王帥 孫潤權(quán) 劉奕志 劉思遠(yuǎn) 李志剛 王鑫

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)又稱老年癡呆，是一種持續(xù)侵入型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾患。其特征性病理改變?yōu)榧?xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)異常聚積形成淀粉樣斑塊(amyloid plaques)，神經(jīng)元內(nèi)微管相關(guān)蛋白tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)[1]。至今，據(jù)估計(jì)全世界有超過5000萬人患有癡呆癥，死亡率位列第五[2]。

線粒體功能障礙是導(dǎo)致AD發(fā)生的重要細(xì)胞內(nèi)變化[3]，當(dāng)自噬被阻斷時(shí)，Aβ可以聚集在線粒體膜上，通過改變神經(jīng)信號因子轉(zhuǎn)導(dǎo)，破壞線粒體結(jié)構(gòu)和自噬功能，引起線粒體損傷和數(shù)量變化[4]。另外，自噬缺陷所導(dǎo)致的Tau 蛋白去除受阻，神經(jīng)纖維纏結(jié)可能是AD的基本病理改變之一，Tau 蛋白的過度磷酸化可以導(dǎo)致線粒體腦內(nèi)分布失衡[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，前額葉區(qū)腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)是調(diào)控線粒體質(zhì)量的重要因子[6]，能有效對抗應(yīng)激反應(yīng)。此外，AMPK 能有效抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)表信號傳導(dǎo)，線粒體損傷相關(guān)的AMPK/mTOR途徑可以誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，激活自噬并觸發(fā)溶酶體系統(tǒng)清除 Aβ[7]。

本實(shí)驗(yàn)主要探討“通督啟神”法電針能否通過調(diào)控小鼠線粒體自噬因子(AMPK、mTOR)的釋放，提高線粒體自噬的活性和質(zhì)量，從而延緩AD 的病理進(jìn)程，說明線粒體自噬功能不全可作為AD治療靶點(diǎn)，為 AD的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級6月齡雄性APPswe/PS1dE9(Amyloid Precursor Protin/Presenilin-1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠30只，遺傳背景相同的C57BL/6小鼠10只，體質(zhì)量(28±2)g，購自江蘇金致和生物科技有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號:SCXK(京)99 2014-0004)。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中心屏障系統(tǒng)。

1.2 試劑與儀器

3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3MA)(貨號：HY-19312)(規(guī)格：50.0 mg) 上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司； AMPK Alpha Monoclonal(Ptg公司，編號：66536-1-Ig)；MTOR Monoclonal Antibody(ptg公司，編號：66888-1-Ig)；丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，蛋白質(zhì)分子量Marker(美國Bio-rad公司，貨號：161-0374，310007919)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZB-2301，批號：128964)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZB-2305，批號：129736)

ZYTH2013030504型無菌針灸針 (北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；華佗牌電子電療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；XR-XM101型Morris水迷宮圖像自動(dòng)采集和軟件分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技公司)。

1.3 干預(yù)方法

將30只清潔級APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠， 隨機(jī)分為模型組、電針+抑制劑組(線粒體自噬抑制劑為3-MA)和電針組，每組10只，C57BL/6 小鼠10只作為空白對照組。實(shí)驗(yàn)全程將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定于自制鼠板上，使其保持清醒，電針組參照全國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜”選取百會(huì)穴、印堂穴、水溝穴三個(gè)穴位，用華佗牌30號1寸毫針進(jìn)行電針。水溝穴向鼻尖方向點(diǎn)刺，百會(huì)穴向下平刺進(jìn)針、印堂穴向上平刺進(jìn)針(注意兩針尖不要在小鼠體內(nèi)接觸，防止短路)，進(jìn)針深度為0.5 cm，膠帶固定，針柄連接華佗牌電子電療儀，電針頻率為2 Hz，疏密波，電壓為2 V， 電流強(qiáng)度為0.2 mA，電針強(qiáng)度以大鼠頭部微顫為宜[8]。每次20分鐘，每天1次，共治療15天。

電針+抑制劑組在針刺前30分鐘予以2 mg/kg濃度計(jì)量的3MA溶于PBS溶液中，腹腔注射，并與電針組進(jìn)行相同條件的針刺和束縛；

空白對照組、模型組和電針組在干預(yù)前30分鐘時(shí)注射(1.2±0.1) mL PBS溶液?？瞻捉M和模型組在電針組束縛治療時(shí)進(jìn)行同等時(shí)間和力度的抓取和束縛；各組小鼠每天上午干預(yù)1次，共干預(yù)15天。

1.4 Morris水迷宮隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第1天，讓動(dòng)物在不含平臺的水池中自由游泳60秒，上午、下午各1次，使其熟悉迷宮環(huán)境。實(shí)驗(yàn)時(shí)平臺位置固定不變，先將動(dòng)物置于平臺上訓(xùn)練10秒，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限分別選一固定位置作為入水點(diǎn)，將小鼠面壁放入水中，水迷宮圖像自動(dòng)采集和軟件分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄小鼠的逃避潛伏期，并選取Ⅲ象限數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，超出60秒沒有登臺的，其逃避潛伏期自動(dòng)記60秒，然后人為將小鼠放在平臺上學(xué)習(xí)15秒，每天上午測試1次， 共測試5天，以檢測小鼠的空間記憶和學(xué)習(xí)能力。

1.5 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)

隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后的第2天上午，撤除Ⅰ象限的平臺，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限分別選一固定位置作為入水點(diǎn)，將小鼠面壁放入水中，并選?、笙笙迶?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，水迷宮圖像自動(dòng)采集和軟件分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄小鼠穿越平臺次數(shù)，在Ⅰ象限的游泳時(shí)間，并計(jì)算其與總游泳時(shí)間的比值，即目標(biāo)象限游泳時(shí)間/總游泳時(shí)間，共測試1天，該實(shí)驗(yàn)的目的是檢測小鼠的空間記憶能力。

1.6 免疫組化DAB染色

每組隨機(jī)選取4只小鼠，0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉后，4%多聚甲醛灌注取全腦，放入4%多聚甲醛中固定24小時(shí)，石蠟包埋，切片，厚度為6 μm。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟處理后，用枸椽酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)15分鐘，待涼至室溫，PBS漂洗；3%H2O2室溫孵育10分鐘，PBS漂洗；正常非免疫羊血清37℃孵育10分鐘，PBS漂洗；一抗稀釋液(AMPK 1∶50；mTOR 1∶100)，放入濕盒，4℃冰箱孵育過夜；第2天PBS漂洗，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG 37℃孵育10分鐘，PBS漂洗；鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化酶37℃孵育10 分鐘，PBS漂洗；DAB顯色試劑盒顯色，顯微鏡下觀察并終止顯色；蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，晾干，留以觀察。以額葉皮層部分為圖片分析區(qū)域，每組取相互不重疊的6個(gè)視野，用 ImageJ對圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理 ，計(jì)數(shù)其中陽性細(xì)胞，每組小鼠所有切片陽性細(xì)胞數(shù)量作為該組動(dòng)物免疫陽性細(xì)胞密度代表值，以陽性細(xì)胞數(shù)表示，進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 Western blot 檢測小鼠前額葉組織AMPK、mTOR的蛋白表達(dá)

檢測時(shí)取冰凍保存的小鼠海馬組織加入裂解緩沖液，研磨均勻后冰上靜置20分鐘后取上層清液，4 ℃、10 000 r/min、離心10分鐘,，提取組織總蛋白樣品，使用 BCA 蛋白定量測定試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行測定。剩余蛋白樣品加入等體積的2×SDS上樣緩沖液,沸水中煮5分鐘，充分變性蛋白。SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，漂洗5分鐘，封閉處理1小時(shí)。分別加入一抗(AMPK為1∶3 000；mTOR為1∶500；β-actin 1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入二抗(AMPK為1∶2 000；mTOR為1∶1 000)，室溫孵育 2小時(shí)。加入HRPECL發(fā)光液，于暗室中X光膠片曝光，顯影、定影、標(biāo)定Marker，最后清水沖洗，晾干，掃描，用IPP軟件對掃描圖象的目的條帶進(jìn)行灰度分析。以各目的蛋白相對于內(nèi)參蛋白β-actin 的表達(dá)量作為該蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

重復(fù)測量和組間效應(yīng)方差分析，隨訓(xùn)練天數(shù)增加，小鼠的逃避潛伏期都有所縮短。對逃避潛伏期做兩兩比較，模型組長于空白對照組，電針組短于模型組，電針+抑制劑組長于電針組，電針+抑制劑組有短于電針組的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1，圖1。

表1 不同組別逃避潛伏期比較

注：AMPK免疫組化：A1 空白對照組；B1 模型組；C1 電針組；D1 電針+抑制劑組；mTOR免疫組化：A2 空白對照組；B2 模型組；C2 電針組；D2 電針+抑制劑組。

2.2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

各組空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺次數(shù)及平臺象限游泳時(shí)間均采用單因素 ANOVA，穿越平臺次數(shù)，空白對照組明顯優(yōu)于其他三組(P<0.05)，電針組優(yōu)于電針+抑制劑組(P<0.05)，但電針組和電針+抑制劑組與模型組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。就目標(biāo)象限游泳時(shí)間和目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比而言，空白對照組明顯優(yōu)于模型組和電針+抑制劑組(P<0.05)，電針組優(yōu)于電針+抑制劑組(P<0.05)，見表2。

表2 不同組別目標(biāo)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間、穿越平臺次數(shù)比較

2.3 免疫組化DAB染色結(jié)果

AMPK主要表達(dá)于小鼠前額葉區(qū)的細(xì)胞核和胞漿中，以細(xì)胞核著色為主，胞漿呈淡染，蛋白陽性區(qū)域顯色為棕黃色至棕褐色?？瞻讓φ战M的陽性細(xì)胞數(shù)多且著色深；模型組的陽性細(xì)胞較空白對照組明顯減少，且著色淺；電針+抑制劑組和電針組的陽性細(xì)胞數(shù)介于模型組與空白對照組之間，電針組著色最深。空白對照組的陽性細(xì)胞數(shù)多于模型組(P<0.05)，電針組多于模型組(P<0.05)和電針+抑制劑組(P<0.05)，模型組多于電針+抑制劑組(P<0.05)。

mTOR主要表達(dá)于小鼠前額葉線粒體自噬細(xì)胞的細(xì)胞器，少數(shù)表達(dá)與細(xì)胞核中，陽性細(xì)胞呈淡黃色發(fā)散狀團(tuán)塊?？瞻讓φ战M的陽性細(xì)胞數(shù)少且著色淺；模型組的陽性細(xì)胞較空白對照組明顯增多，且著色較深；電針+抑制劑組和電針組的陽性細(xì)胞數(shù)及顏色介于模型組與正常對照組之間。模型組的陽性細(xì)胞數(shù)多于空白對照組(P<0.05)，模型組與電針+制劑組比較無明顯差異，電針組少于模型組和電針+制劑組(P<0.05)，見圖1，表3。

表3 各組小鼠前額葉區(qū)AMPK、mTOR免疫組化陽性表達(dá)比較

2.4 Western blot檢測結(jié)果

與空白對照組相比，模型組AMPK條帶較細(xì)，蛋白表達(dá)明顯較少，mTOR條帶增粗，蛋白表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，電針組AMPK表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，電針+抑制劑組表達(dá)也有所增加，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電針+抑制劑組與電針組比較其表達(dá)明顯減少(P<0.05)；電針組mTOR表達(dá)明顯少于模型組和電針+抑制劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)和(P<0.05)，模型組高于電針+抑制劑組(P<0.05)，見表4，圖2。

表4 不同組別前額葉區(qū)AMPK、mTOR表達(dá)水平比較

注：1 空白對照組;2 模型組;3 電針組;4 電針+抑制劑組

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電針干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力較模型組增強(qiáng)，大腦皮層中AMPK蛋白表達(dá)水平上調(diào)，mTOR蛋白表達(dá)水平下調(diào)，說明電針干預(yù)可以改善小鼠認(rèn)知能力，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。電針組在行為學(xué)方面優(yōu)于電針+抑制劑組，促進(jìn)AMPK表達(dá)，抑制mTOR表達(dá)，說明電針能通過誘導(dǎo)或繼發(fā)線粒體自噬，增強(qiáng)自噬作用，突破抑制劑作用，起到延緩疾病進(jìn)展的目的；由線粒體障礙造成的細(xì)胞凋亡等一系列細(xì)胞癥狀是加速 AD 患者祌經(jīng)元受損的生物級聯(lián)反應(yīng)之一，線粒體自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制是降解和去除 Aβ 淀粉樣沉積及其造成的神經(jīng)元損傷。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)說明線粒體自噬在分子層面的作用效果和機(jī)制，為自噬通路的研究構(gòu)筑更堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在AD中發(fā)現(xiàn)的可溶性Aβ和異常磷酸化的Tau蛋白直接與線粒體相互作用并損害其功能，線粒體結(jié)構(gòu)基因、自噬基因和線粒體自噬特異性基因都已被證明以某種方式發(fā)生變化[9]。AMPK是生物體內(nèi)普遍存在的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，以異源三聚體形式存在[10]，主要協(xié)調(diào)代謝和能量的需要，是感受細(xì)胞能量變化的關(guān)鍵分子, 細(xì)胞代謝應(yīng)激或能量失衡引起 ADP/ATP 或 AMP/ATP 比率升高, 導(dǎo)致AMPK 的激活，進(jìn)而調(diào)控了線粒體的功能, 調(diào)控細(xì)胞能量循環(huán)。AMPK 參與生理和病理狀態(tài)下的神經(jīng)保護(hù)，從而協(xié)調(diào)許多組織中特定情境的代謝反應(yīng)[11]。mTOR是結(jié)合線粒體自噬的重要位點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞能量充足時(shí)，AMPK處于失活狀態(tài)，mTOR 處于活化狀態(tài)，mTOR是與AMPK能量狀態(tài)相反的感應(yīng)器，其活性是自噬起效的關(guān)鍵和負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在AMPK介導(dǎo)的自噬信號通路中，mTOR 是其下游重要的信號分子。細(xì)胞遭受應(yīng)激損傷過程中 mTOR 即被抑制，主要通過上游AMPK調(diào)控激活[12]。神經(jīng)系統(tǒng)集成各種中央和外圍信號以維持體內(nèi)平衡，神經(jīng)系統(tǒng) AMPK 被證明在能量平衡中具有重要且復(fù)雜的作用[13]。

“通督啟神”針法是以針灸作用基本特點(diǎn)為基礎(chǔ)，結(jié)合臨床實(shí)際，總結(jié)提煉出的用于治療神志病的系統(tǒng)化治療處方[14]。神智病主要病變部位在腦，腦為“神明之府”，主宰人的一切精神意志及思維活動(dòng)，神失所養(yǎng)則發(fā)為神志病。根據(jù)“氣街”理論，“頭氣有街，氣在頭者，止之于腦”(《靈樞·衛(wèi)氣》)，即頭部經(jīng)氣與腦聯(lián)系密切。頭為“諸陽之會(huì)”，督脈為“陽脈之?！?，《靈樞·營氣》：“上額，循巔，下項(xiàng)中，循脊，入骶，是督脈也?！薄端貑枴す强照撈罚骸叭胗谀X，上頭頂，下額，聯(lián)系心、腎、腦[15]。”督脈虛衰則腎精無法充盈灌注腦髓，清陽不升，濁陰不降，竅閉神溺，發(fā)為“呆病”。因此，在穴位的選取上，以督脈的百會(huì)穴、印堂穴和人中穴為主穴。百會(huì)又名三陽五會(huì)、巔上、天滿，根據(jù)“四?！崩碚摚澳X為髓海，其氣上輸腦蓋百會(huì)穴，下輸風(fēng)府也”。百會(huì)穴為督脈經(jīng)氣之所歸，清竅神氣之所息，為神志病變局部必選穴。印堂，原為經(jīng)外奇穴，后結(jié)合穴位位置與功能被歸為督脈，《新集備急灸經(jīng)》：“患大風(fēng)病，兩眉中名光明穴，灸隨年。”具有清利頭目、開竅醒神益智的功效，調(diào)和陰陽氣機(jī)，達(dá)到陰平陽秘的生理狀態(tài)。人中穴又名溝洫、壽堂、子庭，《神應(yīng)經(jīng)》云:“善悲哭憂不休, 針百會(huì)、人中?！庇譃槭硌ㄖ械墓韺m，鬼穴為《千金要方》所載，是古代治療神志疾患的十三個(gè)經(jīng)驗(yàn)效穴[16]。此三穴皆為頭部腧穴，符合“腧穴所在，主治所在”的局部選穴原則；皆為督脈腧穴，同氣相求；也是符合神志病的病因病機(jī)的辨證對癥選穴，位置與辨證相宜。選此三穴為伍，通督以啟神，方能調(diào)陰與陽，精氣乃光，合形與氣，使神內(nèi)藏。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)可見，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3MA線粒體自噬抑制劑可延緩AD小鼠認(rèn)知能力改善，弱化電針對小鼠前額葉區(qū)相應(yīng)蛋白水平的調(diào)節(jié)，說明AD的發(fā)病機(jī)制可能與線粒體自噬有十分緊密的關(guān)聯(lián)。與此同時(shí)，AMPK/mTOR這一負(fù)性調(diào)節(jié)環(huán)路在自噬發(fā)生和發(fā)展過程中也起到了重要作用，為自噬研究提供了新的參考。

本實(shí)驗(yàn)就“通督啟神”法電針對AD的治療作用及作用途徑進(jìn)行了分子層面的驗(yàn)證，但線粒體自噬這一重要的細(xì)胞內(nèi)事件的激活、形成、凋亡，是否呈有規(guī)律的起落消漲現(xiàn)象，以及各個(gè)過程和現(xiàn)象間的相互影響作用，仍是醫(yī)療生物界有待攻克的主題和難題，進(jìn)行更深層次的研究與討論是總結(jié)AD治療策略的必經(jīng)之路。