王文湛 陰克強(qiáng) 張三元

宮頸癌作為僅次于乳腺癌的發(fā)展中國家女性第二大常見惡性腫瘤，主要包括宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸腺癌，其中腺癌占20%～25%[1-2]。近年來隨著宮頸癌篩查的普及與HPV疫苗的應(yīng)用，宮頸鱗癌的發(fā)病率有下降趨勢，而宮頸腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，且趨于年輕化[3]，腺癌組織病理學(xué)復(fù)雜、預(yù)后差，其早期診斷與預(yù)后判斷顯得尤為重要。

癌癥基因組圖譜(the cancer genome alas，TCGA)是目前使用廣泛、數(shù)據(jù)維護(hù)相對(duì)成熟完善的公共組學(xué)數(shù)據(jù)庫，隨著后基因組時(shí)代、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)研究的不斷深入，利用生物信息學(xué)方法處理海量數(shù)據(jù)，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展增加宏觀、整體化的認(rèn)識(shí)成為了目前的重要趨勢，國內(nèi)外諸多腫瘤領(lǐng)域?qū)＜一赥CGA等數(shù)據(jù)庫在尋找潛在的腫瘤預(yù)后、早期篩查、發(fā)生發(fā)展相關(guān)的腫瘤分子標(biāo)志物等方面進(jìn)行了大量研究[4-5]，本文基于癌癥蛋白質(zhì)組圖譜(the cancer proteome atlas，TCPA) 數(shù)據(jù)庫及TCGA數(shù)據(jù)庫中的宮頸癌蛋白表達(dá)與臨床預(yù)后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以期尋找宮頸癌預(yù)后相關(guān)蛋白，并構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測宮頸癌預(yù)后。

資料與方法

1.數(shù)據(jù)收集:從TCPA數(shù)據(jù)庫(https://www.tcpaportal.org/)下載v4.2版本的的CESC患者腫瘤的的反相蛋白芯片(reverse-phase protein arrays，RPPA) 的level 4數(shù)據(jù)，Dataset ID 為TCGA- CESC -L4，Platform 為MDA_RPPA_Core，共171個(gè)樣本的220個(gè)蛋白的數(shù)據(jù)。TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/，檢索時(shí)間：2020.6.22)下載CESC患者的臨床資料，共307例患者。

2.蛋白表達(dá)與宮頸癌預(yù)后分析及風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建：將蛋白數(shù)據(jù)與生存資料合并，根據(jù)蛋白表達(dá)量的中位值將患者分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，使用Kaplan-Meier方法進(jìn)行高低表達(dá)組之間的總生存期(overall survival,OS)的比較，并作log-Rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。同時(shí)使用單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析蛋白表達(dá)與OS的關(guān)系，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，并繪制火山圖。將同時(shí)符合log-RankP<0.05和CoxP<0.05的蛋白篩選出來并使用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，以向前法和向后法進(jìn)行篩選，繪制模型蛋白生存曲線，并計(jì)算出風(fēng)險(xiǎn)得分，以風(fēng)險(xiǎn)得分中位值為界分為高低風(fēng)險(xiǎn)兩組，并繪制風(fēng)險(xiǎn)生存曲線和風(fēng)險(xiǎn)曲線熱圖。

3.風(fēng)險(xiǎn)模型的獨(dú)立預(yù)后分析：將風(fēng)險(xiǎn)得分與臨床資料合并，并刪除臨床資料不完整及不確定的數(shù)據(jù)，共得到78例患者的數(shù)據(jù)，風(fēng)險(xiǎn)值與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。并進(jìn)行單因素及多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)后作用，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。利用受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC)，評(píng)價(jià)風(fēng)險(xiǎn)值在診斷宮頸癌中的靈敏度和特異度，ROC曲線下面積(area under the ROC curve，AUC)評(píng)估模型效能。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有的統(tǒng)計(jì)分析均在R 3.6.3中進(jìn)行。KM分析及Cox分析采用survial包，火山圖繪制采用ggplot2及ggrepel包，風(fēng)險(xiǎn)熱圖繪制采用pheatmap包，ROC曲線繪制采用survialROC包。

結(jié)果

1.蛋白表達(dá)與宮頸癌預(yù)后分析及風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建：單因素分析顯示與宮頸癌預(yù)后相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)蛋白有ACC1、ASNS、BCLXL、BID、CRAF_pS338、CYCLIND1、FASN、HER3_pY1289、MEK1_pS217S221、MIG6、MRE11、NCADHERIN、PAI1、RAB11、RAD51、SMAD3、STATHMIN、X1433BETA、X4EBP1_pT70、YAP等20種蛋白，低風(fēng)險(xiǎn)蛋白Bcl-2、CD31、CHK1_pS345、ERALPHA_pS118、JAK2、KU80、PDK1_pS241、SF2等8種蛋白(圖1)。單因素及多因素分析及KM分析篩選出來的與預(yù)后顯著相關(guān)的納入風(fēng)險(xiǎn)模型的蛋白有7個(gè)，其中Bcl-2為低風(fēng)險(xiǎn)蛋白(圖2a),CRAF_pS338、CYCLIND1、MEK1_pS217S221、SMAD3、X4EBP1_pT70、YAP為高風(fēng)險(xiǎn)蛋白(圖2b-2g)。風(fēng)險(xiǎn)生存曲線顯示風(fēng)險(xiǎn)得分與預(yù)后顯著相關(guān)(圖2h)，高低分險(xiǎn)5年生存率分別為0.547(95%CI：0.398～0.750)、0.813(95%CI：0.681～0.971)。風(fēng)險(xiǎn)曲線熱圖顯示CYCLIND1、MEK1_pS217S221、SMAD3、X4EBP1_pT70、YAP、CRAF_pS338為高風(fēng)險(xiǎn)蛋白，Bcl-2為低風(fēng)險(xiǎn)蛋白(圖3)。

圖1 宮頸癌預(yù)后相關(guān)的蛋白表達(dá)

圖2 蛋白表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的生存曲線

圖3 宮頸癌預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)曲線

2.風(fēng)險(xiǎn)模型的獨(dú)立預(yù)后分析：單因素分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)得分與預(yù)后顯著相關(guān)(表1)。多因素分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)得分與預(yù)后顯著相關(guān)(表1)。風(fēng)險(xiǎn)得分的AUC為0.919(圖4)。

表1 宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)模型的獨(dú)立預(yù)后分析

圖4 風(fēng)險(xiǎn)模型的ROC曲線

討論

本文通過單因素分析顯示與宮頸癌預(yù)后相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)蛋白有ACC1、ASNS、BCLXL、BID、CRAF_pS338、CYCLIND1、FASN、HER3_pY1289、MEK1_pS217S221、MIG6、MRE11、NCADHERIN、PAI1、RAB11、RAD51、SMAD3、STATHMIN、X1433BETA、X4EBP1_pT70、YAP等20種，低風(fēng)險(xiǎn)蛋白Bcl-2、CD31、CHK1_pS345、ERALPHA_pS118、JAK2、KU80、PDK1_pS241、SF2等8種。主要集中在腫瘤代謝、細(xì)胞周期、凋亡調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等腫瘤研究領(lǐng)域，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程密切相關(guān)。

最終發(fā)現(xiàn)納入風(fēng)險(xiǎn)模型的CYCLIND1、MEK1_pS217S221、SMAD3、X4EBP1_pT70、YAP、CRAF_pS338六種蛋白作為高風(fēng)險(xiǎn)蛋白。CYCLIND1系典型的細(xì)胞周期G1/S期調(diào)控蛋白，G1/S期作為細(xì)胞周期中信號(hào)傳遞及細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)控窗口。CYCLIND1促細(xì)胞周期不斷G1/S轉(zhuǎn)化從而使細(xì)胞持續(xù)分裂致瘤。有研究[6]表明，CYCLIND1的高表達(dá)通常提示宮頸癌預(yù)后不良。張倩雯[7]等的研究表明，CIN和宮頸癌中CYCLIND1蛋白表達(dá)率高于正常組。周密[8]等的研究表明，宮頸癌新輔助化療后CYCLIND1陽性率降低，且其為影響新輔助化療效果的影響因子。分析可能機(jī)制為G1/S轉(zhuǎn)化致DNA異常轉(zhuǎn)錄，對(duì)化療敏感性降低。這與我們的研究其作為模型蛋白中的高風(fēng)險(xiǎn)蛋白一致。MEK是一類參與絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的酶家族，已鑒定出7種。其中MEK1、MEK2參與RAS/RAF/MEK/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracelluar regulated protein kinase,ERK)通路，并最終激活效應(yīng)分子ERK1/ERK2參與線粒體途徑的凋亡,該通路的過度激活可致細(xì)胞惡性增生[9]此外，作為線粒體凋亡途徑中的凋亡抑制分子Bcl-2和促凋亡分子Bax均受到ERK1/2的調(diào)節(jié)，活化的ERK1/2使BCL-2表達(dá)增多、Bax表達(dá)抑制，進(jìn)而通過BCL-2和Bax對(duì)線粒體凋亡途徑進(jìn)行抑制，增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡能力，促進(jìn)細(xì)胞生長。預(yù)后模型中的蛋白作為經(jīng)典腫瘤信號(hào)通路互相調(diào)控的節(jié)點(diǎn)或可反映腫瘤信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控過程。作為腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移浸潤密切相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游信號(hào)分子，Smads蛋白家族在宮頸癌細(xì)胞的分化、增殖過程中有著重要的意義。韋榮飛等[10]的研究表明Smad3在乳腺癌、肺癌、宮頸癌中均可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。TGF-β信號(hào)通路在腫瘤的進(jìn)展中起著雙相的作用，在初期通過影響細(xì)胞周期抑制腫瘤生長。腫瘤進(jìn)展中，這種抑制作用逐漸減弱甚至消失，使得腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)生長優(yōu)勢。這可能與該傳導(dǎo)路中傳導(dǎo)元件突變有關(guān)[11]。4EBP1是eIF4E的特異性抑制分子，被PI3K/AKT磷酸化為p-4EBP1后失去對(duì)eIF4E的抑制作用，進(jìn)而通過eIF4E的轉(zhuǎn)錄因子活性來調(diào)控多種基因的表達(dá)，作為PI3K/AKT/mTOR這一具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)信號(hào)通路的關(guān)鍵介質(zhì)，陳鳳霞等的研究[12]表明，p-4EBP1在宮頸癌組織中的含量顯著高于癌旁病灶組織及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織。同時(shí)觀察到與宮頸癌旁病灶及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織相比，宮頸癌病灶組織中的CyclinD1 mRNA表達(dá)量顯著升高，這與本研究模型中高風(fēng)險(xiǎn)蛋白同時(shí)包含了4EBP1、CyclinD1相一致，也體現(xiàn)了蛋白表達(dá)在宮頸癌病理生理過程可視化中的意義，蛋白表達(dá)的改變必然適于功能的需要或者說功能是通過蛋白的改變來實(shí)現(xiàn)的。劉蘭等[13]的研究表明EBP1在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且表達(dá)與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等預(yù)后相關(guān)因素密切相關(guān)。這也與本研究最終將該蛋白納入預(yù)后模型一致。YAP作為經(jīng)典腫瘤信號(hào)通路Hippo通路的核心效應(yīng)分子，目前被普遍認(rèn)為是原癌基因，在多種癌癥中均檢測到了YAP的高表達(dá)現(xiàn)象，王文慧[14]等的研究表明：YAP1在宮頸癌組織呈高表達(dá),其表達(dá)與臨床分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,為宮頸癌的獨(dú)立預(yù)后影響因素,高表達(dá)YAP1的宮頸癌患者預(yù)后差。這與本研究模型的研究結(jié)果相一致。CRAF是RAF激酶家族的重要成員，可通過激活下游的MEK/ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及腫瘤耐藥[15]，但其在宮頸癌中的研究尚少。

BCL-2家族于1988年發(fā)現(xiàn)，作為目前研究最深入、廣泛的經(jīng)典凋亡調(diào)控基因，嚴(yán)格調(diào)控細(xì)胞的凋亡機(jī)制。在本研究的模型中，Bcl-2蛋白作為低風(fēng)險(xiǎn)蛋白，隨著表達(dá)量的增高，患者風(fēng)險(xiǎn)值降低?，F(xiàn)有的研究表明，在多種人類腫瘤中，均出現(xiàn)了Bcl-2蛋白的過表達(dá)[16]。作為凋亡調(diào)控基因其機(jī)制在于限制細(xì)胞的死亡。目前普遍認(rèn)為Bcl-2的表達(dá)水平隨著CIN等級(jí)升高,但與這些研究相反，Shukla等的研究表明[17]Bcl-2的表達(dá)隨著CIN等級(jí)的升高而降低。Bcl-2在宮頸癌進(jìn)展中的意義尚存在爭議。本研究結(jié)果中Bcl-2作為低風(fēng)險(xiǎn)蛋白是在本文數(shù)據(jù)庫分析中，以風(fēng)險(xiǎn)模型及風(fēng)險(xiǎn)值分析方法下的結(jié)果。具體其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的意義尚需進(jìn)行更加深入的研究。

本研究中，單因素分析所得到的與預(yù)后相關(guān)的蛋白種類眾多，而最終形成預(yù)后模型的蛋白僅剩7種，這可能與納入模型的蛋白處于宮頸癌病理生理過程中的核心過程，與這些蛋白所涉及信號(hào)通路的網(wǎng)狀調(diào)控相關(guān)。這也與我們目前的認(rèn)識(shí)相一致，在腫瘤發(fā)展過程中，多種功能協(xié)同的信號(hào)通路及核心蛋白的改變呈現(xiàn)出協(xié)同化態(tài)勢以適應(yīng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。

目前隨著宮頸癌疫苗及篩查手段的廣泛普及，宮頸癌的防治效力已得到了極大改善，但早期、內(nèi)生型宮頸癌的診斷應(yīng)臨床表現(xiàn)不典型、陰道鏡評(píng)估不滿意，存在一定漏診率，此外由于宮頸在生育中所承擔(dān)的重要作用，早期提供預(yù)后相關(guān)信息對(duì)保留生育功能等臨床決策十分重要。腫瘤作為一種多病因?qū)W且異質(zhì)性極高的基因病，在現(xiàn)代腫瘤學(xué)領(lǐng)域?qū)ζ湔J(rèn)知已進(jìn)入到不同疾病、不同條件下全基因組廣度的基因、RNA、蛋白質(zhì)等的表達(dá)譜數(shù)據(jù)近乎完整捕獲的時(shí)代，這為從整體發(fā)展上把握腫瘤病理生理學(xué)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，而大量的生物信息學(xué)分析方法將低通量所不易捕捉到的分子活動(dòng)特征涉及的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行了挖掘，為目前對(duì)腫瘤病理生理學(xué)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)提供了新的研究方向。本文中基于對(duì)數(shù)據(jù)庫蛋白與預(yù)后數(shù)據(jù)的分析所構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型作為宮頸癌的獨(dú)立預(yù)后因子，AUC為0.804，具有良好的預(yù)后預(yù)測價(jià)值。目前眾多蛋白已被初步明了其在各類腫瘤中的表達(dá)量改變、原癌或抑癌效應(yīng)、在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中所扮演的角色、上下游信號(hào)的調(diào)控、多種通路之間的網(wǎng)狀調(diào)控效應(yīng)以及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，但這對(duì)理解腫瘤的發(fā)生及后續(xù)的研究來說遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，無法獲取整體視野的認(rèn)知。本文中所構(gòu)建的模型為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)、研究海量蛋白質(zhì)改變及其背后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與預(yù)后之間的關(guān)系提供了一種新的思路。但因其僅作為基于TCPA數(shù)據(jù)庫所涵蓋檢測樣本數(shù)據(jù)的分析與構(gòu)建，數(shù)據(jù)涵蓋的人種、腫瘤的具體分期、病理類型均十分復(fù)雜，與中國真實(shí)世界的數(shù)據(jù)之間匹配性如何不得而知，因此該預(yù)后模型僅可作為初步的理論探索，后續(xù)仍需在中國宮頸癌患者中進(jìn)一步驗(yàn)證其蛋白表達(dá)并進(jìn)行預(yù)后隨訪，建立自己的數(shù)據(jù)庫，在我國的真實(shí)世界數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行模型的預(yù)后檢測效能驗(yàn)證，方可進(jìn)一步評(píng)估該模型的預(yù)后判斷效能，以期為宮頸癌早期檢測、預(yù)后判斷提供可靠靶點(diǎn)與證據(jù)。