金玉琴 張 遠(yuǎn) 呂浩東 李貴鳳 季 駿

目前關(guān)于力學(xué)刺激對牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLFs）的生物學(xué)反應(yīng)的研究多數(shù)局限于體外研究[1，2]，而關(guān)于體內(nèi)正畸牙移動過程中PDLFs對正畸力的生物學(xué)反應(yīng)及相關(guān)的力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究報(bào)道較少，有待深入探索。近年來，隨著細(xì)胞生物力學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們開始關(guān)注機(jī)械力刺激對PDLFs生物學(xué)行為的影響，包括細(xì)胞增殖和分化，細(xì)胞因子的表達(dá)等，并取得了較多進(jìn)展[3]。其中，血小板衍生生長因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）是多功能生長因子，它對成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、干細(xì)胞等具有促增殖和趨化性，在體內(nèi)創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4，5]。PDGF-BB也可以刺激骨祖細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等成骨分化，從而促進(jìn)骨再生。目前已經(jīng)知道PDGF-BB主要通過結(jié)合其受體PDGFRα或β來激活下游信號通路，從而發(fā)揮促細(xì)胞增殖、成骨分化等重要的生物學(xué)功能[6]。PDGF-BB/PDGFRs是成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子。而PDGFRβ在成纖維細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但是在正畸牙移動過程中，在正畸應(yīng)力刺激下牙周膜中成纖維細(xì)胞是否對PDGF-BB有反應(yīng)以及PDGFRβ表達(dá)是否上調(diào)，有待深入研究。

為此，本課題首先構(gòu)建大鼠上頜正畸牙移動模型，檢測在正畸應(yīng)力刺激下張應(yīng)力側(cè)新骨形成情況，并研究在牙周膜中PDGF-BB、PDGFRβ表達(dá)水平是否發(fā)生變化，以期為促進(jìn)骨改建、加速臨床正畸治療提供新的思路。

資料和方法

1.主要材料

鎳鈦螺旋拉簧（3M Unitek Monrovia，美國），正畸結(jié)扎絲（杭州奧杰醫(yī)療器械有限公司，中國），鹽酸四環(huán)素、茜素紅（Sigma，美國），BSA（Servicebio，中國）、α-SMA抗體、PDGF-BB、PDGFR-β（Abacam，美國）、DAB顯色試劑盒（DAKO，丹麥）。

2.動物實(shí)驗(yàn)分組

本部分實(shí)驗(yàn)共32只雄性SD大鼠，所有大鼠左側(cè)構(gòu)建正畸牙移動模型，右側(cè)不加力，設(shè)為對照。其中，隨機(jī)選取16只大鼠于術(shù)后7天、14天進(jìn)行序列熒光標(biāo)記，術(shù)后28天時(shí)處死取材觀察新骨沉積情況，實(shí)驗(yàn)分組為2組，分別為張應(yīng)力組（Tension）、壓應(yīng)力組（Pressure）；另外16只大鼠，分別于術(shù)后7天（n＝8）、14天（n＝8）處死取材進(jìn)行免疫組化染色或者免疫熒光雙染，實(shí)驗(yàn)分組為：不加力組（control組）、加力7天組（day7）、加力14天組（day14）。所有動物實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)文號為2019NL-009（KS）。所有涉及大鼠的實(shí)驗(yàn)都是按照相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行[7]。

3.大鼠正畸牙移動實(shí)驗(yàn)

首先建立標(biāo)準(zhǔn)的大鼠正畸牙移動模型[8]。手術(shù)在SPF級動物房中操作，首先75%酒精消毒腹部，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。待麻醉后，將大鼠仰臥位固定，在大鼠上頜兩個(gè)中切牙的近、遠(yuǎn)中頸緣處磨出深約0.15～0.25 mm的槽溝以防結(jié)扎絲的滑脫，增加其固位。然后左側(cè)用0.20 mm正畸不銹鋼結(jié)扎絲穿過第一、二磨牙鄰接點(diǎn)下方，將結(jié)扎絲包繞第一磨牙牙頸部結(jié)扎固定，并于鎳鈦拉簧的一端連接固定，使拉簧固定于左側(cè)上頜第一磨牙與上頜切牙之間，力值為50 g左右。上頜右側(cè)第一磨牙不加力，設(shè)為對照側(cè)（圖1）。

圖1 大鼠正畸牙移動模型的建立

4.序列熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取16只大鼠，于正畸牙移動術(shù)后7天、14天，分別按照25 mg/kg、30 mg/kg的劑量腹腔注射鹽酸四環(huán)素（Tetracycline，TE）、茜素紅（Alizarin，AL）等鈣離子螯合劑以對牙周張應(yīng)力側(cè)新骨進(jìn)行標(biāo)記，檢測新骨形成和礦化的速率[9]。

5.組織學(xué)檢測

術(shù)后28天，處死上述16只大鼠，獲取大鼠上頜骨，固定于10%福爾馬林。標(biāo)本梯度脫水，純二甲苯透明，包埋至固化，用Lecia-SP硬組織切片機(jī)將硬化的標(biāo)本沿橫斷面（n＝8）或矢狀面（n＝8）連續(xù)切片，切片厚度約為150μm，手工磨片、拋光至30～40 μm。將上述沿橫斷面切的切片置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察序列標(biāo)記的綠色、紅色熒光標(biāo)記情況。兩種熒光的激發(fā)/發(fā)射波長分別為405/580 nm（TE，綠）、543/617 nm（AL，紅色）。并采用圖像分析軟件Image Pro Plus根據(jù)切片上熒光條帶之間的距離計(jì)算骨礦化沉積速度（mineral apposition rate，MAR，um/day）[9]。

6.免疫組織化學(xué)染色

剩余的16只大鼠分別于術(shù)后7天（n＝8）、14天（n＝8）處死，獲取上頜骨，福爾馬林固定24小時(shí)，然后放入10%EDTA中4℃下進(jìn)行脫鈣6周左右，直至針尖可以輕易穿透牙齒。標(biāo)本梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，用切片機(jī)沿磨牙長軸方向（矢狀向）進(jìn)行切片，制備4μm的連續(xù)石蠟切片，然后將切片置于60℃烤箱中烤片2小時(shí)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)備用。

將石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇下行水化，抗原修復(fù)，用3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，油性筆圈定區(qū)域后分別滴加抗α-SMA（1:200）、PDGF-BB（1:100）及PDGFR-β（1:100）一抗，置于濕盒中4℃孵育過夜。次日復(fù)溫后PBS沖洗3次，加二抗37℃孵育30分鐘，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明膠，中性樹膠封片，3D數(shù)字切片掃描儀掃描片子，用Case Viewer 2.3軟件打開片子進(jìn)行觀察并拍照記錄。最后的免疫組化評分是用強(qiáng)度評分和百分比評分相乘來計(jì)算[10]。

7.組織免疫熒光雙染

石蠟切片脫蠟，梯度乙醇下行水化，抗原修復(fù)，3%BSA封閉，油性筆圈定區(qū)域后同一張切片上滴加抗α-SMA（1:300）、PDGFR-β（1:200）的一抗混合液，濕盒中4℃孵育過夜，次日復(fù)溫，PBS沖洗3次，每次3分鐘，甩干后滴加FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG和TRITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG混合熒光二抗（1:500），37℃孵育，PBS沖洗3次，滴加DAPI溶液（1μL DAPI+1mL PBS）染細(xì)胞核，滴加防熒光淬滅封片劑封片，晾干，激光共聚焦顯微鏡下觀察，綠色熒光（激發(fā)光405 nm）、紅色熒光（激發(fā)光543 nm）為陽性表達(dá)，核呈藍(lán)色熒光（激發(fā)光359 nm）。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)不重疊的高倍視野進(jìn)行觀察、拍照。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析和Student-Newman-Keuls（SNK）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠正畸牙移動模型建立

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上頜左側(cè)第一磨牙在螺旋拉簧的機(jī)械作用力下均發(fā)生了向近中的移動，左側(cè)第一磨牙和第二磨牙之間出現(xiàn)肉眼可見的間隙，而右側(cè)對照側(cè)無明顯間隙，表明大鼠正畸牙移動模型建立成功（圖2）。

圖2 第7天正畸牙近中移動的典型圖像

2.序列熒光標(biāo)記檢測結(jié)果

分別于正畸牙移動第7天、14天對第一磨牙牙槽骨新骨礦化沉積活動進(jìn)行四環(huán)素（綠色）、茜素紅（紅色）熒光標(biāo)記，然后于第28天取材后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果如圖3A所示，張應(yīng)力側(cè)可見綠色熒光條帶沉積，紅色熒光沉積更明顯、面積更大，而壓應(yīng)力側(cè)無明顯綠色熒光顯現(xiàn)，只有少量紅色熒光。張力側(cè)熒光面積明顯大于壓力側(cè)，說明壓力側(cè)無明顯骨化沉積活動，相反，張應(yīng)力側(cè)有大量新骨增生、沉積。而紅色、綠色熒光帶之間的寬度表示新骨的寬度，通過兩種顏色標(biāo)記條帶之間的距離計(jì)算新骨礦化沉積速率（mineral apposition rate，MAR），結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)張應(yīng)力側(cè)骨礦化沉積顯著快于壓應(yīng)力側(cè)（圖3B），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖3 正畸牙移動28天后，序列熒光標(biāo)記觀察加力側(cè)新生骨組織（A）及定量分析新骨礦化速率（B）

3.張應(yīng)力側(cè)牙周膜免疫組化染色結(jié)果

在正畸牙移動模型中，通過免疫組化檢測在張應(yīng)力刺激下張應(yīng)力側(cè)PDLFs的α-SMA、PDGF-BB、PDGFRβ表達(dá)是否上調(diào)。結(jié)果圖4所示，對照組PDLFs表達(dá)α-SMA，呈淺褐色，而在加力7天后張應(yīng)力區(qū)廣泛表達(dá)α-SMA，且顏色加深，呈棕褐色。表明張應(yīng)力刺激下PDLFsα-SMA高表達(dá)，在7天時(shí)達(dá)到峰值，與對照組相比具有顯著差異（P＜0.01）。隨后在第14天時(shí)，α-SMA的表達(dá)有所下降，但仍然強(qiáng)于對照組（P＜0.01）。對照組牙周膜中只有少量PDGF-BB表達(dá)，而在張應(yīng)力刺激下第7天PDGFBB表達(dá)升高，在第14天PDGF-BB表達(dá)稍下降，呈淺褐色，相比對照組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。PDGFRβ在對照組牙周膜中只有零星細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)，隨后在張應(yīng)力刺激下，PDGFRβ表達(dá)逐漸增強(qiáng)，7天時(shí)染色最深，呈棕色，之后逐漸減弱，14天時(shí)仍有陽性表達(dá)。加力組PDGFRβ陽性細(xì)胞數(shù)均大于對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖4 大鼠正畸牙移動過程中，第一磨牙遠(yuǎn)中根遠(yuǎn)中區(qū)（張應(yīng)力側(cè)）α-SMA、PDGF-BB、PDGFR-β免疫組化染色（A）及半定量分析（B）

4.牙周膜α-SMA和PDGFRβ蛋白共定位情況

通過石蠟切片上免疫熒光雙重染色PDGFRβ、α-SMA，確認(rèn)PDGFRβ是否在α-SMA+PDLFs上表達(dá)，以及確認(rèn)張應(yīng)力刺激下α-SMA+PDLFs上PDGFRβ表達(dá)是否上調(diào)。如圖5所示，正常對照組雙側(cè)可觀察到染色較淺的紅色熒光（α-SMA），且綠色熒光（PDGFRβ）也顯示相同的表達(dá)情況，從Merged圖可以觀察到少量綠色熒光與紅色熒光共存于同一細(xì)胞。而在正畸加力7天后，張應(yīng)力側(cè)牙周膜α-SMA、PDGFRβ相比對側(cè)壓應(yīng)力側(cè)染色明顯增強(qiáng)，從Merged圖上可以看出張應(yīng)力側(cè)α-SMA和PDGFRβ表達(dá)共定位的細(xì)胞數(shù)目顯著增加，呈黃色，說明張應(yīng)力刺激下上調(diào)了α-SMA+PDLFs上的PDGFRβ表達(dá)。

圖5 正畸牙移動7天后，上頜骨左側(cè)牙周膜張應(yīng)力區(qū)和壓應(yīng)力區(qū)免疫熒光標(biāo)記α-SMA（紅色）、PDGFR-β（綠色）、DAPI（藍(lán)色）的典型圖像

討 論

牙周膜和牙槽骨的改建是正畸牙齒移動的基礎(chǔ)[11，12]。在正畸力作用下，牙周膜內(nèi)細(xì)胞、組織對壓縮和牽張應(yīng)變的反應(yīng)不同，最終導(dǎo)致壓力側(cè)牙槽骨發(fā)生骨吸收，張應(yīng)力側(cè)發(fā)生骨形成。壓應(yīng)力側(cè)牙周間隙變窄，血流減少，膠原纖維和基質(zhì)降解吸收，RANKL表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化，分泌細(xì)胞因子，溶解骨基質(zhì)中的羥基磷灰石和有機(jī)質(zhì)等骨組織成分，從而發(fā)生牙槽骨吸收；張應(yīng)力側(cè)牙周間隙變寬，血流量增多，膠原纖維和基質(zhì)增生，成骨因子Runx-2、OPG等表達(dá)升高，骨基質(zhì)分泌、礦化，繼而新生骨沉積[13]。序貫熒光標(biāo)記方法用于示蹤骨組織新生或改建過程中的鈣鹽沉積活動，可記錄不同階段新骨形成速度，已被作為骨再生研究中的常規(guī)檢測手段廣泛應(yīng)用[14]。而本實(shí)驗(yàn)中通過序列熒光標(biāo)記發(fā)證實(shí)了在加力28天后張應(yīng)力側(cè)的確有大量新骨沉積，這有利于牙齒移動到新的位置并穩(wěn)定下來。

牙周膜是牙周組織中可形變最大的組織，是正畸牙移動的關(guān)鍵[15，16]。PDLFs是牙周膜中的主體細(xì)胞，能夠調(diào)節(jié)牙周膜代謝。且具有異質(zhì)性，部分亞型具有成骨細(xì)胞的表型，可以在力學(xué)刺激下成骨向分化[17]。PDLFs能分泌多種細(xì)胞因子影響骨代謝，而且其自身功能和代謝也受很多細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)和影響，間接調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收活動[18]。同時(shí)PDLFs被認(rèn)為是感受機(jī)械應(yīng)變并做出機(jī)械反應(yīng)第一受體[19，20]。在本實(shí)驗(yàn)中，免疫組化結(jié)果顯示張應(yīng)力側(cè)α-SMA陽性的PDLFs明顯增多，在加力第7天時(shí)達(dá)到峰值，推測是因?yàn)閺垜?yīng)力刺激下PDLFs由相對靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)，從而細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，這與之前的一些研究結(jié)果相一致[21，22]。活化的成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)會增多[23]，本研究顯示張應(yīng)力刺激下張應(yīng)力側(cè)牙周膜中PDGF-BB、PDGFRβ表達(dá)均上調(diào)。有研究指出PDGFRβ的表達(dá)上調(diào)可作為成纖維細(xì)胞發(fā)揮功能的指標(biāo)[24]。PDGF-BB主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)，主要以旁分泌的形式發(fā)揮作用[25，26]。體內(nèi)研究表明，人重組PDGF-BB可以促進(jìn)牙周組織再生，骨折和骨缺損的修復(fù)，加快組織愈合，提高成骨質(zhì)量，促進(jìn)牙周軟硬組織的恢復(fù)，促進(jìn)種植體周圍骨組織形成[27]。而通過體內(nèi)組織切片的免疫熒光共定位可以發(fā)現(xiàn)張應(yīng)力刺激下PDGFRβ與α-SMA+的PDLFs共定位。由此推測在正畸力作用下，張應(yīng)力側(cè)PDLFs感受力學(xué)刺激，張應(yīng)力刺激促進(jìn)牙周膜中PDGF-BB表達(dá)，并且與α-SMA+/PDGFRβ+的PDLFs結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)作用。

綜上所述，研究確定了大鼠正畸牙移動過程中張應(yīng)力側(cè)有大量新骨形成。本研究發(fā)現(xiàn)在正畸牙移動過程中牙周張應(yīng)力側(cè)PDGF-BB、PDGFRβ表達(dá)上調(diào)，而壓應(yīng)力側(cè)無明顯上調(diào)，推測這可能與PDGFBB/PDGFRβ參與正畸骨改建過程，但其詳細(xì)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。