黃錦 加加林 姚雅馨 陸思嘉 黨玉姣 喬杰 劉平

近年來(lái)胚胎培養(yǎng)液中存在游離DNA(cell free DNA，cfDNA)已經(jīng)在生殖領(lǐng)域引起了越來(lái)越多的關(guān)注[1]。有學(xué)者利用囊胚培養(yǎng)液中cfDNA檢測(cè)囊胚的整倍性[2-3]。由于胚胎培養(yǎng)液中游離DNA來(lái)源復(fù)雜而且含量極少，這給檢測(cè)胚胎整倍性的準(zhǔn)確性帶來(lái)困難，也限制了在臨床上的廣泛應(yīng)用。本文以囊胚培養(yǎng)液cfDNA檢測(cè)重要染色體(13、15、16、18、21、22號(hào)染色體)整倍性為切入點(diǎn)，探討利用cfDNA檢測(cè)囊胚整倍性的效率。

材料與方法

一、材料

本研究共納入239枚囊胚，所有的胚胎均來(lái)源于北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖中心的胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic testing for aneuploidy PGT-A)周期。PGT-A指征為女方高齡(>38歲)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)著床失敗。本研究獲得北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均在進(jìn)入周期前簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.促排卵和受精方式：按照本中心常規(guī)用藥及監(jiān)測(cè)方案進(jìn)行控制性超排卵，注射HCG后36 h經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵。所有周期都采用單精子卵母細(xì)胞內(nèi)注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)方式受精。受精后16 h～18 h觀察受精情況，第三天選擇4細(xì)胞以上、碎片<50%的胚胎(多PN來(lái)源胚胎除外)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，第三天或者第四天進(jìn)行單胚胎單培養(yǎng)滴培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)滴大約20 uL左右。

2. PGT-A胚胎活檢與遺傳診斷：選擇4期以上、滋養(yǎng)層細(xì)胞或者內(nèi)細(xì)胞團(tuán)其中一項(xiàng)評(píng)級(jí)為B以上的囊胚(Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4])進(jìn)行活檢，激光活檢3～5個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞。活檢的滋養(yǎng)層細(xì)胞采用SNP芯片檢測(cè)胚胎的整倍性進(jìn)行遺傳檢測(cè)，SNP array 芯片采用ILLUMINA公司的Human CytoSNP 12V-2.1芯片，活檢后的細(xì)胞采用多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification, MDA)方法全基因組擴(kuò)增后，雜交至芯片，掃描后的數(shù)據(jù)采用Illumina Genome Studio軟件分析[5]?；顧z后的囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍。

3.培養(yǎng)液收集與檢測(cè)：囊胚活檢后，留取相應(yīng)的培養(yǎng)液滴至PCR管中，-20℃保存。所有收集的囊胚培養(yǎng)液樣本均進(jìn)行無(wú)創(chuàng)胚胎染色體篩查(noninvasive chromosome screening, NICS)(億康基因公司)檢測(cè)整倍性，即先將樣本進(jìn)行多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC)擴(kuò)增后，采用NGS方法檢測(cè)整倍性[6]。

4.統(tǒng)計(jì)方法：采用盲法獲得囊胚的PGT-A結(jié)果和培養(yǎng)液的NICS結(jié)果。本研究著重針對(duì)13、15、16、18、21、22號(hào)染色體整倍性進(jìn)行研究。以PGT-A結(jié)果為參照指標(biāo)，分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)囊胚培養(yǎng)液NICS相應(yīng)染色體結(jié)果的真陽(yáng)性(true positive，TP)(PGT-A、NICS結(jié)果均異常)、假陽(yáng)性(false positive，F(xiàn)P) (PGT-A正常、NICS異常)、真陰性(true negative，TN)(PGT-A、NICS均正常)、假陰性(false negative，F(xiàn)N)(PGT-A異常、NICS正常)等樣本數(shù)。進(jìn)而計(jì)算出NICS在檢測(cè)這些染色體整倍性的敏感度(sensitivity)、特異度(specificity)、診斷效率(efficiency)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(positive predict value，PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(negative predict value，NPV)。具體計(jì)算公式如下:敏感度=TP/(TP+FN)；特異度=TN/(TN+FP)；效率=(TP+TN)/(TP+FP+TN+FN)；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=TP/(TP+FP)；陰性預(yù)測(cè)值=TN/(TN+FN)。

結(jié) 果

一、基本情況

本研究納入239枚囊胚，其中209枚囊胚對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液游離DNA有NICS結(jié)果，NICS檢出率為87.5%(209/239)。

以209枚囊胚的PGT-A結(jié)果做參照，統(tǒng)計(jì)這些囊胚13、15、16、18、21、22號(hào)染色體NICS結(jié)果的真陽(yáng)性胚胎數(shù)、假陽(yáng)性胚胎數(shù)、真陰性胚胎數(shù)、假陰性胚胎數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)公式，計(jì)算出這些重要染色體NICS診斷的敏感度、特異度、診斷效率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 209枚囊胚重要染色體NICS結(jié)果的統(tǒng)計(jì)資料

表2 重要染色體整倍性的NICS檢測(cè)結(jié)果分析(%)

討 論

非整倍體胚胎是導(dǎo)致IVF妊娠率降低，流產(chǎn)率、胎兒畸形率升高的一個(gè)重要原因[7]。目前，臨床上利用胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGT-A)技術(shù)檢測(cè)胚胎的整倍性。但是，PGT需要進(jìn)行胚胎活檢獲取細(xì)胞進(jìn)行整倍性分析的，對(duì)于胚胎是一種有創(chuàng)性的操作，僅在一些特殊人群(如女方高齡、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)著床失敗的患者)中應(yīng)用。因此，尋求更加微創(chuàng)甚至無(wú)創(chuàng)的胚胎診斷方法成為生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胚胎的培養(yǎng)液中含有微量的游離DNA，可以反映胚胎的整倍性，為無(wú)創(chuàng)胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)提供了前景[1]。但是，臨床上用于培養(yǎng)胚胎的培養(yǎng)液體積很小，內(nèi)含cfDNA含量極其微少，甚至少于一個(gè)細(xì)胞的含量，且DNA的狀態(tài)存在片段化和碎片化的情況，這都給臨床上的應(yīng)用帶來(lái)困擾。

非整倍體對(duì)臨床不良妊娠結(jié)局有重要影響。在臨床應(yīng)用中，不論是PGT還是培養(yǎng)液cfDNA，整倍體的檢測(cè)結(jié)果引人關(guān)注，因?yàn)檫@些對(duì)應(yīng)的胚胎是可利用胚胎。但是對(duì)于非整倍體的檢測(cè)結(jié)果，同樣也要關(guān)注非整倍體的具體染色體情況，因?yàn)椴煌旧w的非整倍性情況對(duì)胚胎發(fā)育及著床有著不同的影響。課題組前期研究顯示[8]，某些非整倍體在胚胎中比例較高，但是在流產(chǎn)的絨毛檢測(cè)結(jié)果中很少見(jiàn)到(例如16單體、22單體等)，這意味著這些非整倍性狀態(tài)嚴(yán)重影響胚胎的早期發(fā)育和著床；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，某些非整倍體在胚胎和流產(chǎn)絨毛中的比例均較高(例如16三體、21三體等)，這就意味著這些非整倍體狀態(tài)導(dǎo)致流產(chǎn)機(jī)會(huì)大，因此，對(duì)于早期胚胎篩查，應(yīng)著重關(guān)注這些染色體的整倍性。參照無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(cè)(non-invasive prenatal testing，NIPT)內(nèi)容,本研究著重研究13、15、16、18、21、22號(hào)染色體的非整倍性。

本研究中，以PGT-A的檢測(cè)結(jié)果為參照，計(jì)算cfDNA的NICS檢測(cè)結(jié)果的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值等指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，NICS對(duì)這些重要染色體檢測(cè)的特異性、效率比較高，均>90%，NICS結(jié)果的陰性預(yù)測(cè)值超過(guò)97%；但是敏感性波動(dòng)較大(33%～100%)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低，<50% (詳見(jiàn)表2)。

這些結(jié)果表明，如果cfDNA檢測(cè)這些染色體為整倍體，那么對(duì)應(yīng)胚胎這些染色體為整倍體的概率很高(陰性預(yù)測(cè)值>97%)；但是，如果cfDNA檢測(cè)這些染色體為非整倍體，那么對(duì)應(yīng)胚胎這些染色體為非整倍體的概率并不高(陽(yáng)性預(yù)測(cè)值<50%)。這些結(jié)果也再次表明培養(yǎng)液中cfDNA的細(xì)胞來(lái)源復(fù)雜，利用培養(yǎng)液中cfDNA檢測(cè)胚胎的整倍性目前還存在一定局限性，應(yīng)以胚胎篩查為目的而不是以診斷胚胎為目的。

目前，已經(jīng)有多項(xiàng)關(guān)于培養(yǎng)液cfDNA與囊胚整倍性相關(guān)的研究。意大利的研究團(tuán)隊(duì)研究了115枚囊胚培養(yǎng)液cfDNA與滋養(yǎng)層細(xì)胞整倍性，一致性可以達(dá)到78.7%，敏感度、特異度分別為94.5%和71.7%[9]。Huang等人的研究團(tuán)隊(duì)則比較了滋養(yǎng)層細(xì)胞、囊胚培養(yǎng)液中cfDNA以及整個(gè)囊胚的整倍性，研究結(jié)果顯示，cfDNA檢測(cè)結(jié)果與整個(gè)囊胚的檢測(cè)結(jié)果的一致率要高于滋養(yǎng)層活檢細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果；但該研究對(duì)象是捐贈(zèng)囊胚，培養(yǎng)液樣本收集是解凍囊胚培養(yǎng)24 h后采樣，這與臨床實(shí)際情況存在一定差異[10]。在本研究中，NICS檢出率為87.5%(209/239)，NICS結(jié)果與PGT-A結(jié)果的一致性并不是高度吻合，分析主要原因在于以下幾點(diǎn)：首先，樣本來(lái)源不同，PGT-A檢測(cè)的樣本為囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞，NICS檢測(cè)的樣本是培養(yǎng)液中cfDNA，cfDNA有可能是囊胚細(xì)胞釋放，也可能來(lái)自于胚胎發(fā)育過(guò)程中其他細(xì)胞的DNA釋放。其次，檢測(cè)平臺(tái)不同，PGT-A檢測(cè)采用MDA全基因組擴(kuò)增后進(jìn)行SNP芯片檢測(cè)，NICS檢測(cè)采用MALBAC全基因組擴(kuò)增后進(jìn)行NGS檢測(cè)。

探索無(wú)創(chuàng)胚胎檢測(cè)方法是生殖領(lǐng)域近年來(lái)探索的熱點(diǎn)，檢測(cè)培養(yǎng)液中cfDNA的整倍性便為其中之一。本文檢測(cè)cfDNA的重要染色體(13、15、16、18、21、22號(hào)染色體)整倍性為切入點(diǎn)，研究結(jié)果提示，NICS方法的特異性和陰性預(yù)測(cè)值較好，當(dāng)NICS結(jié)果顯示這些重要染色體為整倍體時(shí)，對(duì)應(yīng)胚胎該條染色體整倍性概率高；但是當(dāng)NICS結(jié)果顯示這些重要染色體為非整倍體時(shí)，對(duì)應(yīng)胚胎并不一定為非整倍體。相信隨著NICS技術(shù)不斷提高，該技術(shù)有望在臨床中得到應(yīng)用。