羅燕群，朱秀蘭，黃 莉，黃翠玉，孫 力，張曦倩，劉風(fēng)華

(廣東省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 511400)

不明原因性反復(fù)種植失敗(RIF)給不孕不育患者帶來巨大經(jīng)濟(jì)和心理壓力，成為輔助生殖技術(shù)中一個亟待解決的難點和熱點問題。導(dǎo)致不明原因性RIF的機制復(fù)雜[1]，除采用植入前遺傳學(xué)篩查排除非整倍體胚胎移植外，提高子宮內(nèi)膜容受性成為其治療的重要措施之一[2]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，宮腔灌注粒細(xì)胞刺激因子(G-CSF)可增加子宮內(nèi)膜厚度，提高臨床妊娠率，但其在RIF患者中的應(yīng)用效果尚存在爭議。目前，大部分研究集中于移植前宮腔灌注G-CSF 1次對RIF效果的分析，而對宮腔灌注時機及次數(shù)的不同是否影響其療效的研究尚少。本研究探討了G-CSF宮腔灌注不同次數(shù)對不明原因性2次及以上RIF患者臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率等的影響，希望能為臨床工作提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年9月至2020年4月在本院行凍融胚胎移植治療的369個RIF周期資料。根據(jù)患者接受150 μg G-CSF宮腔灌注次數(shù)不同分為A組(宮腔灌注0次，278例)、B組(宮腔灌注1次，51例)和C組(宮腔灌注2次，40例)。本研究已通過本院倫理委員會審核批準(zhǔn)(201801088號)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)移植年齡小于40歲；(2)既往至少2次或以上移植周期(包括新鮮或凍融胚胎)，每個周期移植至少1個優(yōu)質(zhì)胚胎[3]，累積移植大于或等于4個優(yōu)質(zhì)胚胎[4-5]；(3)基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)<15 U/L；(4)均為凍融囊胚移植；(5)簽署本研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)男女雙方染色體核型異常；(2)自然周期排卵日或激素替代療法(HRT)內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度小于7 mm[6]；(3)女方抗磷脂抗體陽性；(4)D-二聚體、凝血酶Ⅲ異常；(5)輸卵管積水；(6)子宮畸形；(7)中、重度子宮粘連電切術(shù)后。

1.2 方法

1.2.1宮腔灌注時間

(1)B組：自然周期卵泡破裂日或激素替代人工周期內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日。(2)C組：第1次在自然周期卵泡晚期或行激素替代人工周期雌激素補充第12天左右；第2次在自然周期卵泡破裂日或行激素替代人工周期內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日。

1.2.2操作步驟

外陰和陰道常規(guī)消毒后用5 mL注射器連接人工授精軟管，抽取重組人G-CSF注射液(瑞白，齊魯制藥有限公司)150 μg ，超聲引導(dǎo)下緩慢注入宮腔后臥床休息30 min。

1.2.3子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備及胚胎移植

根據(jù)患者月經(jīng)周期特點選擇內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。月經(jīng)周期規(guī)律、排卵正?；颊卟捎米匀恢芷跍?zhǔn)備子宮內(nèi)膜；月經(jīng)紊亂、排卵異?；颊邉t行雌孕激素替代療法(即人工周期)準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。囊胎解凍當(dāng)天超聲引導(dǎo)下輕柔將移植管置入子宮腔內(nèi)，緩慢推注胚胎后停留片刻退出，于胚胎室觀察無胚胎遺留后結(jié)束。

1.2.4囊胚解凍

移植日行囊胚解凍(Vitrolife，瑞典)，采用David Gardner評分系統(tǒng)對復(fù)蘇囊胚進(jìn)行評分。

1.2.5移植后黃體支持及隨訪

囊胚移植后常規(guī)行激素黃體支持，移植后第12天檢測血清β-人絨毛膜促性腺激素(hCG)水平判斷是否妊娠，β-hCG>25 μg/L診斷為β-hCG陽性，移植1個月后陰道超聲觀察宮內(nèi)有孕囊則診斷為臨床妊娠。

1.2.6觀察指標(biāo)

觀察3組患者妊娠結(jié)局，包括移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、種植率、β-hCG陽性率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組患者一般資料比較

3組患者年齡、體重指數(shù)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)黃體生成素(LH)、基礎(chǔ)雌二醇(E2)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)、抗苗勒管激素、既往移植周期數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組患者一般資料比較

續(xù)表1 3組患者一般資料比較

2.2 3組患者妊娠結(jié)局比較

A、B、C組患者β-hCG陽性率、臨床妊娠率依次遞增，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，3組患者種植率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 3組患者妊娠結(jié)局比較

3 討 論

RIF指多次移植優(yōu)質(zhì)胚胎仍未能成功植入，但其定義尚未統(tǒng)一[5,7]，近年來認(rèn)可年齡小于40 周歲、連續(xù)移植大于或等于 4個優(yōu)質(zhì)胚胎(包括新鮮及冷凍胚胎)均未能獲得臨床妊娠者[5]。胚胎成功種植需高質(zhì)量胚胎、良好的子宮內(nèi)膜容受性及母體恰當(dāng)?shù)拿庖吒淖儯渲凶訉m內(nèi)膜容受性異常被認(rèn)為是導(dǎo)致不明原因性RIF的主要因素。隨著生殖免疫的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到宮腔免疫環(huán)境異常將影響子宮內(nèi)膜容受性[8]。CAVALCANTE等[9]認(rèn)為，宮腔灌注G-CSF可改善子宮內(nèi)膜容受性，是RIF患者的一種新的免疫治療方法，但目前對宮腔灌注G-CSF治療RIF的效果尚存在爭議[3,6,10-13]。RIF患者宮腔灌注G-CSF劑量及次數(shù)是否影響其療效尚有待于進(jìn)一步研究驗證。

3.1 RIF患者G-CSF宮腔灌注與未灌注的臨床結(jié)局

宮腔灌注G-CSF可提高薄型子宮內(nèi)膜患者體外受精-胚胎移植 (IVF-ET) 助孕的子宮內(nèi)膜厚度、胚胎種植率及臨床妊娠率[14-15]，也可顯著提高RIF患者種植率和生化妊娠率及臨床妊娠率[13，16-17]，但未增加不明原因性RIF患者活產(chǎn)率[11-12]?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF通過短暫抑制淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和輔助性T淋巴細(xì)胞2的免疫應(yīng)答，在胚胎著床和持續(xù)妊娠中發(fā)揮重要作用[18]。宮腔灌注G-CSF可調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞(NK)的細(xì)胞毒性及降低干擾素和IL-8的產(chǎn)生[19]；同時可通過增加單核細(xì)胞內(nèi)皮祖細(xì)胞與促血管生成基因的表達(dá)促進(jìn)局部血管生成，誘導(dǎo)血管重塑、內(nèi)膜蛻膜化和改善子宮內(nèi)膜容受性而有利于妊娠的建立和維持[20-22]。WURFEL等[23]研究表明，RIF患者中出現(xiàn)缺少3個活化型免疫球蛋白樣激活受體的概率可達(dá)78.0%，對該部分RIF患者行粒細(xì)胞治療后發(fā)現(xiàn)其妊娠率明顯增加。本研究對連續(xù)2次以上移植且累積移植大于或等于4個優(yōu)質(zhì)胚胎仍未孕患者常規(guī)行宮腔鏡及子宮內(nèi)膜CD138，外周血淋巴細(xì)胞(T cells,B cells and NK cells,TBNK) 亞群分析、抗磷脂抗體、抗核抗體譜、同型半胱氨酸、蛋白C和蛋白S等檢查。針對不明原因性RIF，經(jīng)驗性行G-CSF宮腔灌注治療。針對宮腔灌注G-CSF是否改善RIF患者臨床結(jié)局，本研究發(fā)現(xiàn)，宮腔灌注1次或2次的RIF患者β-hCG陽性比例、臨床妊娠率明顯較未灌注的RIF患者高，3組患者早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。然而也有研究表明，宮腔灌注G-CSF不提高非薄型子宮內(nèi)膜RIF患者的子宮內(nèi)膜厚度、臨床妊娠率和活產(chǎn)率[6]。分析發(fā)現(xiàn)其納入標(biāo)準(zhǔn)并未限制不明原因性RIF患者及未限制移植的胚胎，即納入了卵裂期和囊胚移植的RIF患者，可能對妊娠率的統(tǒng)計產(chǎn)生偏倚。另一項研究發(fā)現(xiàn)，雖然宮腔輸注G-CSF或安慰劑患者妊娠率明顯高于未灌注G-CSF的患者，但宮腔輸注G-CSF的患者流產(chǎn)率明顯低于其他兩組[3]，分析其原因認(rèn)為，宮腔灌注本身可能提高妊娠率，G-CSF藥物的治療增加了活產(chǎn)率。

3.2 G-CSF宮腔灌注1、2次的RIF患者臨床結(jié)局

據(jù)文獻(xiàn)報道，RIF患者一次性給予G-CSF皮下注射的妊娠率為50.7%，多次應(yīng)用G-CSF 治療長期不孕患者和(或)合并連續(xù)5次輔助生殖技術(shù)助孕失敗及缺乏免疫球蛋白樣激活受體的患者移植妊娠率進(jìn)一步增加[24-25]。WüRFEL[24]研究表明，內(nèi)膜薄的患者通過增加宮腔灌注G-CSF次數(shù)可持續(xù)增加子宮內(nèi)膜厚度而改善臨床結(jié)局。目前，RIF患者G-CSF宮腔灌注治療頻率有1次/周期[6]和2次/周期[17]，是否增加宮腔灌注的次數(shù)而增強療效？本研究雖然宮腔灌注2次的患者內(nèi)膜薄于宮腔灌注1次及未灌注的患者，但通過增加宮腔灌注次數(shù)可獲得較高的β-hCG陽性率和臨床妊娠率。因此，臨床工作中對連續(xù)2次及以上移植大于或等于4個優(yōu)質(zhì)胚胎未孕的患者建議給予G-CSF 150 μg宮腔灌注2次治療，尤其針對自然周期卵泡晚期或行HRT人工周期補充雌激素第12天子宮內(nèi)膜厚度小于或等于8 mm的患者。

本研究為回顧性分析，由于樣本量有限等因素可能使β-hCG陽性率及妊娠率等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計產(chǎn)生偏倚，故尚需設(shè)計良好前瞻性的隨機臨床試驗進(jìn)一步證實。

總之,RIF患者宮腔灌注G-CSF 150 μg可能增加移植周期β-hCG陽性率和臨床妊娠率，且宮腔灌注2次效果優(yōu)于灌注1次者。