崔磊華, 侯玉帛, 蘇 暢, 李明賀, 聶 鑫

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，浙江 溫州 325000；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

牙周炎是以牙周結(jié)締組織破壞和牙槽骨吸收為特點(diǎn)的慢性炎癥性疾病，是成人失牙的主要原因之一［1］。研究［2］顯示： 吸煙是牙周炎的高危因素，戒煙可降低其發(fā)病率，緩解牙周組織損傷。尼古丁是煙草中主要的成癮性成分，隨著尼古丁替代療法在戒煙治療中的廣泛應(yīng)用，尼古丁對(duì)人類健康的影響受到越來(lái)越多的關(guān)注［3］。研究［4］顯示：尼古丁可破壞機(jī)體骨代謝平衡，已成為骨折愈合、骨質(zhì)疏松、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等骨代謝相關(guān)疾病的危險(xiǎn)因素。研究［5-6］證實(shí)：尼古丁可協(xié)同牙周局部炎癥反應(yīng)加劇牙周骨組織破壞。然而部分吸煙患者牙周組織表現(xiàn)為輕微炎癥反應(yīng)卻伴隨重度牙槽骨吸收，因此探討尼古丁對(duì)骨穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制，對(duì)維護(hù)吸煙者牙周健康具有重要意義。

研究［7-8］顯示：慢性牙周炎患者牙周骨組織破壞程度與局部氧化應(yīng)激反應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系，而煙草燃燒過程中生成的過量活性氧簇可直接攻擊牙周組織細(xì)胞，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。線粒體通過氧化呼吸鏈的電子漏還原氧分子形成線粒體來(lái)源活性氧簇（mitochondria-derived reactive oxygen species，mitoROS），是機(jī)體ROS 的主要來(lái)源，同時(shí)也是ROS 主要攻擊的靶點(diǎn)，兩者導(dǎo)致的惡性循環(huán)進(jìn)一步加劇組織的損傷［9］。研究［10-11］顯示：心肌細(xì)胞和海馬神經(jīng)元細(xì)胞等在尼古丁刺激下，細(xì)胞中線粒體受損，產(chǎn)生大量mitoROS，引發(fā)線粒體功能障礙，激活線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷。研究［12］證實(shí)：線粒體氧化應(yīng)激及功能障礙在氯化鈷誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，應(yīng)用ROS 清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC） 可緩解上述細(xì)胞損傷，但目前尚無(wú)關(guān)于線粒體氧化應(yīng)激在尼古丁誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中作用的相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)觀察ROS 清除劑NAC 對(duì)尼古丁誘導(dǎo)MC3T3-E1 細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為吸煙相關(guān)牙周炎患者的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1 細(xì)胞（美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)）。胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司），高糖培養(yǎng)基、 0.25% 胰酶和青/鏈霉素（美國(guó)Hyclone 公司），噻唑藍(lán)（MTT）和NAC （美國(guó)Sigma 公司），Annexin Ⅴ-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD 公司），蛋白裂解液和BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），B 細(xì)胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、 Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax） 和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin） 抗體（美國(guó)CST 公司），MitoSOX Red 熒光測(cè)定試劑盒、山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗（美國(guó)Invitrogen 公司）。凝膠成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司），低溫高速離心機(jī)和流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司）。

1.2 MC3T3-E1 細(xì)胞的培養(yǎng)將復(fù)蘇的MC3T3-E1 細(xì)胞置于含10% 胎牛血清和1% 雙抗（青/鏈霉素） 的α-MEM 培養(yǎng)基中，并在5% CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 傳代1 次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT 法檢測(cè)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖活性將MC3T3-E1 細(xì)胞以5×104mL－1密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板24 h 后，用不同濃度（0、 1.0、 2.5、5.0 和7.5 mmol·L－1） 尼古丁處理細(xì)胞24 h，棄上清，每孔加入100 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基和20 μL MTT工作液，置于5% CO2、37 ℃和飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（A） 值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞增殖活性=（實(shí)驗(yàn)孔A 值－空白孔A 值） /（對(duì)照孔A 值－空白孔A 值） ×100%。計(jì)算尼古丁半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50） 值。進(jìn)一步依據(jù)尼古丁的IC50 值，將MC3T3-E1 細(xì)胞分為對(duì)照組、 尼古?。?4.25 mmol·L－1） 組和尼古?。?.25 mmol·L－1） +不同濃度NAC （2.5、 5.0 和7.5 mmol·L－1） 組，處理細(xì)胞24 h 后，檢測(cè)各組細(xì)胞A 值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖活性，確定NAC 最適作用濃度應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 MitoSOX 熒光染色法檢測(cè)各組細(xì)胞中mitoROS 水平將MC3T3-E1 細(xì)胞以5×104mL－1密度接種于48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為對(duì)照組、尼古?。?.25 mmol·L－1） 組、 NAC （5.0 mmol·L－1）組和尼古?。?.25 mmol·L－1） +NAC（5.0 mmol·L－1） 組，每組3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞1 次后，加入終濃度100 nmol·L－1MitoSOX，37 ℃避光孵育15 min，PBS 緩沖液洗滌后利用熒光顯微鏡觀察并拍照，采用Image J 軟件計(jì)算各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，以各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度代表mitoROS 水平。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率將MC3T3-E1 細(xì)胞以5×104mL－1密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞分組同“ 1.4”，每組3 個(gè)復(fù)孔，24 h 后，用不含EDTA 胰酶消化收集各組細(xì)胞，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞2 次，離心后加入含AnnexinⅤ-FITC和PI 染液的Binding buffer 緩沖液混懸細(xì)胞，避光孵育10 min，上機(jī)檢測(cè)，并計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)） ×100%。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平將MC3T3-E1 細(xì)胞以5×104mL－1密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞分組同“1.4”，每組3 個(gè)復(fù)孔，24 h 后收集各組細(xì)胞，采用蛋白裂解液裂解提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)后，煮沸變性。經(jīng)過10% SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、 5% 脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1 h，1×TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜?；厥找豢?，1×TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入二抗室溫孵育1 h，用ECL檢測(cè)液發(fā)光顯影定影后，采用凝膠成像儀對(duì)各組MC3T3-E1 細(xì)胞中目的蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。目的蛋白表達(dá)水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示，同時(shí)計(jì)算Bax/Bcl-2 比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞中mitoROS 水平、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Bax/Bcl-2 比值均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性與0 mmol·L－1尼古丁組比較，1.0、 2.5、 5.0 和7.5 mmol·L－1尼古丁組MC3T3-E1 細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），并呈濃度依賴性，尼古丁的IC50值為（4.25±0.03） mmol·L－1。與對(duì)照組比較，尼古丁組細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05）；與尼古丁組比較，尼古丁+2.5、5.0 和7.5 mmol·L－1NAC組MC3T3-E1 細(xì)胞增殖活性明顯升高（P＜0.05），以尼古丁+5.0 mmol·L－1NAC 組細(xì)胞增殖活性升高最為明顯。故采用4.25 mmol·L－1尼古丁和5.0 mmol·L－1NAC 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 不同濃度尼古丁(A) 和NAC（B）處理后各組細(xì)胞增殖活性Fig.1 Proliferation activities of MC3T3-E1 cells after treated with different concentrations of nicotine(A) and NAC（B）

2.2 各組細(xì)胞中mitoROS 水平與對(duì)照組比較，尼古丁組細(xì)胞中mitoROS 水平明顯升高（P＜0.05）；與尼古丁組比較，NAC 組和尼古丁+NAC組細(xì)胞中mitoROS 水平明顯降低（P＜0.05）。見圖2 和3。

圖2 各組MC3T3-E1 細(xì)胞MitoSOX 熒光染色情況（×200）Fig.2 MitoSOX fluorescence staining of MC3T3-E1 cells in various groups(×200)

圖3 各組細(xì)胞中mitoROS 水平Fig.3 MitoROS levels in cells in various groups

2.3 各組細(xì)胞凋亡率對(duì)照組、尼古丁組、NAC組和尼古丁+NAC 組細(xì)胞凋亡率分別為（2.10±0.01） % 、（10.60±0.66） % 、（2.85±0.24） %和（6.90±0.48） %。與對(duì)照組比較，尼古丁組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與尼古丁組比較，NAC 組和尼古丁+NAC 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），但尼古丁+NAC 組細(xì)胞凋亡率仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.4 各組細(xì)胞中Bax/Bcl-2 比值與對(duì)照組（1.293+0.035） 比較，尼古丁組細(xì)胞中Bax/Bcl-2比值（1.544+0.123） 升高（P＜0.05）； 與尼古丁組比較，尼古丁+NAC 組細(xì)胞中Bax/Bcl-2 比值（1.19+0.03） 降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in cells in various groups

3 討 論

目前我國(guó)總吸煙人數(shù)已超過3.12 億，流行病學(xué)研究［13-16］顯示：吸煙人群牙周炎患病率是非吸煙人群的4 倍，并伴牙周組織破壞加重和治療效果和預(yù)后差等特點(diǎn)。研究［17-18］證實(shí)：尼古丁作為煙草中主要的毒性成分，可通過沉積在牙齒和牙槽骨表面，直接促進(jìn)牙槽骨吸收；間接進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，通過增加氧化應(yīng)激反應(yīng)、 激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 信號(hào)通路、升高NF- κB 受體配體激活因子（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG） 水平及釋放大量炎癥介質(zhì)等破壞機(jī)體骨組織穩(wěn)態(tài)。其次，研究［19］顯示：電子煙（也稱尼古丁傳送系統(tǒng)） 作為新型煙草制品其尼古丁含量高達(dá)320.5 mmol·L－1，其使用率在全世界呈流行趨勢(shì)，在青少年人群中的增長(zhǎng)尤為明顯，極大危害青少年的牙周及全身健康，因此研究尼古丁在調(diào)控機(jī)體骨穩(wěn)態(tài)中的作用具有重要意義。

研究［20］證實(shí)：在吸煙者唾液和血液中尼古丁濃度分別可高達(dá)9.6 和1.2 mmol·L－1，而0～10 mmol·L－1尼古丁可呈濃度依賴性誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞凋亡，抑制成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，釋放炎癥介質(zhì)，破壞骨代謝平衡，參與牙周組織骨破壞。牙周膜細(xì)胞是具有成纖維及成骨分化等多項(xiàng)潛能的細(xì)胞群，在維持牙周軟、硬組織骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示：尼古丁可呈濃度依賴性抑制前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1 細(xì)胞） 增殖活性，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

牙周炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，成骨細(xì)胞凋亡水平與牙周炎骨破壞有密切關(guān)聯(lián)，而線粒體氧化應(yīng)激與細(xì)胞內(nèi)各種凋亡信號(hào)密切相關(guān)［21-22］。研究［23］表明：尼古丁可呈濃度依賴性激活細(xì)胞中ROS，促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞凋亡，抑制牙齦組織自我修復(fù)能力；尼古丁可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)H2O2生成，增加促凋亡蛋白甲基乙二醛水平，促進(jìn)人成骨細(xì)胞凋亡，參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展［24］；3 mmol·L－1以上尼古丁可引起大鼠牙齦成纖維細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹和空泡化［25］。為研究線粒體氧化應(yīng)激在尼古丁誘發(fā)成骨細(xì)胞凋亡中的作用，本研究采用MitoSOX 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞中mitoROS 水平，結(jié)果表明：4.25 mmol·L－1尼古丁可明顯增加MC3T3-E1 細(xì)胞中mitoROS 水平。NAC 是一種含巰基的還原劑，可通過促進(jìn)細(xì)胞中谷胱甘肽的合成，清除ROS，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激保護(hù)細(xì)胞的作用［26］。本研究進(jìn)一步應(yīng)用NAC 處理MC3T3-E1 細(xì)胞，結(jié)果顯示：NAC 不僅可緩解尼古丁誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制作用，還可明顯降低尼古丁誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞中mitoROS 水平、細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的升高。研究［9］顯示：線粒體氧化應(yīng)激水平的增高往往伴隨線粒體功能障礙如線粒體腫脹、膜電位下降、ATP 衰竭和呼吸鏈?zhǔn)軗p，導(dǎo)致細(xì)胞色素C和內(nèi)外膜間促凋亡因子的釋放，進(jìn)而激活線粒體途徑細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明：線粒體氧化應(yīng)激參與尼古丁誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞凋亡過程，NAC可逆轉(zhuǎn)上述損傷，然而線粒體功能障礙是否參與尼古丁介導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究從線粒體分子生物學(xué)層面闡釋了尼古丁在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的作用，并探討了其可能的分子生物學(xué)機(jī)制，為吸煙相關(guān)牙周炎防治提供了新的靶點(diǎn)和思路。