX2和OCN的表達(dá)水平，發(fā)揮成骨作用。Xiong等[17]研究發(fā)現(xiàn)，M2D-Exos中富含的miR-5106可被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞攝取，通過作用于鹽誘導(dǎo)激酶（SIK）2和SIK3基因靶點(diǎn)，調(diào)控相關(guān)信號通路，促進(jìn)成骨分化作用。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠模型來源的巨噬細(xì)胞外泌體可以通過富含的miR-144-5p與BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的Smad1靶基因結(jié)合，下調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)，抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。

在上述研究中，巨噬細(xì)胞外泌體均通過富含的特異型miRNA作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而正向或負(fù)向調(diào)控成骨過程。此外，顯而易見的是，巨噬細(xì)胞極化類型導(dǎo)致的成骨作用差異也與其富含的miRNA關(guān)系密切。Zhu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Mg離子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞外泌體成骨能力的改變主要是由于miR-381表達(dá)下調(diào)。Sun等[30]研究發(fā)現(xiàn)，β-TCP刺激改變了巨噬細(xì)胞外泌體中部分miRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響了對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等的調(diào)控作用。上述研究并未涉及具體的調(diào)控通路機(jī)制，對此仍需進(jìn)一步探究。

此外，一些研究顯示,巨噬細(xì)胞外泌體分別通過激活Hedgehog信號通路和絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)/BMP-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[19,21]，但該過程主要受哪些miRNA調(diào)控尚未得到驗(yàn)證,巨噬細(xì)胞外泌體中富含的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸、糖復(fù)合物和代謝產(chǎn)物等是否參與成骨調(diào)控過程，亦需要進(jìn)一步探究。

3 結(jié)語

巨噬細(xì)胞來源外泌體具有成骨調(diào)控作用，不同的巨噬細(xì)胞極化亞型和外界因素刺激均能影響其調(diào)控能力，而這種成骨調(diào)控作用主要通過外泌體中包含的miRNA等實(shí)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞外泌體也可作為載體在組織工程支架中使用。目前，巨噬細(xì)胞來源外泌體的成骨研究正處于迅速發(fā)展階段，對具體調(diào)控機(jī)制、影響成骨作用的其他因素以及在骨組織工程學(xué)中的應(yīng)用仍需開展進(jìn)一步探究，為臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。