劉斯文，史 銳，劉苗苗，叢龍嬌，黃曉彤

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 110000)

近年來，惡性腫瘤是導(dǎo)致人類死亡的主要原因,是嚴(yán)重威脅人類生命健康的主要疾病之一[1]。目前,中藥以多靶點(diǎn)、低毒性等優(yōu)點(diǎn)在抗腫瘤方面發(fā)揮了重要作用[2]。但中藥的溶解性、生物利用度低等問題亟待解決。納米載藥系統(tǒng)因具有緩控釋[3-4]、靶向性[5-6]、提高生物利用度[7]、降低藥物毒副作用[8]、避免蛋白類藥物降解[9]、能夠高選擇性地到達(dá)癌細(xì)胞并作用于癌細(xì)胞內(nèi)外的小分子或基因物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn),顯示了強(qiáng)大的抗癌作用[10]。

中藥牛蒡子具有抗炎[11-12]、抑制腫瘤細(xì)胞[13-14]、抑菌[15]、抗病毒[16]等作用。牛蒡苷元(arctigenin，ARG)是牛蒡子的主要活性成分之一[17]，在抗炎、抗病毒、降血糖、擴(kuò)張血管及免疫調(diào)節(jié)等方面具有獨(dú)特的藥理作用。Chae等[18]研究發(fā)現(xiàn)，木脂素類化合物中牛蒡苷元的抗炎作用最明顯。Awale等[19]研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡子的二氯甲烷提取物(50 μg·mL-1)對(duì)營養(yǎng)缺乏的癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，其顯示毒性的濃度為0.01 g·mL-1，對(duì)裸鼠胰腺癌細(xì)胞株(PANC-1)生長具有顯著的抑制作用。Hausott等[20]研究表明，牛蒡苷元可通過誘導(dǎo)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到抑制結(jié)腸直腸癌的作用。

基于此，作者對(duì)介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles，MSN)進(jìn)行葉酸(FA)和氧化鋅(ZnO)雙重修飾，制備裝載牛蒡苷元的載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG，通過SEM、TEM、XRD和N2吸附-脫附分析對(duì)其進(jìn)行表征，并對(duì)載藥體系的載藥性能和釋藥性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

載藥體系：MSN-ARG、FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG-GSH，自制。

牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品，上海同田生物技術(shù)有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、正硅酸乙酯(TEOS)、二硫蘇糖醇(DTT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、PBS緩沖溶液、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)、無水甲苯、葉酸(FA)、二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、無水乙酸鋅、乙酸鎂四水合物、氫氧化鈉、氨水、谷胱甘肽(GSH)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SX2-12-12D型馬弗爐，上海和呈儀器制造有限公司；FTIR-650型傅立葉變換紅外光譜儀，廣州科曉科學(xué)儀器有限公司；SNE-4500M型掃描電子顯微鏡(SEM)、小角X-射線粉末衍射儀，深圳方特科技有限公司；Tecnai G2型透射電子顯微鏡(TEM)，F(xiàn)EI公司；高性能多通道全自動(dòng)比表面積及孔隙度分析儀，麥克莫瑞提克(上海)儀器有限公司。

1.2 牛蒡苷元檢測(cè)波長的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制一定濃度的牛蒡苷元甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，以無水甲醇作空白對(duì)照，發(fā)現(xiàn)其在249 nm處有最大吸收峰，故選擇249 nm作為檢測(cè)波長。

精確稱取6.0 mg牛蒡苷元，加無水甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容，得0.24 mg· mL-1牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別移取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.6 mL、1.0 mL、1.4 mL、1.8 mL、2.2 mL至10 mL容量瓶中，加無水甲醇定容；以無水甲醇作空白對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定249 nm處吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制牛蒡苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 載藥體系的制備

1.3.1 MSN的制備

以CTAB為模板劑、TEOS為硅源，在堿性條件下與氨水在室溫下攪拌，即得MSN。

1.3.2 MSN的表面修飾

稱取少量MSN，將其分散在含有巰基硅烷偶聯(lián)劑MPTS和氨基硅烷偶聯(lián)劑APS(1∶1)的無水甲苯中(MSN與偶聯(lián)劑總量1∶1混合)，超聲處理，在80 ℃水浴中攪拌12 h，冷卻，產(chǎn)物抽濾，用無水乙醇洗滌2次，60 ℃真空干燥，即得改性產(chǎn)物NH2@SH-MSN。

1.3.3 MSN表面的FA修飾

將100 mg EDC和100 mg NHS溶于DMSO/DMF(體積比1∶3)中，在室溫下攪拌至完全溶解后，加入200 mg FA，繼續(xù)攪拌24 h，活化FA的-COOH；再加入適量NH2@SH-MSN，在室溫、避光條件下攪拌12 h，離心分離，即得FA@SH-MSN。

1.3.4 ZnO納米粒子的制備及巰基化修飾

將適量的無水乙酸鋅和乙酸鎂四水合物(10∶1)在劇烈攪拌下溶于60 mL熱無水乙醇中。將0.2 g NaOH溶于20 mL熱無水乙醇中。在冰浴條件下，將NaOH溶液快速滴入含有乙酸鋅和乙酸鎂的乙醇溶液中，并在室溫、避光條件下攪拌至反應(yīng)完全，得到白色的ZnO納米粒子，紫外燈照射，在365 nm波長下發(fā)出黃綠色熒光。以正己烷作為沉淀劑，離心分離ZnO納米粒子。

將制得的ZnO納米粒子溶于DMF中，滴加MPTS(1∶1)，高溫?cái)嚢?，離心，用DMF洗滌3次；將顆粒分散于蒸餾水中，得到無色澄清ZnO納米粒子溶液，避光放置，備用。

1.3.5 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的制備

將20 mg FA@SH-MSN分散于含有5 mg DTT的5 mL PBS緩沖溶液(pH=7.4，下同)中，加入500 μL ZnO納米粒子溶液，室溫避光攪拌24 h，離心分離，PBS緩沖溶液洗滌3次，60 ℃真空干燥，即得FA@ZnO-MSN。

精確稱取20 mg牛蒡苷元，溶于15 mL無水乙醇中，加入50 mg FA@SH-MSN，超聲溶解，室溫?cái)嚢?4 h，沉淀，離心，用無水乙醇洗去殘留在FA@SH-MSN表面的牛蒡苷元，得到FA@SH-MSN-ARG。將20 mg FA@SH-MSN-ARG分散于含有5 mg DTT的5 mL無水乙醇中，加入500 μL ZnO納米粒子溶液，室溫避光攪拌24 h后，離心分離，并用無水乙醇洗滌幾次，60 ℃真空干燥，得到載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG。按式(1)計(jì)算載藥率(%)：

(1)

1.4 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的釋藥性能

分別稱取10 mg載藥體系FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG和FA@ZnO-MSN-ARG-GSH(GSH濃度為2 mmol·L-1)置于透析袋中密封，將其懸浮于500 mL含1%SDS的PBS緩沖溶液(pH=7.4)中，在(37.0±0.5) ℃恒溫?fù)u床中100 r·min-1下進(jìn)行透析，每隔一段時(shí)間取出5 mL PBS緩沖溶液，同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)量的新鮮PBS緩沖溶液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定249 nm處吸光度。根據(jù)牛蒡苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到緩沖溶液中牛蒡苷元濃度，以累積釋藥量為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制體外釋藥曲線。按式(2)計(jì)算釋藥率(%)：

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 牛蒡苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

圖1 牛蒡苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of arctigenin

經(jīng)擬合得線性回歸方程：y=2.2481x-0.0161，R2=0.9992。表明牛蒡苷元濃度在0～0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的表征

2.2.1 SEM分析(圖2)

圖2 MSN(a)、FA@ZnO-MSN-ARG(b)的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM images of MSN(a) and FA@ZnO-MSN-ARG(b)

從圖2可知，未經(jīng)修飾的MSN的均勻性相對(duì)較好，粒徑約為100 nm，形態(tài)幾乎為球形(圖2a)；經(jīng)修飾、載藥后，F(xiàn)A@ZnO-MSN-ARG納米顆粒的均勻性也相對(duì)較好，粒徑增大至150 nm左右，出現(xiàn)大量橢球形顆粒，表面略粗糙(圖2b)。

2.2.2 TEM分析(圖3)

圖3 FA@ZnO-MSN(a)、FA@ZnO-MSN-ARG(b)的TEM照片F(xiàn)ig.3 TEM images of FA@ZnO-MSN(a) and FA@ZnO-MSN-ARG(b)

從圖3可知，載藥前，F(xiàn)A@ZnO-MSN納米顆粒中存在大量相對(duì)有序的通孔(圖3a)；載藥后，F(xiàn)A@ZnO-MSN-ARG納米顆粒中有序貫穿孔道變少，甚至幾乎不可見(圖3b)。這是因?yàn)?，在載藥體系的制備過程中大量牛蒡苷元吸附到MSN的孔中，且ZnO納米粒子作為分子開關(guān)也堵在MSN的孔口。

2.2.3 XRD分析(圖4)

從圖4可知，F(xiàn)A@ZnO-MSN-ARG納米顆粒在2θ為2.5°左右有一個(gè)較強(qiáng)的衍射峰，該峰對(duì)應(yīng)于(100)晶面，是六方結(jié)構(gòu)介孔材料最主要的特征峰，該衍射峰較強(qiáng)，表明制備的材料有序度較高，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，骨架沒有崩塌，說明MSN經(jīng)修飾和載藥后依然能夠保持較高的結(jié)晶性；與未經(jīng)修飾的MSN相比，F(xiàn)A@ZnO-MSN-ARG納米顆粒在2θ為4°～5°之間的(100)和(200)衍射峰削弱了很多，說明MSN的修飾和載藥效果已經(jīng)達(dá)成，且沒有破壞整體結(jié)構(gòu)，仍然具有MSN納米介孔材料結(jié)構(gòu)的特征。

圖4 FA@ZnO-MSN-ARG的XRD圖譜Fig.4 XRD pattern of FA@ZnO-MSN-ARG

2.2.4 N2吸附-脫附曲線(圖5)

圖5 FA@ZnO-MSN-ARG的N2吸附-脫附曲線(a)和孔徑分布曲線(b)Fig.5 N2 adsorption-desorption curve(a) and pore size distribution curve(b) of FA@ZnO-MSN-ARG

從圖5a可知，F(xiàn)A@ZnO-MSN-ARG的BET比表面積為104.98 m2·g-1，其比表面積相對(duì)載藥前降幅較大。此外還可以觀察到，F(xiàn)A@ZnO-MSN-ARG的N2吸附-脫附曲線為Ⅳ型，具有介孔材料的吸附-脫附曲線特征，載藥后的結(jié)構(gòu)仍然比較穩(wěn)定，整體結(jié)構(gòu)沒有被破壞。從圖5b可知，經(jīng)修飾、載藥后，F(xiàn)A@ZnO-MSN-ARG的孔徑分布較窄，主要在1.93～2.56 nm之間，平均孔徑為1.96 nm。

2.3 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的載藥性能

分2組檢測(cè)(即牛蒡苷元與載體比例R為0.5和1.0)3個(gè)載藥體系MSN-ARG、FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG的載藥率和包封率，結(jié)果見表1。

從表1可知，隨著牛蒡苷元與載體比例的增加，載藥體系MSN-ARG、FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG的載藥率升高，其中FA@ZnO-MSN-ARG的載藥率最高；但隨著牛蒡苷元與載體比例的增加，載藥體系MSN-ARG、FA-MSN-ARG的包封率下降，F(xiàn)A@ZnO-MSN-ARG的包封率升高。

表1 不同載藥體系的載藥率和包封率Tab.1 Drug loading ratio and encapsulation efficiency of different drug delivery systems

2.4 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的釋藥性能(圖6)

圖6 FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG-GSH在pH值7.4下的體外釋藥曲線Fig.6 In vitro drug release curves of FA-MSN-ARG,FA@ZnO-MSN-ARG,and FA@ZnO-MSN-ARG-GSH at pH value of 7.4

從圖6可知，載藥體系FA-MSN-ARG因?yàn)闆]有封堵，釋藥速率較快，在0～16 h釋藥率達(dá)到48.30%；而后釋藥率緩慢升高，在24 h達(dá)到最高，為50.50%，具有一定的緩釋作用，但考慮到藥物在傳遞過程中釋放的損耗，真實(shí)作用于腫瘤細(xì)胞的藥物含量會(huì)大大降低。載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG在0～6 h釋藥速率較快，釋藥率達(dá)到16.92%；在36 h時(shí)釋藥率達(dá)到最高，僅為19.05%，而后保持不變。模擬載藥體系進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)釋藥情況，在載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG中加入GSH，發(fā)現(xiàn)牛蒡苷元的釋藥率明顯升高，在12 h內(nèi)釋藥速率較快，較載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG明顯加快，在36 h時(shí)釋藥率達(dá)到最高，為39.25%。

3 結(jié)論

通過溶膠-凝膠法成功制備了裝載牛蒡苷元的納米載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG，隨著牛蒡苷元與載體比例的增加，載藥體系MSN-ARG和FA-MSN-ARG的載藥率升高、包封率降低，載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的載藥率和包封率遠(yuǎn)高于MSN-ARG、FA-MSN-ARG；在載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG中加入谷胱甘肽(GSH)，牛蒡苷元的釋藥率明顯升高，在12 h內(nèi)釋藥速率較快，在36 h時(shí)釋藥率達(dá)到最高，為39.25%。該載藥體系具有緩釋、控釋效果，為牛蒡子的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。