耿媛媛，張賢明，聶煜東,2,3，姜 巖，楊哲涵，李 金，顏海燕，申 粵

(1.重慶工商大學(xué) 廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067； 2.中國科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085； 3.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054)

國際局勢的復(fù)雜多變對能源供給安全造成了潛在威脅，這推動(dòng)了我國對能源多元化的需求，生物質(zhì)能源作為能源多元化的重要一環(huán)備受期待。生物柴油是一種常見生物質(zhì)能源，主要由生物油脂轉(zhuǎn)化而來，而產(chǎn)油微藻具有易培養(yǎng)、生長快、耐受性強(qiáng)、富含油脂等優(yōu)勢，被認(rèn)為是生物柴油生產(chǎn)原料的理想來源[1-2]。藻細(xì)胞在高光照強(qiáng)度、高鹽、營養(yǎng)缺乏等不利環(huán)境下會(huì)以積累油脂的方式儲(chǔ)存大量能量[3]，其中缺氮脅迫被認(rèn)為是增加細(xì)胞含油率最有效的方法之一[4]。然而，在氮缺乏的條件下微藻生物量也會(huì)降低，從而影響了微藻油脂的產(chǎn)量[5]。因此，有必要尋找一種既能夠提高微藻細(xì)胞含油率又能維持甚至增加微藻生物量的方法。

生長素是植物在生長代謝過程中產(chǎn)生的一類小分子物質(zhì)，在細(xì)胞分裂、生長及分化等方面調(diào)控植物生長發(fā)育，因此在植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)中被廣泛應(yīng)用[6]。近年來，生長素已被證實(shí)對微藻的生長和代謝產(chǎn)物合成有明顯的刺激作用。楊凱等[7]研究表明，吲哚乙酸(IAA)對杜氏鹽藻生長和脂肪酸合成具有促進(jìn)作用；Liu等[8]研究表明，生長素萘乙酸(NAA)對普通小球藻生長和油脂合成具有明顯的促進(jìn)作用，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)也具有同樣的效果[9]。因此，通過生長素的調(diào)節(jié)補(bǔ)償缺氮導(dǎo)致的生物量下降具有一定可行性。

當(dāng)前，在常規(guī)培養(yǎng)條件下添加生長素以提高微藻油脂產(chǎn)量已成為研究熱點(diǎn)之一，但在完全缺氮條件下生長素對微藻生物量和油脂積累的影響研究仍有待完善。本研究以普通小球藻為研究對象，在缺氮條件下添加不同種類的天然生長素IAA、人工合成生長素NAA和2,4-D，研究3種生長素對微藻生長、油脂積累以及油脂脂肪酸組成的影響，進(jìn)而確定普通小球藻產(chǎn)油最適生長素及環(huán)境條件，為藻源生物柴油規(guī)?；瘧?yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藻種與培養(yǎng)基

普通小球藻(Chlorellavulgaris)，中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫；正常培養(yǎng)基(BG11)；完全缺氮培養(yǎng)基(ND，BG11中以等量NaCl代替NaNO3)。

1.1.2 主要試劑

吲哚乙酸(IAA)；萘乙酸(NAA)；2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；氯仿、甲醇、氫氧化鉀、二甲基亞砜(DMSO)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；尼羅紅染料，阿拉丁試劑公司；37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，Anpel公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MGC-450BP恒溫光照培養(yǎng)箱，DR6000紫外可見光分光光度計(jì)，SQP電子天平，F(xiàn)iveEasy Plus pH計(jì)，LDZX-30KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋，血球計(jì)數(shù)板，BX51熒光顯微鏡，F(xiàn)-7100熒光分光光度計(jì)，SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機(jī)，TD-24K離心機(jī)，DK-S24電熱恒溫水浴鍋，DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱，TOC-LCPH總有機(jī)碳分析儀，GC1960氣相色譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)

采用BG11培養(yǎng)基對普通小球藻進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度(25±1)℃、光照強(qiáng)度4 500 lx、光照周期光暗比為12 h/12 h。待微藻生長至對數(shù)生長末期，以6 000 r/min離心10 min，將藻細(xì)胞重懸于完全缺氮培養(yǎng)基。500 mL培養(yǎng)液以1×106mL-1的細(xì)胞接種密度分裝于1 000 mL的無菌三角燒瓶中，加入3種生長素，調(diào)整其終質(zhì)量濃度梯度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L，每一質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行，常溫培養(yǎng)14 d。所有培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件與種子液培養(yǎng)條件一致，以不添加生長素的完全缺氮培養(yǎng)基(ND)和正常培養(yǎng)基(BG11)作為對照組。

1.2.2 藻細(xì)胞密度及生物量測定

采用血球計(jì)數(shù)板方法對普通小球藻生長過程藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以此作為藻細(xì)胞密度；采用烘干稱重法對小球藻生物量進(jìn)行測定，具體為：每隔2 d取一定體積的藻液(V)經(jīng)0.45 μm濾膜(烘干濾膜質(zhì)量m1)抽濾，洗滌，于60℃烘干至恒重，冷卻后稱重(干藻與濾膜質(zhì)量m2)。生物量(DCW)按式(1)計(jì)算。

DCW=(m2-m1)/V

(1)

1.2.3 總脂含量及甘油三酯含量的測定

采用Bligh-Dyer法[10]測定總脂含量。取25 mg凍干藻粉(質(zhì)量記為m)于10 mL離心管中，加入4 mL氯仿-甲醇溶液(體積比2∶1)，旋渦混勻2 min后超聲(40 kHz,200 W)處理20 min，離心，收集有機(jī)相，重復(fù)提取3次，合并有機(jī)相至預(yù)烘干稱重的稱量瓶(m1)中，待有機(jī)溶劑完全揮發(fā)后，于60℃烘箱中烘干至恒重(m2)，得到小球藻總脂。藻細(xì)胞總脂含量(Y1)按式(2)計(jì)算，總脂產(chǎn)量(Y2)按式(3)計(jì)算。

Y1=(m2-m1)/m×100%

(2)

Y2=DCW×Y1

(3)

采用尼羅紅染色-熒光分光光度計(jì)法[11]對藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯進(jìn)行測定，以三油酸甘油酯為標(biāo)準(zhǔn)品，采用外標(biāo)法得到細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量(Y3)與相對熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見式(4)。甘油三酯產(chǎn)量(Y4)按式(5)計(jì)算，其他脂質(zhì)含量(Y5)按式(6)計(jì)算。

Y3=0.118 6×A482+0.008 2(R2=0.995 4)

(4)

Y4=Y3×DCW

(5)

Y5=Y1-Y3

(6)

1.2.4 脂肪酸組成測定

脂肪酸甲酯化：取1.2.3獲得的小球藻總脂，加入2 mL 4%氫氧化鉀-甲醇溶液，于40℃水浴60 min,然后加入1 mL正己烷萃取，待混合溶液靜置分層后，取200 μL上清液至氣相色譜專用玻璃瓶中密封。采用氣相色譜分析樣品的脂肪酸組成。

氣相色譜條件：DB-FAST毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 cm)；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，以40℃/min升溫到165℃，保持1 min，再以4℃/min升溫到230℃，保持10 min；載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測器溫度260℃；進(jìn)樣量1 μL。

通過比較樣品中未知色譜峰與37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間對樣品中脂肪酸進(jìn)行定性，采用面積歸一化法定量。

1.2.5 總氮含量測定

參照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[12]檢測微藻培養(yǎng)后培養(yǎng)基中的總氮(TN)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺氮脅迫下生長素對微藻生長的影響

在缺氮條件下分別添加0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L的IAA、NAA和2,4-D，考察其對普通小球藻生長的影響，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，所有缺氮組中普通小球藻在培養(yǎng)前期生長均呈快速上升趨勢，后期生物量和細(xì)胞密度均略微下降，而BG11組普通小球藻生物量和細(xì)胞密度前期雖增長速率慢于部分缺氮組，但培養(yǎng)12 d內(nèi)均保持上升趨勢。1.0 mg/L IAA組培養(yǎng)8 d獲得最大細(xì)胞密度，為2.94×106mL-1，培養(yǎng)6 d獲得最大生物量，為158 mg/L。2.5 mg/L NAA組培養(yǎng)6 d獲得最大細(xì)胞密度和生物量，分別為2.85×106mL-1和159 mg/L。1.0 mg/L 2,4-D組培養(yǎng)6 d獲得最大細(xì)胞密度，為3.05×106mL-1，培養(yǎng)8 d獲得最大生物量，為164 mg/L。2,4-D對普通小球藻生長促進(jìn)效果略優(yōu)于其他兩類生長素。與各實(shí)驗(yàn)組相比，ND組由于缺乏外界刺激誘導(dǎo)，培養(yǎng)4 d時(shí)胞內(nèi)氮源耗盡，生長陷入停滯。綜上，生長素最佳添加量分別為IAA 1.0 mg/L，NAA 2.5 mg/L，2,4-D 1.0 mg/L。

分別在1.0 mg/L IAA、2.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 2,4-D 3種生長素作用下，最大細(xì)胞密度相對于ND組(最大細(xì)胞密度1.98×106mL-1)提升至1.48、1.44、1.54倍，而最大生物量相對于ND組(最大生物量124 mg/L)分別提升至1.27、1.28、1.32倍，與整個(gè)培養(yǎng)周期前8 d BG11組相比，生物量無顯著性差異，這說明在缺氮條件下，生長素更多的是促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖，細(xì)胞個(gè)體的生長由于氮素的缺乏而受到了一定抑制，同時(shí)生長素有效抵消了缺氮脅迫對生物量的負(fù)面影響。

圖2為BG11、ND與最佳外源生長素添加量下ND中總氮含量的變化。

由圖2可知：缺氮條件下細(xì)胞初始破裂情況較為嚴(yán)重，大量胞內(nèi)氮素溢出，后隨細(xì)胞的生長又逐漸被吸收；NAA組由于添加量較高，也對藻細(xì)胞有一定脅迫作用，而在低添加量的IAA和2,4-D刺激下，缺氮藻細(xì)胞迅速地適應(yīng)環(huán)境，因此由于細(xì)胞破裂而釋放的氮素較少。實(shí)際上，生長素是藻細(xì)胞的一種化學(xué)信號(hào)分子，其通過調(diào)節(jié)有絲分裂中涉及的信號(hào)通路來刺激細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞生長[13-14]。此外，圖1結(jié)果表明高濃度生長素對普通小球藻細(xì)胞生長促進(jìn)作用明顯低于低濃度生長素，該現(xiàn)象與生長素對高等植物的影響一致，即低濃度促進(jìn)，高濃度抑制?？偠灾诘拗茥l件下添加生長素能有效地促進(jìn)普通小球藻細(xì)胞的增殖，一定程度上抵消缺氮對小球藻生長的負(fù)面影響；這同時(shí)表明生長素能夠誘導(dǎo)普通小球藻細(xì)胞通過對細(xì)胞內(nèi)源性氮的利用來維持其生長。

圖2 BG11、ND與最佳生長素添加量下ND中總氮含量變化趨勢

2.2 缺氮脅迫下生長素對微藻油脂合成的影響(見圖3)

由圖3可知，在缺氮條件下添加生長素IAA、NAA、2,4-D整體上均可以顯著提高微藻總脂含量，生長素IAA、NAA和2,4-D添加量分別為1.0、2.5、1.0 mg/L時(shí)，對微藻油脂合成的促進(jìn)效果最好，最大總脂含量分別為38.85%、37.00%和39.16%，而ND組最大總脂含量為30.95%。相對于BG11組最大總脂含量22.55%而言，ND組和IAA(1.0 mg/L)、NAA(2.5 mg/L)、2,4-D(1.0 mg/L)組最大總脂含量分別是BG11組的1.37、1.72、1.64、1.74倍。1.0 mg/L IAA、2.5 mg/L NAA和1.0 mg/L 2,4-D組微藻最大總脂產(chǎn)量分別為61.38、58.83、64.22 mg/L，是BG11組最大總脂產(chǎn)量(41.27 mg/L)的1.49、1.43、1.56倍，而ND組最大總脂產(chǎn)量為38.38 mg/L ，較BG11組的低，這是由于缺氮條件下微藻生長受到極大限制，導(dǎo)致其雖然單個(gè)細(xì)胞總脂含量高，但總脂產(chǎn)量低。因此，在產(chǎn)油微藻缺氮培養(yǎng)時(shí)添加生長素刺激微藻的生長是十分必要的。

微藻油脂主要以結(jié)構(gòu)脂如磷脂、糖脂以及儲(chǔ)存脂如甘油三酯的形式存在，其中甘油三酯可以通過酯交換反應(yīng)制備性能良好的生物柴油[15]。因此，油脂的成分對于生物柴油的品質(zhì)至關(guān)重要。不同培養(yǎng)條件下普通小球藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量、其他脂質(zhì)含量、甘油三酯產(chǎn)量與總脂產(chǎn)量如圖4所示。

圖4 不同生長素對普通小球藻甘油三酯含量、其他脂質(zhì)含量、甘油三酯產(chǎn)量與總脂產(chǎn)量的影響

由圖4可知，氮限制培養(yǎng)條件下甘油三酯含量相對于正常培養(yǎng)有顯著提升，其中1.0 mg/L IAA、2.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 2,4-D組分別獲得最大甘油三酯含量，相對于ND組的最大甘油三酯含量19.88%而言，分別提高至27.97%、25.66%、33.21%，且分別是BG11組最大甘油三酯含量(12.31%)的2.27、2.08、2.70倍。說明生長素促進(jìn)了微藻油脂的合成。由于生物量、總脂含量、甘油三酯含量隨生長素添加量的變化趨勢幾乎一致，因此生長素在添加量IAA 1.0 mg/L、NAA 2.5 mg/L、2,4-D 1.0 mg/L時(shí)獲得最大甘油三酯產(chǎn)量，分別為44.19、40.80、54.46 mg/L。

實(shí)驗(yàn)表明，生長素在合適的添加量下可同步促進(jìn)微藻生長和油脂合成。生長素進(jìn)入細(xì)胞后首先會(huì)與受體相結(jié)合，而后通過復(fù)雜的生理生化反應(yīng)誘導(dǎo)特定基因加速表達(dá)，從而改變藻細(xì)胞的相關(guān)代謝[9]。生長素同步提高藻細(xì)胞生物量及總脂含量的原因可能是由于生長素可以提高微藻光合作用過程中的固碳關(guān)鍵酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶和油脂合成關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶的活性，進(jìn)而增強(qiáng)微藻光合作用，促進(jìn)微藻生長和油脂積累[14]。還有證據(jù)表明其他油脂合成相關(guān)酶的表達(dá)也受到了生長素的影響，如綠藻屬NC-M5中添加IAA和細(xì)胞分裂素促進(jìn)了甘油三酯合成的關(guān)鍵酶甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶和甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)[16]。此外，由于生長素在氮脅迫條件下能誘導(dǎo)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化酶的活性表達(dá)，猝滅了氮脅迫下產(chǎn)生的過多活性氧，從而減輕了缺氮造成的細(xì)胞氧化損傷[17]，這也減緩了部分氮限制造成的生長抑制。

2.3 生長素對普通小球藻油脂脂肪酸組成的影響

脂肪酸是組成微藻油脂的關(guān)鍵成分，其碳鏈長度、飽和度等與生物柴油的品質(zhì)直接相關(guān)，因此本研究進(jìn)一步對普通小球藻油脂的脂肪酸組成進(jìn)行了分析，結(jié)果如表1所示。

表1 不同培養(yǎng)條件下普通小球藻油脂脂肪酸組成及含量

由表1可知，在BG11培養(yǎng)條件下C16～C20為代表的柴油優(yōu)質(zhì)成分僅占總脂肪酸的54.59%，在氮限制培養(yǎng)條件下提高到64.23%，而添加生長素IAA、NAA、2,4-D后進(jìn)一步增加到71.99%、73.75%、84.81%。這可能是由于生長素誘導(dǎo)甘油三酯的前體物單半乳糖二?；视桶l(fā)生水解，進(jìn)而提高了C16和C18脂肪酸含量[18]。因此，生長素不僅促進(jìn)了微藻總脂含量，而且還促進(jìn)了生物柴油優(yōu)質(zhì)成分來源C16、C18脂肪酸的含量，且其中2,4-D的作用效果最佳。

3 結(jié) 論

以最常見的產(chǎn)油微藻普通小球藻為模板藻種，研究在氮限制條件下通過添加IAA、NAA、2,4-D 3種生長素對普通小球藻生長和油脂積累的影響。結(jié)果表明：3種生長素的最佳添加量分別為IAA 1.0 mg/L、NAA 2.5 mg/L、2,4-D 1.0 mg/L；在IAA、NAA、2,4-D最佳添加量下，小球藻最高生物量分別為158、159、164 mg/L，是單一缺氮培養(yǎng)(ND)下生物量的1.27、1.28、1.32倍，與整個(gè)培養(yǎng)周期前8 d正常培養(yǎng)(BG11)下的微藻生物量相比無顯著性差異，生長素有效抵消了缺氮脅迫對生物量的負(fù)影響。在IAA、NAA、2,4-D最佳添加量與ND培養(yǎng)條件下，普通小球藻最大總脂含量分別是BG11培養(yǎng)條件下的1.72、1.64、1.74、1.37倍；最大總脂產(chǎn)量分別是BG11組的1.49、1.43、1.56、0.93倍，胞內(nèi)最大甘油三酯含量分別為27.97%、25.66%、33.21%、19.88%，最大甘油三酯產(chǎn)量分別為44.19、40.80、54.46、24.65 mg/L，C16～C20脂肪酸成分分別占總脂肪酸的71.99%、73.75%、84.81%、64.23%。3種生長素的作用效果依次是2,4-D、IAA、NAA。