唐軍梅，張啟芳，何思明，陳勇昌，蔡 莉

(廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西桂林 541002)

幽門(mén)螺桿菌是一種革蘭陰性螺旋形細(xì)菌，定植于人胃中，被認(rèn)為是慢性胃炎、潰瘍和胃癌的病原體，全世界有一半以上的人感染幽門(mén)螺桿菌[1-2]。腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白(tumor necrosis factor-α-inducing protein，Tipα)是幽門(mén)螺桿菌的一種致病蛋白，已發(fā)現(xiàn)該蛋白是促炎性細(xì)胞因子和趨化因子基因表達(dá)的有效誘導(dǎo)劑，與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[3]。胃癌是全球最常見(jiàn)的癌癥之一，發(fā)生率在東亞，東歐和南美最高[4]。胃癌的主要治療方式為手術(shù)，但在晚期轉(zhuǎn)移胃癌或因瘤徑過(guò)大而不可切除階段以順鉑為主的化療是轉(zhuǎn)移性癌癥患者最有效的治療方法[5]。然而，化療抵抗仍是部分胃癌患者治療的重要問(wèn)題，相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。磷酸肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是一種脂質(zhì)激酶，可傳遞細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)是PI3K信號(hào)的重要下游效應(yīng)物，可調(diào)節(jié)多種途徑，包括抑制細(xì)胞凋亡、刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等[6]。PI3K/Akt途徑是人類(lèi)癌癥中異常激活頻率最高的信號(hào)通路[7]。此外，該通路還與癌癥耐藥性相關(guān)，已被證明在順鉑耐藥性胃癌細(xì)胞中發(fā)揮著積極作用，是治療胃癌順鉑耐藥性的關(guān)鍵靶點(diǎn)[8]。本研究通過(guò)原核表達(dá)及純化獲得重組Tipα，觀察Tipα對(duì)胃癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響，并基于PI3K/Akt信號(hào)通路探究其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物信息中心幽門(mén)螺桿菌Tipα編碼序列(登錄號(hào)：NZ_LMXS01000175.1)由成都擎科梓熙生物科技有限公司合成片段并構(gòu)成重組質(zhì)粒pET-30a(+)-Tipα，BL21(DE3)pLysS大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(貨號(hào)：CB106)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；胃癌SGC-7901細(xì)胞系(貨號(hào)：CL-0206)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)高糖培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30022)、胎牛血清(貨號(hào)：SH30084.03)均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；青鏈霉素雙抗(貨號(hào)：15240062)購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；LY294002購(gòu)自美國(guó)Medchemexpress公司，CCK8檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：CK04)購(gòu)自日本東仁公司，Annexin V-APC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：70-AP107-60)購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning Costar公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(貨號(hào)：I8070)、RIPA裂解液(貨號(hào)：R0010)、化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒(貨號(hào)：PE0010)、蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：PC0020)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；NI-NTA Superflow(貨號(hào)：30410)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，內(nèi)毒素高效去除純化樹(shù)脂(貨號(hào)：20518ES10)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公；抗PI3K(貨號(hào)：ab191606)一抗、p-PI3K(貨號(hào)：ab182651)一抗、Akt(貨號(hào)：ab8805)一抗、p-Akt(貨號(hào)：81283)一抗、β-actin(貨號(hào)：ab8227)一抗、6×His Tag單克隆抗體(ab18184)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(ab205718)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1Tipα表達(dá)與純化

取100 μL BL21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞與1 ng pET-30a(+)-Tipα重組質(zhì)?；旌希诒响o置30 min，42 ℃熱激60 s，插入冰上靜置2 min，加入不含卡那霉素 LB液體培養(yǎng)基900 μL，37 ℃、150 r/min搖菌60 min，隨后將菌液均勻涂布至含有卡那霉素LB固體培養(yǎng)基上，倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。隨后挑取陽(yáng)性菌落接種于2 mL含卡那霉素LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、150 r/min搖菌12 h，隨后加入1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，30 ℃培養(yǎng)4 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，然后4 ℃、8 000 r/ min離心5 min收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌后通過(guò)超聲破碎菌體獲得蛋白。4 ℃、12 000 r/ min離心10 min，取上清液，過(guò)NI-NTA柱純化蛋白并去除內(nèi)毒素，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺(twelve alkyl sodium sulfate-polyacrylamide，SDS-PAGE)法鑒定重組Tipα蛋白。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

將胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基中，并放置于37 ℃、5%二氧化碳、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2～3 d換液，細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合時(shí)進(jìn)行傳代?？瞻讓?duì)照組為正常培養(yǎng)細(xì)胞，順鉑組在培養(yǎng)基中添加0.8 ng/L順鉑，Tipα聯(lián)合順鉑組在培養(yǎng)基中加入0.8 ng/L順鉑和100 ng/L Tipα，LY294002聯(lián)合Tipα和順鉑組則先用30 μmol/L LY294002預(yù)處理2 h再加入0.8 ng/L順鉑和100 ng/L Tipα。各組均培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞待測(cè)。

1.2.3CCK8試驗(yàn)

將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，按上述分組策略分別培養(yǎng)48 h后每個(gè)孔中分別加入10 μL CCK-8溶液，輕輕混勻，再在37 ℃、5%二氧化碳、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。采用MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Fisher Thermo公司)檢測(cè)450 nm處的光密度(A)值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)

胰酶消化各組細(xì)胞得到細(xì)胞懸浮液，調(diào)整為1×105/mL，用PBS洗滌后添加500 μL膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再分別加入5 μL Annexin V-APC和5 μL PI染液，4 ℃、避光孵育20 min。采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Transwell試驗(yàn)

用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室，置于37 ℃孵育4 h，放入24孔板中。胰酶消化各組細(xì)胞得到細(xì)胞懸浮液，調(diào)整為1×106/mL，在Transwell小室中在按200 μL/孔接種細(xì)胞，在24孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)15 h。培養(yǎng)完成后用棉簽輕輕將小室底部膜表面的細(xì)胞和基底膜擦除，取出Transwell小室，用PBS洗滌細(xì)胞，甲醇固定30 min，采用0.1%結(jié)晶紫800 μL染色20 min，用PBS洗滌，晾干后于顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照統(tǒng)計(jì)。

1.2.6Western blot

采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。采用10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。聚偏二氟乙烯膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后與抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜，再同二抗于室溫下孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光試劑盒時(shí)條帶顯影并在5200化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)觀察條帶，利用ImageJ軟件(美國(guó)NIH公司)統(tǒng)計(jì)條帶灰度，根據(jù)β-actin灰度作均一化處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Tipα的純化鑒定

在相對(duì)分子質(zhì)量26×103(標(biāo)簽蛋白部分為3×103，Tipα為23×103)處有一明顯蛋白條帶。見(jiàn)圖1。

M：蛋白Marker；1：BL21/pET30a-Tipα總蛋白；2：純化后的重組Tipα。圖1 重組Tipα蛋白的純化電泳圖

2.2 Tipα抑制順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性

與空白對(duì)照組比較，順鉑組胃癌細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，Tipα干預(yù)逆轉(zhuǎn)順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞活性的抑制作用，明顯降低了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A：Tipα對(duì)順鉑處理的胃癌細(xì)胞活性的影響；B：Tipα對(duì)順鉑處理的胃癌細(xì)胞凋亡的影響；a：P<0.05；b：P<0.05。圖2 Tipα抑制順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2.3 Tipα逆轉(zhuǎn)順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的抑制作用

與空白對(duì)照組比較，順鉑組侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯降低，Tipα干預(yù)明顯降低了順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

a：P<0.05，b：P<0.05。圖3 Tipα逆轉(zhuǎn)順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的抑制作用

2.4 Tipα處理激活胃癌細(xì)胞PI3K/Akt通路

順鉑組胃癌細(xì)胞PI3K、Akt總蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值均明顯低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Tipα聯(lián)合順鉑組胃癌細(xì)胞PI3K、Akt總蛋白表達(dá)水平與順鉑組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值明顯高于順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

a：P<0.05，b：P<0.05。圖4 Tipα處理激活胃癌細(xì)胞PI3K/Akt通路

2.5 LY294002部分抵消Tipα對(duì)胃癌細(xì)胞順鉑毒性的抑制作用

與Tipα和順鉑組比較，LY294002聯(lián)合Tipα和順鉑組胃癌細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

A：LY294002干預(yù)對(duì)Tipα促進(jìn)順鉑處理的胃癌細(xì)胞存活的影響；B：LY294002干預(yù)對(duì)Tipα抑制順鉑處理胃癌細(xì)胞凋亡的影響。a：P<0.05，b：P<0.05。圖5 LY294002部分抵消Tipα對(duì)胃癌細(xì)胞順鉑毒性的抑制作用

2.6 LY294002部分抵消了Tipα促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲作用

與Tipα聯(lián)合順鉑組比較，LY294002聯(lián)合Tipα和順鉑組胃癌細(xì)胞侵襲能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

a：P<0.05。圖6 LY294002部分抵消Tipα促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲作用

3 討 論

以順鉑為基礎(chǔ)的化療是晚期轉(zhuǎn)移性癌癥患者輔助治療及手術(shù)切除后抑制復(fù)發(fā)最有效的方法之一，然而，耐藥性是阻礙化療療效的主要因素，嚴(yán)重威脅癌癥患者的預(yù)后。目前，順鉑耐藥的機(jī)制尚未完全闡明，本研究探討了幽門(mén)螺桿菌Tipα對(duì)胃癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響，結(jié)果顯示，Tipα處理后胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低，PI3K/Akt信號(hào)通路被活化。

Tipα是一種幽門(mén)螺桿菌毒力蛋白，多以二聚體形式發(fā)揮功能，通過(guò)與細(xì)胞表面核仁蛋白直接結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞中，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α和趨化因子基因的表達(dá)，并激活核因子κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路，發(fā)揮促炎作用[9-10]。 肖玲巧等[11]通過(guò)體外表達(dá)Tipα并處理巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Tipα通過(guò)激活人NOD樣受體家族蛋白3(NLPR3)炎性小體促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡。CHEN等[12]發(fā)現(xiàn)，Tipα通過(guò)激活白細(xì)胞介素-6/轉(zhuǎn)錄激活子3信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。DEVANAND等[1]發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞易位基因2能抑制胃癌細(xì)胞膜表面核仁蛋白表達(dá)，從而抑制Tipα對(duì)腫瘤壞死因子-α等的誘導(dǎo)作用而發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，Tipα能逆轉(zhuǎn)順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞活性和侵襲能力的抑制作用，以及對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。提示Tipα不僅能促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，還能降低胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，對(duì)胃癌患者的治療產(chǎn)生不利影響。

PI3K/Akt信號(hào)通路是重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，具有多種生物學(xué)功能，包括調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、分化及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[13]。近年來(lái)，PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及化療抗性的作用被廣泛報(bào)道[14-15]。DU等[16]發(fā)現(xiàn)，芒果苷能通過(guò)阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的活化抑制胃癌細(xì)胞活性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。LU等[17]通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路糾正了胃癌細(xì)胞的順鉑耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，Tipα促進(jìn)了PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，而利用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑——LY294002處理后能部分消除Tipα對(duì)胃癌細(xì)胞順鉑敏感性的抑制作用，說(shuō)明PI3K/Akt信號(hào)通路的活化參與了Tipα對(duì)胃癌細(xì)胞順鉑敏感性的抑制過(guò)程，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的活化可能是治療Tipα相關(guān)胃癌耐藥的潛在手段。

綜上所述，本研究通過(guò)原核表達(dá)方式在體外表達(dá)重組Tipα發(fā)現(xiàn)，其能通過(guò)增加順鉑處理的胃癌細(xì)胞活性，抑制順鉑處理的胃癌細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)順鉑處理的胃癌細(xì)胞侵襲，其機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)通路活化有關(guān)。