周超鋒, 周世繁, 田 青, 王 賽, 李洪霖, 馬純政

（河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450002）

食管癌是一種高侵襲性腫瘤。目前食管癌主要有2 種組織學(xué)類型，即食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cancer，ESCC） 和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，ECA）。ESCC 作為食管癌的主要組織學(xué)類型主要發(fā)生在亞洲，占食管癌的90% 以上。由于缺乏可行的診斷策略，目前確診時(shí)的食管癌患者多為晚期，其5 年生存率非常低［1］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 是一個(gè)長(zhǎng)度為200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA 轉(zhuǎn)錄體家族，與各種類型癌癥的病理發(fā)展有關(guān)［2］。研究［3］顯示：lncRNA 生物學(xué)功能豐富，廣泛參與生物體各類重要生理過(guò)程。研究［4］表明：lncRNA 參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展，lncRNA-尿路上皮癌胚抗原1 （urothelial carcinoma antigen 1，UCA1） 在食管癌中作為性別決定基因相關(guān)HMG盒基因4 （sex determination gene associated with HMG box gene 4，Sox4） 的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA） 促進(jìn)細(xì)胞增殖。lncRNA- 漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1） 的高表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT） 促進(jìn)食管癌的侵襲［5］。DNA 損傷誘導(dǎo)的非編碼RNA （non-coding RNA activated by DNA damage，NORAD） 是一種保守的lncRNA，在不同癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。NORAD通過(guò)抑制miR-202-5p參與結(jié)直腸癌進(jìn)展［6］，通過(guò)調(diào)控miR-214/蛋白激酶B （protein kinase B，PKB） /哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，抑制胃癌細(xì)胞凋亡［7］。近年來(lái)越來(lái)越多的研究［8-9］顯示： miR-26a-5p 參與了胰腺導(dǎo)管腺癌、肝癌和結(jié)直腸癌等的發(fā)展，而且在骨肉瘤U2OS 細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞中NORAD 與miR-26a-5p 具有靶向作用。然而，NORAD 與miR-26a-5p 在食管癌中的研究甚少，且NORAD是否通過(guò)miR-26a-5p 發(fā)揮作用尚不清楚。本文作者分析NORAD 在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能，探討食管癌的發(fā)病機(jī)制，為尋找食管癌有價(jià)值的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來(lái)源收集在本院行手術(shù)治療的45 例食管癌患者癌組織和40 例食管癌患者的癌旁正常組織標(biāo)本。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放化療等任何形式的抗腫瘤治療，且經(jīng)過(guò)病理診斷確診為食管癌的患者，排除有食管癌家族史和經(jīng)過(guò)放化療等治療的患者。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：20190723016），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器食管癌Eca-109 細(xì)胞和人正常食管鱗狀上皮Het-1A 細(xì)胞購(gòu)于北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司。青-鏈霉素購(gòu)于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：30-002-CI），MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：C0009S），DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號(hào)：PM150210B），NORAD小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）、pcDNA-3.1 （+）、 pcDNA-NORAD 和Unc-51 樣自噬激活激酶1 （Unc-51 - like autophagy activates kinase 1，ULK1） siRNA 質(zhì)粒由北京擎科生物公司合成，模擬物對(duì)照（mimics NC）、 抑制劑對(duì)照（inhibitor NC）、 miR-26a-5p 抑制劑（miR-26a-5p inhibitor） 和miR-26a-5p 模擬物（miR-26a-5p mimics） 購(gòu)于上海GenePharma 公司，ULK1 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司（貨號(hào)：229909）。熒光定量PCR 儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司（貨號(hào)：CFX96）。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)NORAD 與miR-26a-5p 的靶向關(guān)系采用miRanda 數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)NORAD 與miR-26a-5p 的結(jié)合位點(diǎn)，將NORAD 結(jié)合位點(diǎn)的野生序列（NORAD WT） 和突變序列（NORAD MUT） 雙熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO分別與miR-26a-5p mimics 和mimics NC 共轉(zhuǎn)染至Eca-109 細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-26a-5p 與ULK1 的靶向關(guān)系采用TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)miR-26a-5p 與ULK1 的結(jié)合位點(diǎn)，再將含有ULK1結(jié)合位點(diǎn)的野生序列（ULK1 WT） 和突變序列（ULK1 MUT） 雙熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-26a-5p mimics 和mimics NC 共轉(zhuǎn)染至Eca-109細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染取出4 ℃放置的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌Eca-109 細(xì)胞和人正常食管鱗狀上皮Het-1A 細(xì)胞，所有培養(yǎng)瓶中均加入10% 胎牛血清及100 U·mL－1青-鏈霉素，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿的Eca-109 細(xì)胞按照5×104/孔的密度接種到12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)12 h，棄培養(yǎng)基，用無(wú)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，按照Turbofect 試劑說(shuō)明書(shū)步驟，將不同的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Eca-109 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，收集有效細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮娃D(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同，Eca-109 細(xì)胞分為siRNA NC 組 和NORAD siRNA 組，inhibitor NC 組和miR-26a-5p inhibitor 組；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)NORAD 與miR-26a-5p 的靶向關(guān)系后，將Eca-109 細(xì)胞分為pcDNA-3.1（+） + mimics NC 組、pcDNA-NORAD+mimics NC 組、pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics 組和pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics 組； 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-26a-5p 與ULK1 的靶向關(guān)系后，將Eca-109 細(xì)胞分為siRNA NC 組和ULK1 siRNA 組，siRNA NC+inhibitor NC 組、NORAD siRNA+inhibitor NC 組、 siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor 組和NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor 組。

1.6 RT-qPCR 法檢測(cè)食管癌患者癌組織、癌旁正常組織和不同細(xì)胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p和ULK1 mRNA 表達(dá)水平取癌組織和癌旁正常組織，收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用TRIzol 技術(shù)提取組織和細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)RNA 質(zhì)量和水平，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。引物序列：NORAD 上游引物5′-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3′（237 bp），NORAD下游引物5′-CCGTTGTCGTCAGGACTAGGTAGG-3′（224bp）；miR-26a-5p 上游引物5′-ATGGTTCGTGGGTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3′ （168 bp） ，miR-26a-5p 下游引物5′-GCAGGGTCCGAGGTATTCG-3′ （153 bp）； GAPDH 上游引物5′-CAAGGACCTCTACGCCAACAC-3′ （135 bp），GAPDH 下游引物5′-TGGAGGCGCGATGATCTT-3′（126 bp）。

1.7 MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞活性將各組細(xì)胞按照1×105mL－1的密度分別接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后，再向孔內(nèi)加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，結(jié)晶充分溶解后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm 處的吸光度（A） 值，計(jì)算各組細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組A 值/對(duì)照組A 值×100%。

1.8 Transwell 法檢測(cè)各組細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)收集各組對(duì)數(shù)期轉(zhuǎn)染成功的Eca-109 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×105mL－1，采用基質(zhì)凝膠涂覆Transwell 上室，靜置12 h，Transwell 上室中加入細(xì)胞懸液（不含胎牛血清），Transwell 下室中加入培養(yǎng)基（含20% 胎牛血清），在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出上室，用PBS 緩沖液洗滌后置于4% 多聚甲醛中固定10 min，再用PBS 緩沖液洗滌3 次，結(jié)晶紫溶液染色，用蒸餾水漂洗，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，取平均值，即侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.9 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和ULK1蛋白表達(dá)水平采用裂解液裂解各組細(xì)胞，提取各組細(xì)胞蛋白，測(cè)定所提取的蛋白濃度。采用沸水使細(xì)胞蛋白充分變性，冷卻后取適量的蛋白凝膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳實(shí)驗(yàn)，電泳結(jié)束后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)儀器將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，利用PBST （含5%脫脂奶粉） 在4 ℃條件下孵育，膜上加入一抗，孵育2 h，在PVDF 膜上加入稀釋的二抗，1 h 后用TBST 清洗后加入ECL 顯影，采用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組織和各組細(xì)胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p 和ULK1 mRNA 表達(dá)水平，各組細(xì)胞活性、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞熒光素酶活性及E-cadherin、N-cadherin 和ULK1 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，2 組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 食管癌組織和細(xì)胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p 和ULK1 mRNA 表達(dá)水平食管癌組織中NORAD 和ULK1 mRNA 表達(dá)水平（2.12±0.35和2.18±0.34） 明顯高于癌旁正常組織（1.11±0.65 和1.09±0.66）（P＜0.01），Eca-109 細(xì)胞中NORAD 和ULK1 mRNA 表達(dá)水平（2.07±0.34和1.93±0.25） 明顯高于Het-1A 細(xì)胞（1.31±0.21 和1.35±0.27）（P＜0.01）。食管癌組織中miR-26a-5p 表達(dá)水平（0.49±0.48） 明顯低于癌旁正常組織（1.16±0.44）（P＜0.01），Eca-109 細(xì)胞中miR-26a-5p 表達(dá)水平（0.51±0.15） 明顯低于Het-1A 細(xì)胞（1.28±0.46）（P＜0.01）。

2.2 沉默NORAD 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中NORAD mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞活性、侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達(dá)水平與siRNA NC 組比較，NORAD siRNA 組細(xì)胞中NORAD mRNA 表達(dá)水平和細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01），侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（ P＜0.01 ），細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），N-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1 和圖1 及2。

表1 沉默NORAD 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中NORAD mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞活性和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.1 Expression levels of NORAD in cells,cell viabilities and number of invasion cells in various groups in silencing experiment (n=9，±s）

表1 沉默NORAD 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中NORAD mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞活性和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.1 Expression levels of NORAD in cells,cell viabilities and number of invasion cells in various groups in silencing experiment (n=9，±s）

*P＜0.01 compared with siRNA NC group.

Group SiRNA NC NORAD siRNA NORAD mRNA 1.18±0.57 0.50±0.43*Cell viability(η/%)68.53±3.68 42.75±6.25*Number of invasion cells 80.56±7.58 35.82±8.26*

圖1 沉默NORAD 實(shí)驗(yàn)Transwell 法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫, ×200）Fig.1 Invasion of cells in various group detected by Transwell assay in NORAD silencing experiment(Crystal violet,×200）

2.3 NORAD 與miR-26a-5p 的靶向關(guān)系采用miRcode 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)NORAD 與miR-26a-5p 的結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。與NORAD WT+mimics NC 組比較，NORAD WT+miR-26a-5p mimics 組細(xì)胞熒光素 酶 活 性 明 顯 降 低（P＜0.01）； 與NORAD MUT+mimics NC 組 比 較，NORAD MUT+miR-26a-5p mimics 組細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明NORAD 與miR-26a-5p之間具有靶向關(guān)系。見(jiàn)圖4。

圖3 NORAD 與miR-26a-5p 的結(jié)合位點(diǎn)Fig.3 Binding sites of NORAD and miR-26a-5p

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)NORAD 與miR-26a-5p 靶向關(guān)系時(shí)各組細(xì)胞熒光素酶活性Fig.4 Luciferase activities of cells in various groups in dual luciferase reporter gene assay for detecting target relationship between NORAD and miR-26a-5p

2.4 沉默miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中miR-26a-5p表達(dá)水平、細(xì)胞活性、侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達(dá)水平與inhibitor NC 組比較，miR-26a-5p inhibitor 組細(xì)胞中miR-26a-5p 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.01），侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.01），細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），N-cadherin 蛋白表達(dá)表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)表2 和圖5 及6。

圖2 沉默NORAD 實(shí)驗(yàn)Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.2 Electrophoregram(A) and histogram (B) of expressions of E-cadherin and N-cadherin proteins in cells in various groups detected by Western blotting methods in NORAD silencing experiment

表2 沉默miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞中miR-26a-5p 表達(dá)水平、細(xì)胞活性和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.2 Expression levels of miR-26a-5p in cells,cell viabilities and number of invasion cells in various groups in miR-26a-5p silencing experiment (n=9，±s）

表2 沉默miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞中miR-26a-5p 表達(dá)水平、細(xì)胞活性和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.2 Expression levels of miR-26a-5p in cells,cell viabilities and number of invasion cells in various groups in miR-26a-5p silencing experiment (n=9，±s）

*P＜0.01 compared with inhibitor NC group.

Group Inhibitor NC MiR-26a-5p inhibitor miR-26a-5p 1.16±0.28 0.52±0.26*Cell viability(η/%)62.86±4.53 85.28±5.36*Number of invasion cells 50.58±7.26 98.29±6.56*

圖5 沉默miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)Transwell 法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫, ×200）Fig.5 Invasion of cells in various groups detected by Transwell assay in miR-26a-5p silencing experiment(Crystal violet ,×200）

圖6 沉默miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of E-cadherin and N-cadherin in cells in various groups detected by Western blotting method in miR-26a-5p silencing experiment

2.5 上調(diào)NORAD 和miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞活性、侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中E-cadherin 及N-cadherin蛋白表達(dá)水平與pcDNA-3.1（+）+mimics NC組比較，pcDNA-NORAD+mimics NC 組細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.01）、 侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.01），pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics 組細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01）、侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics 組 比 較，pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics 組細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.01），侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與pcDNA-3.1 （+） +mimics NC 組比較，pcDNA-NORAD+mimics NC組細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）、 N-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics 組細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）、 N-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics組比較，pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics 組細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），N-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)表3 和圖7 及8。

圖7 上調(diào)NORAD 和miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)Transwell 法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫, ×200）Fig.7 Invasion of cells in various groups detected by Transwell assay in up-regulated NORAD and miR-26a-5p experiment（Crystal violet ,×200）

表3 上調(diào)NORAD 和miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞活性和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.3 Cell viabilities and number of invasion cells in various groups in up-regulated NORAD and miR-26a-5p experiment(n=9，±s）

表3 上調(diào)NORAD 和miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞活性和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.3 Cell viabilities and number of invasion cells in various groups in up-regulated NORAD and miR-26a-5p experiment(n=9，±s）

*P＜0.01 compared with pcDNA-3.1（+）+mimics NC group ；△P＜0.01 compared with pcDNA-3.1（+）+miR-26a-5p mimics group.

Group PcDNA-3.1(+)+mimics NC PcDNA-NORAD+mimics NC PcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics PcDNA-NORAD+miR-26a-5pmimics Cell viability(η/%)45.36±5.63 82.48±6.58*23.46±6.36*60.82±6.72△Number of invasion 60.82±6.72 120.56±7.85*30.58±7.83*62.65±7.25△

2.6 miR-26a-5p 與ULK1 的靶向關(guān)系采用TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-26a-5p 與ULK1 的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖9。與ULK1 WT+mimics NC 組比較，ULK1 WT+ miR-26a-5p mimics 組細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01）；與ULK1 MUT+mimics NC 組比較，ULK1 MUT+miR-26a-5p mimics 組細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明miR-26a-5p 與ULK1 之間具有靶向關(guān)系。見(jiàn)圖10。

圖9 miR-26a-5p 與ULK1 的結(jié)合位點(diǎn)Fig.9 Binding sites of miR-26a-5p and ULK1

圖10 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-26a-5p 與ULK1 靶向關(guān)系時(shí)各組細(xì)胞熒光素酶活性Fig.10 Luciferase activities of cells in various groups in dual luciferase reporter gene assay for detecting target relationship between miR-26a-5p and ULK1

2.7 沉默ULK1 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中ULK1 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞活性、侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中E-cadherin及N-cadherin 蛋白表達(dá)水平與siRNA NC 組比較，ULK1 siRNA 組細(xì)胞中ULK1 mRNA 表達(dá)水平和細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01），侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），N-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）。見(jiàn)表4 和圖11 及12。

圖11 沉默ULK1 實(shí)驗(yàn)Transwell 法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況（結(jié)晶紫，×200）Fig.11 Invasion of cells in various groups detected by Transwell assay in ULK1 silencing experiment (Crystal violet, ×200)

表4 沉默ULK1 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中ULK1 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞活性和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.4 Expression levels of ULK1 mRNA in cells, cell viabilities, and number of invasion cells in various groups in ULK1 silencing experiment (n=9，±s）

表4 沉默ULK1 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中ULK1 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞活性和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.4 Expression levels of ULK1 mRNA in cells, cell viabilities, and number of invasion cells in various groups in ULK1 silencing experiment (n=9，±s）

*P＜0.01 compared with siRNA NC group.

Group SiRNA NC ULK1 siRNA ULK1 mRNA 1.26±0.44 0.54±0.32*Cell viability(η/%)82.56±4.52 43.89±6.27*Number of invasion cells 70.62±5.75 38.65±6.28*

圖8 上調(diào)NORAD 和miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin及N-cadherin蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of E-cadherin and N-cadherin in cells in various groups detected by Western blotting method in up-regulated NORAD and miR-26a-5p experiment

2.8 上調(diào)NORAD 下調(diào)miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中ULK1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平與siRNA NC+inhibitor NC 組（0.96±0.05 和0.72±0.05） 比較，NORAD siRNA+inhibitor NC 組細(xì)胞中ULK1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平（0.48±0.08 和0.23±0.02） 明顯降低（P＜0.01），siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor 組細(xì)胞中ULK1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平（1.75±0.62 和1.48±0.31） 明顯升高（P＜0.01）； 與siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor 組比較，NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor 組細(xì)胞中ULK1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平（0.89±0.06 和0.75±0.28） 明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖13。

圖13 上調(diào)NORAD 下調(diào)miR-26a-5p 實(shí)驗(yàn)Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中ULK1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.13 Electrophoregram of ULK1 protein in cells in various groups detected by western blotting method in up-regulated mRNA down-regulated miR-26a-5p experiment

圖12 沉默ULK1 實(shí)驗(yàn)Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.12 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of E-cadherin and N-cadherin in cells in various groups detected by Western blotting method in ULK1 silencing experiment

3 討 論

lncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸且無(wú)蛋白編碼功能的RNA 分子，在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制中對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、RNA 剪接和表觀遺傳等調(diào)控方面均發(fā)揮不同的作用。近年來(lái)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的lncRNA 已被發(fā)現(xiàn)，并成為腫瘤診療研究的熱點(diǎn)［10-12］。研究［13］顯示： lncRNA-肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋白1-反義RNA1 （actin filamentassociated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1）過(guò)表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。也有研究［14］顯示： lncRNA- 煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶反義RNA1（nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisense RNA1，NNT-AS1） 通過(guò)NNT-AS1/miR-3666/E2F 轉(zhuǎn)錄因子2 （E2F transcription factor 2，E2F2）軸調(diào)控肺癌的進(jìn)展。同源盒A11 反義RNA（homeobox A11 antisense RNA，HOXA11-AS） 能通過(guò)與miRNA 和zeste 2 多梳抑制復(fù)合物2 亞基增強(qiáng)子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2） 蛋白等相互作用促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為［15］。研究［13-15］表明：lncRNA 與腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。NORAD在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌和胃癌等發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要的作用。有研究［16］表明：NORAD 參與了結(jié)直腸癌和胃癌的進(jìn)展，且食管鱗狀細(xì)胞癌中NORAD 的表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)聯(lián)。但NORAD 調(diào)控Eca-109 細(xì)胞的作用機(jī)制目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：NORAD 在Eca-109細(xì)胞和食管癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，與NORAD 在結(jié)直腸癌和胃癌等組織中的表達(dá)一致，均在癌細(xì)胞中出現(xiàn)了高表達(dá)，考慮到NORAD 在其他癌癥中發(fā)揮的癌基因作用，推測(cè)NORAD 在食管癌中也可能具有同樣的生物學(xué)功能。本研究進(jìn)一步探討NORAD 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、 侵襲和EMT的影響及其作用機(jī)制，結(jié)果顯示：采用siRNA 技術(shù)沉默NORAD 可以明顯抑制Eca-109 細(xì)胞的增殖，NORAD 在食管癌發(fā)展過(guò)程中作為癌基因發(fā)揮重要作用，是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

lncRNA 通過(guò)ceRNA 與miRNA 相互作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而調(diào)控癌癥進(jìn)展［17］。lncRNA-核仁小分子RNA 宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1） 通過(guò)海綿化miR-145-5p 上調(diào)異黏蛋白（metadherin，MTDH） 表達(dá)，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展［18］。lncRNA- 癌癥易感性候選基因11 （cancer susceptibility 11，CASC11） 通過(guò)miRNA-150 促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖［19］。異丙酚通過(guò)減輕lncRNAHOXA11 基因反義RNA （HOXA11 antisense RNA，HOXA11-AS） 對(duì)miRNA let-7i 的抑制，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡［20］。本文作者研究了NORAD 與miR-26a-5p 的關(guān)系，通過(guò)miRcode 數(shù)據(jù)庫(kù)分析確定了NORAD 與miR-26a-5p 之間具有結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步證明miR-26a-5p 是NORAD 的下游靶向基因。為了研究NORAD 與miR-26a-5p之間的調(diào)控關(guān)系，推測(cè)NORAD 可以海綿化miR-26a-5p，降低miR-26a-5p 的作用。本研究結(jié)果表明： NORAD 的生物學(xué)功能是通過(guò)調(diào)控miR-26a-5p實(shí)現(xiàn)的，過(guò)表達(dá)NORAD通過(guò)miR-26a-5p影響Eca-109 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。研究［21］顯示：lncRNA-H19/miR-194/ PFTAIRE 蛋白激酶1 （PFTAIRE protein kinase 1，PFTK1） 軸調(diào)控胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果表明：miR-26a-5p與ULK1 具有靶向關(guān)系。ULK1 是自噬相關(guān)基因，也是哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬通路的關(guān)鍵基因，通過(guò)上游信號(hào)傳導(dǎo)，與其他下游自噬相關(guān)蛋白相互耦合，形成不同復(fù)合體對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。研究［22］顯示：磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated proteinkinase，AMPK） /ULK1 通路介導(dǎo)了胃癌細(xì)胞的自噬。自噬蛋白ULK1 在人肝癌細(xì)胞中調(diào)控叉頭框蛋白M1（forkhead box M1，F(xiàn)OXM1） 信號(hào)通路［23］。本研究結(jié)果顯示：ULK1 在Eca-109 細(xì)胞中表達(dá)水平升高，下調(diào)ULK1 能夠抑制Eca-109 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，表明沉默NORAD 通過(guò)miR-26a-5p/ULK1 軸抑制食管癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究證明了NORAD 通過(guò)miR-26a-5p/ULK1 軸調(diào)節(jié)Eca-109 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，從而促進(jìn)食管癌的進(jìn)展。本研究對(duì)食管癌進(jìn)展的分子機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，為食管癌患者的治療提供了一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。