崔福玲，孟令強,王 靜，馬志國

1.山東省濱州市人民醫(yī)院康復醫(yī)學科，山東濱州，256610； 2.山東省東營市中醫(yī)院檢驗科,山東東營 257000；山東省德州市人民醫(yī)院：3.眼科；4.檢驗科，山東德州 253000

視網膜色素變性是視網膜變性里最常見的一組以進行性光感受器細胞及視網膜色素上皮功能喪失為共同表現(xiàn)的致盲性眼病，在臨床表型和潛在的遺傳缺陷方面具有很強的異質性[1]。RP發(fā)病率為1/3 500～1/5 000，影響全球約150萬人[2]。近年來視網膜色素變性基因的發(fā)現(xiàn)主要依靠二代測序技術，二代測序技術能夠并行測序所有已知的相關基因，從預選的基因組區(qū)域產生數(shù)百萬個讀數(shù)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，所有突變患者發(fā)病年齡均在21歲以下，提示可能沒有必要對50歲以上的患者進行常規(guī)篩查[4]。本研究對本院臨床確診為視網膜色素變性的人群進行二代測序技術測序和Sanger驗證，分析總結視網膜色素變性的視網膜色素變性1基因(RP1基因)突變及其引起的特殊臨床表現(xiàn)特征，為后續(xù)臨床確診和遺傳咨詢等工作提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究采用橫斷面研究設計。將2018年1月至2019年7月在山東省濱州市人民醫(yī)院確診的視網膜色素變性25個家系共86例患者納入本研究。納入標準：(1)夜盲史；(2)視力逐漸下降；(3)典型眼底改變，視盤呈蠟黃色萎縮，視網膜有骨細胞樣色素沉著，血管變細，視網膜呈青灰色；(4)早期周邊視野呈環(huán)形暗點，晚期視野呈向中心縮窄；(5)病變早期即可出現(xiàn)視網膜電圖(ERG)、眼電圖(EOG)明顯異常。其中，男43例，女43例；年齡9～88歲，平均(49.44±3.67)歲。排除標準：(1)不能配合完成相關檢查者；(2)無法判斷發(fā)病原因是遺傳因素引起者；(3)無家系血樣可以進行基因驗證者。

患者和家系成員均通過標準臨床檢查，以明確診斷，并排除其他非遺傳因素引起的眼部疾病。臨床檢查包括病史詢問、物理檢查等。其中，病史詢問包括基礎個人信息(包括性別、年齡、籍貫、民族等)，主訴，現(xiàn)病史(初次發(fā)病時間、發(fā)病規(guī)律、就診情況、用藥情況、并發(fā)癥種類和時間等)，既往史(全身情況、基因檢測史等)，家族遺傳史，手術和藥物使用史，婚育史等。物理檢查包括視力和矯正視力、非接觸性眼壓、色覺、B超(天津邁達，型號ODM-2200)、視野(卡爾蔡司，型號750i)、眼前節(jié)照相、眼底彩色照相(Topcon，型號TRC NW-300)、光相干斷層掃描(OCT,型號Cirrus HD-OCT 5000)。除此之外，患者還進行常規(guī)肘部靜脈采血，采用高通量二代基因測序技術進行基因測序[5]。

1.2樣本采集 將符合要求的患者及家系成員常規(guī)采集肘部靜脈血5 mL，ETDA抗凝，-80 ℃保存。

1.3提取基因組DNA

1.3.1DNA提取 QIAGEN試劑盒提取外周血的DNA，Qubit 熒光儀檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.3.2文庫制備 參考華大基因的BGISEQ-500的文庫構建指導手冊進行。(1)將質量合格的DNA樣品通過超聲波高性能樣品處理系統(tǒng)(Covaris)隨機打斷，經過片段選擇后得到150～250 bp的片段；(2)隨后進行DNA片段末端修復，3′端加上“A”堿基，兩端加上文庫接頭；(3)接頭連接后的文庫進行線性擴增(LM-PCR)制備成雜交文庫；(4)雜交文庫與眼科基因芯片(深圳華大生命科學研究院提供792個基因Panel，其中視網膜色素變性基因78個)進行捕獲富集，洗脫未富集的片段后進行擴增；(5)擴增產物進行單鏈分離和環(huán)化處理，環(huán)化文庫進行滾環(huán)復制生成DNA納米球。采用Qubit熒光儀檢測文庫濃度進行質量控制。

1.3.3上機測序 質量控制合格的文庫采用BGISEQ-500 PE50+10程序上機測序，共檢測792個眼科目標基因，其中含有78個視網膜色素變性相關基因。

1.3.4信息分析 (1)從測序儀獲取原始數(shù)據(jù)(FASTQ數(shù)據(jù))；(2)過濾：對原始FASTQ數(shù)據(jù)進行質量控制，去除低質量數(shù)據(jù)；(3)比對：利用SOAP和BWA軟件，使用hg19參考序列進行比對；(4)去重復：基于Picard的去重復算法，去除重復序列；(5)變異檢測：基于GATK對數(shù)據(jù)進行變異檢測；(6)變異注釋：使用Next GENe5.4.5分析軟件對基因變異與特殊臨床表型的相關性進行分析；使用頻率數(shù)據(jù)庫dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫、ESP6500數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫及BGI內部數(shù)據(jù)庫進行頻率注釋；使用HGVS對變異進行標準命名；使用OMIM、HGMD等疾病數(shù)據(jù)庫進行突變及疾病注釋。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析?；蛲蛔円园俜致时硎荆M間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1測序結果 25個家系共86例患者，目標序列平均測序深度為107.79，目標序列覆蓋率平均99.93%。平均99．98%目標序列覆蓋率>10×，平均95.41%的目標序列覆蓋率>30×，測序深度和平均覆蓋率均符合檢測要求。

2.2基因檢出情況 25個家系先證者中，檢測出已知致病性基因突變病例13例；檢出疑似致病性基因突變病例9例；臨床意義未明基因突變有3例；未檢出陰性病例，25個家系均有陽性發(fā)現(xiàn)。8號患者的RP1基因上有2個突變位點，分別為c.2886delA和c.4129delG突變。25號患者的RP1基因上有4個致病突變位點，分別為c.4168_4169insT、c.4196delG、c.4169A>G和c.6353G>A突變。在檢出的基因變異位點中，RP1基因發(fā)現(xiàn)9個未報道致病基因突變位點，見表1。

表1 視網膜色素變性家系基因檢測中發(fā)現(xiàn)未報道的RP1基因位點突變

2.3臨床觀察 8號病例：眼視盤界清色蠟黃，血管纖細，視網膜萎縮，呈青灰色，后極黃斑旁及赤道部少量骨細胞樣色素析出，眼底照相提示，色素散在分布，未附著于血管旁。自發(fā)熒光照相提示，視網膜色素背景熒光變淡，左眼黃斑旁機化瘢痕處點狀強熒光。視野檢查提示，雙眼視野呈不規(guī)則片狀，左眼中央?yún)^(qū)視野尚存。見圖1。25號病例：眼底照相顯示，雙眼視盤界清色淡，血管極細，黃斑中心凹處色暗，除后極黃斑區(qū)外，其余視網膜呈青灰色，未見明顯骨細胞樣色素沉著。自發(fā)熒光照相提示，眼底色素背景熒光極低或消失，呈斑駁樣。雙眼視野檢查提示，視野呈管狀，周邊視野完全喪失。OCT提示雙眼黃斑中心凹處極度萎縮，厚度僅為右眼37 μm，左眼31 μm。橢圓體帶嚴重萎縮，未見明顯反射，視網膜厚度中度萎縮。見圖2。

注：A、B為眼底照相，C、D為自發(fā)熒光照相，E、F為視野檢查；A、C、E示右眼，B、D、F示左眼。

注：A、B為眼底照相，C、D為自發(fā)熒光照相，E、F為視野檢查，G、H為OCT檢查；A、C、E、G示右眼，B、D、F、H示左眼。

3 討 論

RP1基因于1999年首次被鑒定，它由4個外顯子組成，編碼2 156個氨基酸[6]。RP1基因編碼一種光感受器特異性微管相關蛋白，定位于連接纖毛處，可能參與光感受器內外段之間的蛋白質轉運或纖毛結構的維持，在視桿和視錐光感受器外段的結構中起重要作用[7]。

視網膜色素變性包括一組以視桿狀細胞為特征的異質性遺傳性視網膜營養(yǎng)不良，其特征是視錐細胞變性之前的視桿細胞變性。視網膜色素變性的遺傳可以是常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖隱性遺傳或單純型。迄今為止，已經發(fā)現(xiàn)大約80個致病基因與視網膜色素變性相關，其中58個與常染色體隱性遺傳形式有關。RP1基因是與視網膜色素變性關聯(lián)的80多個基因之一，在常染色體顯性遺傳視網膜色素變性和常染色體隱性遺傳視網膜色素變性的病例中已經發(fā)現(xiàn)視網膜色素變性相關基因的突變，除了RP1基因，還有bestrophin 1(BEST1)、神經視網膜亮氨酸拉鏈、核受體亞家族2 E組成員3(NR2E3)、視紫紅質(RHO)、視網膜色素上皮基因(RPE65)[8]。RP1基因相關的常染色體隱性遺傳視網膜色素變性患者通常比RP1基因相關的常染色體顯性遺傳視網膜色素變性患者有更嚴重的視力損害[9]。

本研究納入的25個家系，全部找到已知或疑似致病突變或臨床意義未明的突變，同時，發(fā)現(xiàn)RP1基因有9個未報道的新突變。

特別值得注意的是，本研究中患者編號為8號和25號家系的致病突變基因是RP1基因，均指向RP1基因型視網膜色素變性。8號患者RP1基因的c.2886delA和c.4129delG突變?yōu)槿笔б拼a突變，屬于烈性突變，該突變極可能引起編碼蛋白質氨基酸序列發(fā)生改變而致病。25號患者RP1基因上有4個致病突變位點，c.4168_4169insT和c.4196delG突變?yōu)椴迦牒腿笔б拼a突變，屬于烈性突變，而c.4169A>G和c.6353G>A突變?yōu)殄e義突變。經過家系共分離檢測確認，筆者發(fā)現(xiàn)c.4168_4169insT和c.4169A>G突變位于DNA單鏈，而c.4196delG和c.6353G>A突變位于另一條鏈。在臨床表現(xiàn)上，筆者也能看到，25號患者的眼底病變程度遠比8號患者嚴重，25號患者黃斑萎縮嚴重，中心凹處視錐細胞結構消失，自發(fā)熒光照相顯示色素上皮背景熒光幾乎消失，動脈血管萎縮尤其明顯。25號患者臨床表現(xiàn)出全色盲，考慮與黃斑的發(fā)育異常有關。因為與色盲有關的基因如CNGA3與CNGB3等均沒有發(fā)現(xiàn)異常，而該患者的黃斑發(fā)現(xiàn)嚴重萎縮，視錐細胞的發(fā)育缺失，從而導致色覺缺失。而8號患者無色盲，自發(fā)熒光照相顯示仍有少量色素上皮背景熒光，動脈血管萎縮不明顯。綜合以上表現(xiàn)筆者認為，RP1基因的多發(fā)位點突變導致的視網膜色素變性癥狀更顯著，危害更嚴重，這在國內其他同類研究中鮮見報道。

已有研究顯示，RP1基因的突變可導致不同的臨床表型，可以將這些表型根據(jù)臨床發(fā)現(xiàn)、遺傳模式、發(fā)病年齡和病程在臨床上相互區(qū)分[10]?；蚍治鍪寡芯空吣軌蜻M行有針對性的診斷測試，并確定基因治療的治療方法[11]。隨著基因治療等新型治療手段的出現(xiàn)，識別與RP1基因突變相關的整個臨床表型，對于幫助選擇合適的患者及評估所提供治療的效果至關重要。

視網膜色素變性的高發(fā)突變基因和突變位點具有異質性，本研究新發(fā)現(xiàn)的RP1基因變異位點具有特殊臨床表型。但是HUCKFELDT等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，盡管RP1基因型相同，但臨床診斷包括黃斑營養(yǎng)不良(MD)、椎桿營養(yǎng)不良(CRD)和視網膜色素變性；VERBAKEL等[10]的研究也顯示，RP1基因的突變可導致不同的臨床表型，具體表現(xiàn)為視網膜色素變性、常染色體隱性遺傳MD或常染色體隱性遺傳CRD，取決于殘留的視網膜細胞的數(shù)目和生理功能等情況。

RP1基因是與RP關聯(lián)的80多個基因之一，MIZOBUCHI等[13]的研究表明，RP1基因變異類型/位置和臨床表型之間存在基因型-臨床表型相關性。RIERA等[14]的研究描述了由RP1基因突變引起的黃斑營養(yǎng)不良表型，并在該基因中建立了新的基因型-表型相關性。本研究所發(fā)現(xiàn)這9個RP1基因突變位點，與視網膜色素變性之間及這些相關病例所表現(xiàn)出來的特殊臨床表型之間，是否存在必然的聯(lián)系，還需要通過動物實驗、基因敲除、基因修復等進一步的研究來驗證。

近年來二代高通量基因測序技術發(fā)展迅速，可利用特制探針或基因擴增，對特定的蛋白編碼區(qū)域DNA或某段特定序列進行目標捕獲并富集，進行高通量測序。該技術具有效率高、費用低、時間短等優(yōu)點，為大量表型復雜的視網膜色素變性家系研究提供了技術支持，是遺傳性視網膜色素變性疾病的有效檢測手段，有助于研究者發(fā)現(xiàn)新發(fā)位點突變，并且臨床上可以輔助診斷視網膜色素變性類型，提高該類疾病臨床診治能力。此外，對于臨床RP1基因治療，必須全面了解疾病的自然病程，特別是要了解不同的表型，才能較好地評估治療效果。