郎晉榮，郝 月，王俊怡，趙婷婷，王 詩(shī)

(湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院 湖北 咸寧 437100)

食品中存在的膽堿、甜菜堿和左旋肉堿等被腸道微生物代謝后形成三甲胺(TMA)，TMA進(jìn)一步吸收進(jìn)入肝臟中，并在黃素依賴(lài)性單加氧酶(FMO)的作用下氧化生成氧化三甲胺(TMAO)[1]，主要通過(guò)腎臟代謝隨尿液排出[2]。當(dāng)血清中的TMAO水平升高時(shí)，會(huì)阻止膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致動(dòng)脈壁炎癥和內(nèi)皮機(jī)能障礙[3]，使動(dòng)脈粥樣硬化加劇，增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。臨床研究已經(jīng)證實(shí)，血漿TMAO水平可以預(yù)測(cè)穩(wěn)定性冠狀動(dòng)脈疾病患者的五年死亡風(fēng)險(xiǎn)[5]，還可作為早期動(dòng)脈粥樣硬化的生物標(biāo)志物[6]。研究表明，TMAO的增加干擾了脂質(zhì)代謝且增強(qiáng)了血小板的高反應(yīng)性，這說(shuō)明它是血栓形成和心力衰竭的危險(xiǎn)因素[7]。TMAO還與糖尿病[8]和慢性腎臟疾病[9]等有關(guān)聯(lián)。因此，TMAO的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)多種疾病的早期發(fā)現(xiàn)及早期治療有重要意義。

常用的TMAO檢測(cè)方法中，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[10]及核磁共振[11](NMR)法準(zhǔn)確度和靈敏度較高，但程序復(fù)雜、分析儀器昂貴，而且需要受過(guò)專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練的人員操作設(shè)備，限制了其在即時(shí)檢測(cè)(POCT)中的應(yīng)用。傳感器是一種有吸引力的分析方法，因?yàn)樗捻憫?yīng)時(shí)間快、選擇性高且操作簡(jiǎn)單，尤其適用于小型實(shí)驗(yàn)室的分散測(cè)試或現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)[12]。本文綜述了近年來(lái)TMAO傳感器的研究進(jìn)展，為T(mén)MAO的檢測(cè)提供參考。

1 微生物電化學(xué)傳感器

微生物電化學(xué)技術(shù)是電化學(xué)活性微生物(EAMs)和生物電化學(xué)系統(tǒng)(BESs)的結(jié)合，EAMs代替酶提高了電化學(xué)傳感器的檢測(cè)靈敏度，并且簡(jiǎn)化了傳感器的制備過(guò)程，它的特征是細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移(EET)[13]，電子通過(guò)內(nèi)向途徑從電極轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)還原酶[14]。靳宏偉[15]設(shè)計(jì)了以希瓦氏MR-1菌為識(shí)別元件的全細(xì)胞生物電化學(xué)傳感器，可以用來(lái)檢測(cè)TMAO，最低檢測(cè)限為10μmol/L，在10μmol/L～2mmol/L的檢測(cè)范圍內(nèi)線性相關(guān)方程為y=6.141x+91.511，相關(guān)系數(shù)為0.9985。該傳感器有特異性、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好且容易操作等優(yōu)點(diǎn)。Yi等[16]報(bào)道了一種基于微生物電化學(xué)技術(shù)的TMAO檢測(cè)方法，證明了附著的希瓦氏PV-4菌(S.loihica PV-4)能夠同時(shí)進(jìn)行內(nèi)向胞外電子轉(zhuǎn)移和TMAO還原，實(shí)現(xiàn)了將TMAO濃度直接轉(zhuǎn)化為電信號(hào)；結(jié)果還顯示線性檢測(cè)范圍為0～250μmol/L，檢測(cè)限為5.96μmol/L，檢測(cè)過(guò)程在600s內(nèi)完成；此外，用小牛血清代替DM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)的TMAO水平相差小于9%，表明附著的S.loihica PV-4能夠準(zhǔn)確檢測(cè)血清中的TMAO真實(shí)水平。雖然該方法靈敏度高、檢出限低，且樣品處理和傳感器制備簡(jiǎn)單，但是人的血清成分復(fù)雜，在臨床應(yīng)用中的可行性有待探索。

2 電化學(xué)酶生物傳感器

電化學(xué)酶生物傳感器由固定化酶與信息轉(zhuǎn)換器構(gòu)成，通過(guò)將底物消耗或酶反應(yīng)產(chǎn)物形成過(guò)程中的變化轉(zhuǎn)換成可測(cè)量的電信號(hào)，從而檢測(cè)特定的分析物，其具有特異性、靈敏性高等特點(diǎn)[17-18]。Mitrova等[19]報(bào)道了一種用于測(cè)定TMAO的酶電化學(xué)生物傳感器，該傳感器將嵌合的TMAO還原酶(TorA-FDH)固定在碳電極表面，用葡萄糖氧化酶(GOD)和過(guò)氧化氫酶(Cat)脫氧，通過(guò)其催化還原反應(yīng)檢測(cè)TMAO。該傳感器的靈敏度為14.16nA/μmol/L，線性檢測(cè)范圍為2～110μmol/L，檢測(cè)限為2.96nmol/L，響應(yīng)時(shí)間為(16±2)s。Waffo等[20]報(bào)道了一種基于TorA的電化學(xué)TMAO生物傳感器，為了在沒(méi)有氧氣干擾的情況下測(cè)量，使用聚乙烯醇(PVA)水凝膠構(gòu)建基于GOD和Cat反應(yīng)的O2清除膜，它對(duì)于局部保護(hù)傳感器的傳感層免受O2的影響很有效，使TMAO的檢測(cè)更加簡(jiǎn)便，但它降低了傳感器的靈敏度[(2.75±1.7)μA/mmol/L]，增加了響應(yīng)時(shí)間(約33s)。雖然電化學(xué)酶生物傳感器操作簡(jiǎn)單且可應(yīng)用于POCT中，但它的制備過(guò)程復(fù)雜，由于介導(dǎo)的電催化TorA反應(yīng)易受氧的干擾，所以要制作O2清除膜去除氧，這使它在臨床應(yīng)用中易受環(huán)境干擾。

3 基于分子印跡聚合物的電化學(xué)傳感器

分子印跡技術(shù)(MIT)起源于20世紀(jì)80年代，在免疫學(xué)領(lǐng)域誕生，通過(guò)MIT制備針對(duì)靶向目標(biāo)分子的人工合成受體，即分子印跡聚合物(MIPs)，具有獨(dú)特的物理化學(xué)性能及特異識(shí)別性[21]。Yang等[22]的研究表明，用MIPs構(gòu)建的電化學(xué)傳感器，其靈敏度和性能都得到了提升。聚吡咯(PPy)具有合適的氧化還原特性、環(huán)境穩(wěn)定性和電化學(xué)性能[23]，在基于MIPs電化學(xué)生物傳感器中應(yīng)用廣泛。Lakshmi等[24]采用PPy作為印跡聚合物基質(zhì)，制備了一種基于MIPs的電化學(xué)傳感器，TMAO分別通過(guò)-NO和-NH基團(tuán)之間的氫鍵連接到PPy上，用于檢測(cè)體液中的TMAO，使用差分脈沖伏安法(DPV)記錄檢測(cè)響應(yīng)，結(jié)果顯示隨著TMAO濃度的增加，峰值電流降低。該傳感器的線性檢測(cè)范圍為1～15ppm，靈敏度為2.47μA mL/(ppm cm2)，檢測(cè)限為1.0ppm/mL，響應(yīng)時(shí)間為20min，對(duì)體液(如尿液)中的TMAO具有高選擇性。該傳感器靈敏度高、檢測(cè)限低并且制備簡(jiǎn)單，但響應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，限制了在POCT中的應(yīng)用。

4 基于MOFs的TMAO電化學(xué)傳感器

金屬有機(jī)骨架材料(metal organic frameworks，MOFs)是一種新型納米材料，由金屬離子或金屬簇與有機(jī)配體組成，具有高比表面積、良好的吸附性能和孔隙率可調(diào)控等特點(diǎn)。王悅[25]制備了Cd-MOFs-RGO-MPA/Au，循環(huán)伏安法(CV)證明了它對(duì)TMAO的電催化作用，差分脈沖伏安法(DPV)檢驗(yàn)了其對(duì)TMAO的響應(yīng)性能，峰電流與TMAO濃度在1.3×10-9～6.66×10-8mol/L及6.66×10-8～6.66×10-7mol/L均呈現(xiàn)線性關(guān)系，檢出限為4.45×10-10mol/L。

5 TMAO比色傳感器

近年來(lái)，在生物醫(yī)學(xué)傳感領(lǐng)域，基于比色陣列的傳感器研究發(fā)展迅速，通用性和靈敏度都得到了提升，既可用于檢測(cè)和識(shí)別單個(gè)化合物，也可用于區(qū)分氣態(tài)或水態(tài)中高度相似的復(fù)雜混合物[26]。與傳統(tǒng)電子傳感器的本質(zhì)區(qū)別在于，傳感器信號(hào)不依賴(lài)于分析物分子的物理吸附，而是依賴(lài)于改變各種化學(xué)反應(yīng)性染料的顏色，克服了傳統(tǒng)電子傳感器的局限性。Li等[27]用超聲噴霧熱解(USP)制備了有機(jī)改性二氧化硅染料微球組成的13元素比色傳感器陣列，結(jié)果表明該傳感器的線性檢測(cè)范圍為10～100μmol/L，檢測(cè)限為4μmol/L。但是，該方法需要一個(gè)密封的容器，在聚丙烯膜上輸送13種墨水，還要分離其他胺分析物，這限制了其在即時(shí)TMAO測(cè)試中的應(yīng)用。Chang等[28]設(shè)計(jì)了一種快速檢測(cè)TMAO的比色分析方法，該方法通過(guò)使用聚烯丙胺鹽酸鹽包覆的二氧化錳納米顆粒(PAH@MnO2NPs)納米酶對(duì)全血中的TMAO進(jìn)行“顏色開(kāi)關(guān)”傳感和定量分析，可直接定量檢測(cè)全血中的TMAO，無(wú)需對(duì)血液樣品進(jìn)行預(yù)處理；結(jié)果表明該傳感器的定量限小于6.7μmol/L，線性檢測(cè)范圍為15.6～500μmol/L，與傳統(tǒng)方法(LC-MS)相比，該傳感器易于操作、快速靈敏且成本低。

6 結(jié) 語(yǔ)

TMAO的水平與人類(lèi)健康密切相關(guān)，例如心血管疾病患者血液中的TMAO含量及慢性腎臟疾病(CKD)患者尿液中TMAO水平均高于正常人[29]。因此，快速檢測(cè)血清或尿液中的TMAO對(duì)一些臨床疾病的診斷和治療有重要意義。目前，關(guān)于TMAO傳感器的研究較少，各項(xiàng)技術(shù)仍存在一些問(wèn)題，如傳感器的制作成本較高，系統(tǒng)誤差大以及靈敏度偏低、重復(fù)性較差等。目前，研究者們?nèi)灾铝τ谔岣逿MAO傳感器各方面的性能，以期更加便捷、快速、靈敏的檢測(cè)實(shí)際樣本中的TMAO。