康天倫 席雅婧 錢唐亮 朱躍蘭 侯秀娟

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的自身免性疫病，全球患病率為0.5～1%[1]。RA患者常容易伴發(fā)間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease，ILD)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺病(rheumatoid arthritis associated with interstitial lung disease，RA-ILD)在RA患者中的發(fā)病率從10～50%不等[2-5]，且以尋常型間質(zhì)性肺病更為常見，嚴(yán)重影響RA患者的生命和生活質(zhì)量。

研究表明，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase，PI3K/Akt)信號通路參與到了RA病理過程，與關(guān)節(jié)滑膜增生、滑膜炎、骨破壞有一定相關(guān)性[6]。在肺纖維化的過程中，研究發(fā)現(xiàn)活化PI3K/Akt信號通路，可激活下游中結(jié)締組織生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等細(xì)胞因子的表達(dá)參與肺纖維化，且可與核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等信號通路協(xié)同作用促進肺纖維化的形成[7]。前期研究表明加味芍甘附子湯治療以寒證為主的RA患者，在改善臨床癥狀等方面療效較好[8]，動物實驗研究也表明加味芍甘附子湯可改善佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜的破壞[9]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬觀察加味芍甘附子湯對膠原誘導(dǎo)的佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠肺組織的組織病理形態(tài)及PI3K、Akt、NF-κB等相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討加味芍甘附子湯治療RA-ILD的作用機制，為今后RA-ILD的中醫(yī)治療提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級Wistar大鼠48只，雌性，體質(zhì)量(110±10)g，鼠齡6～8周，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法分為空白組8只、造模組40只。

1.2 實驗藥物

加味芍甘附子湯藥物組成：白芍15 g、生甘草10 g、制附片15 g、青風(fēng)藤15 g、雞血藤15 g。中藥飲片購買于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房，并由制劑室代煎。給藥劑量根據(jù)大鼠體表面積計算，將藥物濃縮成小、中、大劑量，分別為0.443 g/mL、0.885 g/mL和1.770 g/mL。藥液于4℃冰箱保存。

雷公藤多苷片，10 mg/片，生產(chǎn)批號：20200901，由湖南千金協(xié)力藥業(yè)提供。用蒸餾水將其配制成濃度為0.625 mg/mL的藥物混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原(Chondrex公司，貨號2002)，不完全弗氏佐劑(Sigma公司，貨號7002)，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染液(武漢皮諾飛公司，貨號PN0004)，一抗(VEGF)(servicebio公司，貨號GB11034)，一抗(CD34)(Abcam公司，貨號Ab81289)，一抗(KI67)(arigo公司，貨號ARG53222)，熒光二抗(cy3標(biāo)記HRP山羊抗兔)(Jackson公司，貨號111-165-003)。

動物氣候箱(重慶永生公司，貨號SHH-500ZSD)，病理切片機(上海徠卡公司，貨號RM2016)，組織攤片機(浙江科迪公司，貨號KD-P)，烤箱(上?；厶┕?，貨號DHG-9140A)，脫色搖床(北京六一公司，貨號WD-9405A)，組化筆(Gene tech公司，貨號GT1001)。

1.4 造模、給藥及取材

1.4.1 模型制備 根據(jù)徐淑云《藥理學(xué)實驗方法》的制備方法，以及課題組既往造模經(jīng)驗復(fù)制關(guān)節(jié)炎大鼠模型，將溶于乙酸的牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑(IFA)混合，制備成濃度為2 mg/mL的混合物。將上述混合物置于15 mL離心管并垂直置于冰水中，離心管置于高速分散器下，以(1 000～3 000 r/min)攪拌2分鐘，暫停30秒冷卻，避免高速分散器轉(zhuǎn)頭攪拌過程中產(chǎn)熱導(dǎo)致蛋白變性，并反復(fù)數(shù)次使蛋白充分乳化，最終形成滴入水中而不散的“油包水”狀。隨后在大鼠左足和尾根部分別多點皮內(nèi)注射0.1 mL，同時按壓注射部位使其充分吸收。7日后取0.1 mL于大鼠尾根部加強免疫一次。空白組僅在左足皮下注射0.1 mL的0.9%的生理鹽水。在接受上述免疫的第一天開始，參考劉建勛主編《病證結(jié)合動物模型擬臨床研究思路與方法》[10-11]，應(yīng)用動物氣候箱制備寒證模型，條件設(shè)定為風(fēng)速6 mL/s，溫度6℃，相對濕度95%。連續(xù)給予28天風(fēng)寒濕刺激，造模時間持續(xù)4周。

1.4.2 動物分組及干預(yù) 將造模組隨機分為5組，每組8只，分別為模型組、中藥大、中、小劑量組及雷公藤組。空白組與模型組蒸餾水灌胃，其余4組分別給予相對應(yīng)的藥物進行灌胃。按照成人每日服藥量的6.25倍來計算大鼠每日灌胃用量，計算后得出大鼠用量為：中藥大劑量組17.70 g/(kg·d)，中藥中劑量組8.85 g/(kg·d)，中藥小劑量組4.43 g/(kg·d)，雷公藤組6.25 mg/(kg·d)。按每只大鼠100 g/mL的灌胃量進行灌胃。同時將每日的給藥劑量分兩次給藥，兩次之間間隔6小時以上，連續(xù)灌胃4周。

1.5 檢測方法和指標(biāo)

1.5.1 HE染色法觀察大鼠肺組織病理變化 灌胃4周后，將大鼠處死，沿大鼠腹部正中線剪開，充分暴露胸腔，鈍性分離出肺組織及支氣管，沖洗、濾干后將肺組織浸泡在4%的多聚甲醛中固定，進行包埋、切片、脫蠟、染色、脫水、封片、顯微鏡觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。用Szapiel評分[12]標(biāo)準(zhǔn)進行肺泡炎評分。

1.5.2 免疫熒光法檢測肺組織PI3K、Akt、NF-κB的變化 將固定好的石蠟標(biāo)本切片脫蠟，依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ/Ⅱ各15分鐘；無水乙醇Ⅰ/Ⅱ各15分鐘；85%和75%酒精各5分鐘；最終蒸餾水沖洗。將切片置于pH為6.0緩沖液中，并置于微波爐內(nèi)修復(fù)。修復(fù)過程防止緩沖液過度蒸發(fā)以至干片。切片自然冷卻后置于pH為7.4的PBS中洗滌5分鐘×3次。滴加適合濃度的一抗，并將切片平放于4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。將切片先置于pH為7.4的PBS中洗滌5分鐘，共3次。甩干切片滴加熒光二抗，室溫避光孵育1小時。同上述步驟PBS洗滌、甩干后滴加DAPI，室溫避光孵育10分鐘。PBS洗滌、甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 加味芍甘附子湯對肺組織形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)及肺泡壁完整，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)大面積破壞，肺泡結(jié)構(gòu)塌陷，肺泡間隙充血水腫，肺泡壁增厚，出現(xiàn)大量纖維瘢痕；中藥小劑量組肺泡炎仍然較為明顯，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隙仍較寬，較模型組有所改善；中藥中、大劑量組及雷公藤組肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰，伴有輕微炎癥反應(yīng)及少量纖維增生，與模型組相比有較明顯的改善。見圖1。

肺泡炎評分結(jié)果顯示，模型組與空白組比較炎癥反應(yīng)有明顯差異(P<0.01)；中藥中、大劑量組與模型組相比，肺泡炎癥和纖維化有顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；雷公藤組與模型組相比也有明顯差異(P<0.01)。見表1。

注：A 空白組；B 模型組；C 中藥小劑量組；D 中藥中劑量組；E 中藥大劑量組；F 雷公藤組。

表1 各組關(guān)節(jié)炎大鼠肺泡炎程度評分比較分)

2.2 加味芍甘附子湯對肺組織中PI3K、Akt、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，模型組中PI3K、Akt、NF-κB(Cy3標(biāo)記呈現(xiàn)紅色熒光)的表達(dá)較空白組均明顯增多，且各治療組PI3K、Akt、NF-κB的表達(dá)與模型組相比均不同程度降低。見圖2。

熒光光密度值對比顯示，模型組吸光度值較空白組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各治療組較模型組吸光度值均有降低，與模型組相比，PI3K、NF-κB在中藥大劑量組與雷公藤組中降低更明顯(P<0.05)，與NF-κB在中藥中劑量組中降低更明顯(P<0.05)。見表2。

表2 各組關(guān)節(jié)炎大鼠肺組織PI3K、Akt、NF-κB平均熒光強度比較

3 討論

研究表明，PI3K/Akt信號通路是由酶聯(lián)受體介導(dǎo)的參與細(xì)胞增殖、遷移、存活和血管生成的經(jīng)典信號通路[13]，與免疫介導(dǎo)的疾病相關(guān)[14]。其中，Akt是PI3K的下游底物?；罨腜I3K可以催化磷脂酰肌醇磷酸化產(chǎn)生第二信使，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(3-phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK)1和PDK2的幫助下完全激活A(yù)kt。Akt完全解離到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，從而磷酸化靶蛋白，如NF-κB，完成對細(xì)胞外和細(xì)胞外信號刺激的反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞增殖和凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)和細(xì)胞活動[15]。在PI3K/Akt抑制劑渥曼青霉素和LY294002的作用下，RA患者外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的白介素-17被部分或完全阻斷，可減緩RA滑膜炎癥反應(yīng)[16]。PI3K/Akt途徑介導(dǎo)的Blimp1表達(dá)上調(diào)可以促進RA破骨細(xì)胞形成[17]，充分說明PI3K/Akt信號通路在RA病理過程起到重要作用。PI3K/Akt信號通路在特發(fā)性肺纖維化中同樣發(fā)揮著重要作用，抑制PI3K通路可阻斷轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)和膠原生成的增加減緩肺纖維化的產(chǎn)生[18]。NF-κB在PI3K/Akt信號通路的下游表達(dá)。NF-κB信號通路在RA中起重要作用[19]，同時還可以促進成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，介導(dǎo)肺泡炎和肺纖維化[20]。

注：A 空白組；B 模型組；C 中藥小劑量組；D 中藥中劑量組；E 中藥大劑量組；F 雷公藤組。A1-F1 大鼠肺組織PI3K表達(dá)；A2-F2大鼠肺組織Akt表達(dá)；A3-F3大鼠肺組織NF-κB表達(dá)。

芍甘附子湯出自張仲景《傷寒論》，由芍藥、甘草、附子三味藥組成。白芍補肝陰，附子溫腎陽，一陰一陽相調(diào)和，甘草則安中。附子、甘草辛甘化陽以益衛(wèi)，芍藥甘草酸甘益陰、養(yǎng)營補虛，三藥相合共奏扶陽益陰之效。在芍甘附子湯基礎(chǔ)上加上雞血藤、青風(fēng)藤構(gòu)成加味芍甘附子湯，雞血藤活血補血，青風(fēng)藤祛風(fēng)濕通經(jīng)絡(luò)，使其更貼合于臨床RA以多關(guān)節(jié)疼痛為主要臨床表現(xiàn)這一特點。臨床研究表明，加味芍甘附子湯可縮短寒證RA患者晨僵時間，減少關(guān)節(jié)疼痛及腫脹個數(shù)，降低DAS28評分，改善患者生活質(zhì)量[8]。動物實驗表明加味芍甘附子湯能有效調(diào)控JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路STAT1 mRNA、SOCS1 mRNA、SOCS3 mRNA的表達(dá)，降低關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)較空白組被大面積破壞，肺泡結(jié)構(gòu)改變，肺泡間隙充血水腫，肺泡壁相對增厚，出現(xiàn)大量纖維瘢痕，說明使用關(guān)節(jié)炎模型作為觀察RA相關(guān)間質(zhì)性肺病的模型相對可靠，這與發(fā)表的相關(guān)實驗結(jié)果相一致[21]。各治療組肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)較模型組有不同程度的改善，表明加味芍甘附子湯對延緩關(guān)節(jié)炎大鼠肺損傷有一定作用。臨床中RA-ILD在影像學(xué)上大致可分為普通間質(zhì)性肺炎、非特異性間質(zhì)性肺炎、機化性肺炎三種類型[22]。雖然RA-ILD在影像學(xué)上常見以纖維化為特征的普通間質(zhì)性肺炎，仍有一大部分患者表現(xiàn)出非特異性間質(zhì)性肺炎的特點，以炎癥反應(yīng)引起的雙肺磨玻璃影為主[23]。炎癥反應(yīng)階段是可以被干預(yù)從而延緩纖維化進展的。研究發(fā)現(xiàn)[24]非特異性間質(zhì)性肺炎患者經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后，45%患者完全恢復(fù)，42%患者改善或穩(wěn)定。且非特異性間質(zhì)性肺炎患者的5年生存期為76.2%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于特發(fā)性肺纖維化(43.8%)[25]。本實驗大鼠肺病理改變治療組較模型組有一定改善，表明早期肺損傷有延緩其進展的治療機會。免疫熒光結(jié)果顯示PI3K、Akt、NF-κB在關(guān)節(jié)炎寒證大鼠肺組織中均有表達(dá)，與模型組相比各指標(biāo)在治療組均有降低，且PI3K、NF-κB在中藥中、大劑量組與雷公藤組中降低更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究已證明PI3K/Akt信號通路在RA及特發(fā)性肺纖維化中的重要作用[26-27]，本研究結(jié)果進一步豐富了PI3K/Akt信號通路在RA-ILD中的作用，將兩種疾病相關(guān)聯(lián)起到了“橋梁”的作用。

綜上所述，加味芍甘附子湯通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路進而干預(yù)其下游NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng)，可能是減少肺泡炎及肺纖維化的重要機制。接下來的研究將進一步探究加味芍甘附子湯在治療RA-ILD過程中發(fā)揮作用的主要成分，以及更進一步的分子機制，為臨床中更精確有效的治療RA-ILD提供依據(jù)。