王曼瑩, 付寶玉, 徐曉浩, 李香竹, 陳 紅, 孫立偉, 趙大慶

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林省通化本草生物科技有限公司，吉林 通化 134000）

隨著生活及工作節(jié)奏的加快和工作壓力的增加，亞健康狀態(tài)人群數(shù)量逐年上升。疲勞是亞健康狀態(tài)最主要和最典型的表現(xiàn)，所占比例約為78.7%，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，成為近年來(lái)備受關(guān)注的問(wèn)題之一［1］。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間處于疲勞狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)就會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，加重疲勞狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)能下降甚至引發(fā)各種疾病。因此開(kāi)發(fā)具有抗疲勞功能的保健食品對(duì)于人們生活和工作質(zhì)量的提高有重要意義。人參作為 “百草之王”，具有 “大補(bǔ)元?dú)狻?等功效。但近年來(lái)，長(zhǎng)白山作為野山參的唯一產(chǎn)區(qū)，連年采挖使其儲(chǔ)量和產(chǎn)量均明顯減少，且由于野山參較長(zhǎng)的成熟年限限制了其應(yīng)用［2］。人參組培不定根是野山參經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)得到的，在遺傳信息方面與野山參具有高度相似性，而且其生長(zhǎng)速度快、周期短且易培養(yǎng)，人參組培不定根易于提取出與野山參相似的活性成分。許多人參提取物如皂苷、多糖［3］和蛋白［4］等均被報(bào)道具有抗疲勞作用。但是現(xiàn)階段關(guān)于人參組培不定根的研究報(bào)道多集中在體系建立［5］、工藝優(yōu)化［6］和品質(zhì)評(píng)價(jià)［7］等方面，關(guān)于人參組培不定根的活性研究?jī)H發(fā)現(xiàn)其能保護(hù)四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4） 誘導(dǎo)的大鼠肝損傷［8］和緩解糖尿病大鼠的高血糖［9］。人參組培不定根蛋白（ginseng adventitious root protein，GARP） 作為人參組培不定根的重要組分，其抗疲勞作用的研究對(duì)于其開(kāi)發(fā)應(yīng)用十分必要。本實(shí)驗(yàn)以野山參為原料，經(jīng)組織培養(yǎng)等方法得到人參組培不定根，提取GARP 后喂養(yǎng)疲勞模型小鼠，探討GARP 的抗疲勞作用，并通過(guò)小鼠成肌細(xì)胞（C2C12 細(xì)胞） 探討其相關(guān)作用通路，為GARP 的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器小鼠成肌C2C12 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)。40 只昆明種清潔級(jí)小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK （吉）-2018-0001。人參組培不定根由通化本草生物科技有限公司提供。葡萄糖（分析純） 購(gòu)自天津市濱海科迪化學(xué)試劑有限公司，血乳酸（blood lactic acid，BLA）、 血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、 糖原、 谷胱甘肽（glutathione，GSH） 和總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，腺苷酸激活蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）、 磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK，p-AMPK）、 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 （glucose transporter 4，GLUT4 ） 和β -Tubulin 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，羊抗兔和羊抗鼠抗體購(gòu)自武漢博士德生物制品公司。Infinite M200 PRO 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于瑞士TECAN 公司，UV765 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于上海精密科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)luorChem HD2 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)ProteinSimple 公司。

1.2 GARP 的制備新鮮人參組培不定根用蒸餾水清洗，在10 倍體積的0.01 mol·L－1PBS 緩沖液（pH7.2） 中勻漿1 min，然后用300 目濾布進(jìn)行固液分離，8 500 r·min－1離心10 min，將溶液在相對(duì)分子質(zhì)量為10 000 的超濾膜上進(jìn)行超濾，然后通過(guò)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥昆明種清潔級(jí)小鼠40 只，隨機(jī)分為對(duì)照組，低、中和高劑量（0.25、0.50 和1.00 g·kg－1） GARP 組，每組10 只；籠內(nèi)環(huán)境溫度為（25±5） ℃，相對(duì)濕度為55%，小鼠喂養(yǎng)普通飼料，自由進(jìn)食和飲水適應(yīng)1 周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，GARP 組小鼠灌胃給予相應(yīng)劑量GARP，對(duì)照組小鼠給予等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)給藥30 d。

1.4 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)?zāi)┐喂辔附o藥30 min 后，各組小鼠于尾部負(fù)5% 體質(zhì)量的鉛塊，置于游泳箱中進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，水深35 cm，水溫（25±2） ℃，記錄小鼠自游泳開(kāi)始到沉入水面下10 s 不能浮出水面為止的時(shí)間，即小鼠游泳時(shí)間［10］。

1.5 分光光度法檢測(cè)各組小鼠血清中BLA 和BUN 水平各組小鼠末次灌胃給藥30 min 后摘眼球取血，靜置1 h 后3 000 r·min－1離心10 min 分離血清。參照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)中的方法，結(jié)合紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在波長(zhǎng)520 和530 nm 處檢測(cè)吸光度（A） 值，根據(jù)公式計(jì)算血清中BLA 和BUN 水平，BUN/BLA （mmol·L－1）=（測(cè)定A 值－ 空白A 值） /（標(biāo)準(zhǔn)A 值－空白A 值） ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)［11］。

1.6 分光光度法檢測(cè)小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性小鼠末次灌胃給藥30 min 后脫頸處死，立即取出肝臟用冷藏的生理鹽水漂洗除去血液，用試紙擦干后制成10% 的肝組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法在波長(zhǎng)405 和450 nm 處測(cè)定A 值。根據(jù)公式計(jì)算GSH 水平和SOD 活性。GSH 水平（mg·g－1）=（測(cè)定A 值－空白A 值） /（標(biāo)準(zhǔn)A值－空白A 值） ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×GSH 相對(duì)分子質(zhì)量×稀釋倍數(shù)/蛋白濃度；SOD 活性（U·mg－1）=（對(duì)照A 值－ 測(cè)定A 值） /對(duì)照A 值/50%× 反應(yīng)液體積/取樣量/蛋白濃度［12］。

1.7 分光光度法檢測(cè)各組小鼠肝糖原和肌糖原水平小鼠末次灌胃給藥30 min 后處死，解剖取出小鼠肝臟和肌肉組織，采用生理鹽水洗去血液并用濾紙吸干水分，按照糖原測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)制備組織勻漿，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)620 nm 處測(cè)定A 值并根據(jù)說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算出肝糖原和肌糖原水平［13］。糖原水平（mg·g－1組織）=（測(cè)定A 值/標(biāo)準(zhǔn)A 值） ×標(biāo)準(zhǔn)管含量×樣本稀釋倍數(shù)×10/1.11。

1.8 C2C12 細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化C2C12 細(xì)胞采用含10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80% 時(shí)，將原培養(yǎng)瓶中含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基吸走，用PBS 緩沖液漂洗細(xì)胞2 次（每次2 mL），用含2% 馬血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液對(duì)C2C12 細(xì)胞誘導(dǎo)5 d 后分化為肌管細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［14］。

1.9 分光光度法檢測(cè)各組細(xì)胞中GSH 水平、SOD活性和糖原水平C2C12 成肌細(xì)胞分化為肌管細(xì)胞后加入不同劑量（5、 10 和20 mg·L－1） GARP 處理，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，24 h后胰酶消化，1 000 r·min－1離心5 min，取細(xì)胞沉淀采用RIPA 裂解，離心取上清；按照GSH 和SOD 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)中方法在波長(zhǎng)405 和450 nm 處測(cè)定A 值［15］，根據(jù) “1.6”中的公式計(jì)算GSH 水平和SOD 活性；按照糖原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)620 nm 處測(cè)定A 值［16］，根據(jù) “1.7” 中的公式計(jì)算細(xì)胞中糖原水平。

1.10 苯酚硫酸法檢測(cè)各組細(xì)胞葡萄糖攝取能力細(xì)胞葡萄糖攝取是指其吸收培養(yǎng)液中葡萄糖的能力，使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入不同劑量GARP 處理24 h 后收集培養(yǎng)液，1 000 r·min－1離心5 min 后取上清備用，將試管置于40 ℃水浴鍋中15 min，迅速冷卻至室溫后于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定A 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式計(jì)算出樣品培養(yǎng)液的葡萄糖濃度，然后通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞葡萄糖攝取能力［17］葡萄糖攝取能力=培養(yǎng)液葡萄糖濃度－樣品葡萄糖濃度。

1.11 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中p-AMPK、AMPK 和GLUT4 蛋白表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，PBS 緩沖液漂洗、 胰酶消化后4 ℃裂解1 h，Bradford 法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度，SDS-PAGE 法分離得到蛋白條帶，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，孵育一抗p-AMPK （1∶1 000 稀釋?zhuān)?、AMPK（1∶1 000 稀釋?zhuān)?GLUT4 （1∶1 000 稀釋?zhuān)?和β -tubulin （1∶5 000 稀釋?zhuān)?置于4 ℃搖床過(guò)夜，TBST 漂洗PVDF 膜后室溫孵育相應(yīng)二抗，1 h 后漂洗PVDF 膜，加入ECL 發(fā)光液后放入化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。目標(biāo)蛋白表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-tubulin 條帶灰度值［18］。計(jì)算p-AMPK/AMPK 比值，以p-AMPK/AMPK 比值代表AMPK的磷酸化水平。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠游泳時(shí)間、血清中BLA 和BUN 水平、肝組織中GSH 水平、SOD 活性和糖原水平，C2C12 細(xì)胞中GSH 水平、SOD 活性、 糖原水平、 細(xì)胞糖攝取能力、 p-AMPK/AMPK 比值和GLUT4 蛋白表達(dá)水平均以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠游泳時(shí)間與對(duì)照組比較，低劑量GARP 組小鼠游泳時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中和高劑量GARP 組小鼠游泳時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠游泳時(shí)間Tab.1 Swimming time of mice in various groups(n=10,±s，t/min)

表1 各組小鼠游泳時(shí)間Tab.1 Swimming time of mice in various groups(n=10,±s，t/min)

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control GARP（g·kg－1）0.25 0.50 1.00 Swimming time 13.10±1.18 15.23±1.60 18.51±0.72**16.74±0.58*

2.2 各組小鼠血清中BLA 和BUN 水平與對(duì)照組比較，低劑量GARP 組小鼠血清中BLA 和BUN水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中和高劑量GARP 組小鼠血清中BLA 和BUN 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清中BLA 和BUN 水平Tab.2 Levels of BLA and BUN in serum of mice in variousgroups [n=10,±s,cB/(mmol·L－1)]

表2 各組小鼠血清中BLA 和BUN 水平Tab.2 Levels of BLA and BUN in serum of mice in variousgroups [n=10,±s,cB/(mmol·L－1)]

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control GARP（g·kg－1）0.25 0.50 1.00 BLA 9.01±0.15 8.19±0.29 7.04±0.38**7.28±0.38*BUN 56.29±1.69 53.86±1.29 41.88±1.36**43.99±1.22**

2.3 各組小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性與對(duì)照組比較，不同劑量GARP 組小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性Tab.3 GSH levels and SOD activities in liver tissue of mice in various groups (n=10，±s）

表3 各組小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性Tab.3 GSH levels and SOD activities in liver tissue of mice in various groups (n=10，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control GARP（g·kg－1）0.25 0.50 1.00 GSH[wB/（mg·g－1）]35.22±2.89 48.99±5.83*62.79±4.99**58.15±3.89**SOD[λB/（U·mg－1）]9.23±0.61 10.65±0.84*11.95±1.21*11.57±0.92*

2.4 各組小鼠肝糖原和肌糖原水平與對(duì)照組比較，不同劑量GARP 組小鼠肝糖原和肌糖原水平均明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠肝糖原和肌糖原水平Tab.4 Levels of liver glycogen and muscle glycogen of mice in various groups [n=10,x±s，wB/(mg·g－1)]

2.5 各組細(xì)胞中GSH 水平和SOD 活性與對(duì)照組比較，不同劑量GARP組細(xì)胞中GSH水平和SOD活性明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞中GSH 水平（A）和SOD 活性(B)Fig.1 GSH levels (A) and SOD activities (B) in cells in various groups

2.6 各組細(xì)胞中糖原水平和葡萄糖攝取能力與對(duì)照組比較，不同劑量GARP 組細(xì)胞中糖原水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），葡萄糖攝取能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞中糖原水平（A）和葡萄糖攝取能力（B）Fig.2 Glycogen levels (A) and glucose uptake (B) of cells in various groups

2.7 各組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK 比值和GLUT4蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，不同劑量GARP組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK 比值和GLUT4 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞中AMPK/GLUT4 通路蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregram（A）and histogram（B）of AMPK/GLUT4 pathway proteins in cells in various groups

3 討 論

疲勞是指機(jī)體在一定條件下，因長(zhǎng)時(shí)間過(guò)度勞累或緊張的勞動(dòng)到達(dá)一定階段而引起的工作效率暫時(shí)下降的一種生理和心理現(xiàn)象［19］。研究［20］顯示：許多天然藥物如人參、冬蟲(chóng)夏草和紅景天等均具有抗疲勞作用?？蛊谛Ч钪苯拥捏w現(xiàn)就是小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的增加，力竭游泳運(yùn)動(dòng)是常用的動(dòng)物模型，可以很好地評(píng)價(jià)小鼠的耐力水平［21］。本研究結(jié)果顯示：GARP 能延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間，提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)消耗大量的能量和氧氣，產(chǎn)生乳酸堆積于肌肉中，使體內(nèi)正常代謝過(guò)程出現(xiàn)紊亂，影響內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，成為誘發(fā)疲勞的重要原因［22］。運(yùn)動(dòng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的代謝參與到提供能量中，BUN 作為蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，反映了機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的情況，因此BUN 水平的變化可以作為評(píng)估機(jī)體承受負(fù)荷耐力的重要指標(biāo)［23］。本研究中，與對(duì)照組比較，中和高劑量GARP 組小鼠血清中BLA 和BUN 水平明顯降低，表明GARP 能使機(jī)體承受負(fù)荷的耐力有所增加。

氧化應(yīng)激也是造成疲勞的重要因素。當(dāng)劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，自由基產(chǎn)生并積累，導(dǎo)致生物膜機(jī)能被破壞，線粒體受到自由基攻擊，ATP 供給減少，肌肉工作能力減弱，從而產(chǎn)生疲勞［24］。GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的三肽，能消除人體自由基，是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化水平的重要標(biāo)志物［25］；SOD 是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過(guò)氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用［26］；GSH 和SOD 作為機(jī)體重要抗氧化物和抗氧化酶，對(duì)自由基的清除有重要意義。本研究結(jié)果表明：GARP 能促進(jìn)小鼠肝臟和C2C12 細(xì)胞中GSH的產(chǎn)生并提高SOD 活性，使機(jī)體清除自由基的能力增強(qiáng)，顯示出較強(qiáng)的抗氧化功效來(lái)對(duì)抗疲勞的產(chǎn)生。

葡萄糖是機(jī)體的直接能源物質(zhì)，可經(jīng)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP 為機(jī)體供能；糖原是機(jī)體的儲(chǔ)備能源，可在血糖降低條件下分解成葡萄糖來(lái)維持細(xì)胞的能量供給［27］；葡萄糖充足的條件下還能轉(zhuǎn)換為糖原儲(chǔ)存起來(lái)［28］。因此，葡萄糖攝取能力和糖原儲(chǔ)備量是評(píng)價(jià)骨骼肌耐力的重要指標(biāo)［29］。本研究結(jié)果顯示：GARP 能使小鼠肝糖原和肌糖原水平明顯提高，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也顯示GARP 能提高C2C12 細(xì)胞的糖攝取能力并增加糖原水平。GLUT4 是細(xì)胞膜上的一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)能力呈正相關(guān)關(guān)系［30］；AMPM 作為調(diào)控GLUT4 的重要蛋白，在糖代謝過(guò)程中起重要作用［31］。本研究結(jié)果顯示：GARP 對(duì)AMPK 的磷酸化和GLUT4蛋白表達(dá)均有促進(jìn)作用，能夠通過(guò)激活A(yù)MPK/GLUT4 通路來(lái)調(diào)控糖代謝。

綜上所述，采用組織培養(yǎng)等技術(shù)獲得的GARP可以延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間，降低小鼠血清中BLA和BUN 水平，提高小鼠抗氧化能力并促進(jìn)糖原積累，具有抗疲勞作用，其機(jī)制可能是通過(guò)激活A(yù)MPK/GLUT4 通路、 促進(jìn)糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)并增強(qiáng)糖原儲(chǔ)備實(shí)現(xiàn)的。由于GARP 與野山參的基因具有高度相似性且生長(zhǎng)周期短，可廣泛應(yīng)用于抗疲勞藥品及保健品的開(kāi)發(fā)。