王少華 趙國連 王佩 談小文 崔曉利 康磊 黨麗云

近年來，耐藥結核病患者的增多給結核病的防控工作帶來重大威脅，對結核病耐藥性及時準確的診斷和治療是控制耐藥結核病傳播的重要手段之一。目前對于結核分枝桿菌(MTB)耐藥性的檢測分為基因型藥敏檢測和表型藥敏檢測(phenotypic drug susceptibility testing，pDST)。傳統(tǒng)的pDST受到培養(yǎng)基上MTB生長速度的限制，一般需要4～6周才能獲得耐藥性結果，這使得患者病情延誤，還增加了耐藥結核病傳播的風險[1]。近幾年，多種基因型藥敏試驗如熒光PCR探針熔解曲線法(簡稱“熔解曲線法”)、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)通過檢測利福平耐藥性決定區(qū)域rpoB基因(RRDR)內的突變來檢測利福平耐藥性[2-3]。與傳統(tǒng)的pDST方法相比，熔解曲線法檢測能夠在短時間內完成耐藥篩查，為患者的精準治療提供了便捷。然而，目前對于基因型和pDST檢測利福平藥敏試驗結果不一致的情況成為結核病診斷治療中的一個新的難題。

目前有研究顯示不同耐藥基因突變會導致結核分枝桿菌不同的耐藥水平，例如Leu511Pro、His526Asn和Asp516Tyr等突變會導致利福平低水平耐藥，這些低水平耐藥菌株或許是造成基因型與pDST結果不一致的主要原因[4]。因此，本研究對熔解曲線法與微孔板法利福平藥敏試驗結果不一致菌株進行了回顧性分析，通過對基因測序分析rpoB基因不同突變位點與耐藥結果不一致的相關性，以揭示與使用熔解曲線法和微孔板法獲得的不一致利福平藥敏試驗結果有關的因素。

資料和方法

一、資料來源

收集2019年8月至2020年9月西安市胸科醫(yī)院收治的培養(yǎng)陽性結核病患者資料，共2562例。其中1298例患者用同一份痰液標本同時進行pDST和熔解曲線法耐藥基因檢測，再根據病例篩選出基因型與pDST利福平耐藥結果不一致的患者54例?；蛐退幟羰遣捎萌劢馇€法獲得，pDST采用分枝桿菌藥敏微孔板法獲得。對所有不一致分離株重復進行微孔板法，以及對rpoB基因的部分DNA片段使用Sanger測序。

二、實驗方法

1.標本處理：痰標本使用N-乙?；?L-半胱氨酸-氫氧化鈉消化15 min,然后加入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值為7.0),3000×g離心15 min,將沉淀再次懸浮于2 ml PBS緩沖液中備用。取處理后標本0.5 ml接種在BACTEC MGIT 960分枝桿菌生長指示管中進行培養(yǎng)，另取0.5 ml進行MTB核酸提取。

2.分離培養(yǎng)：痰液標本經處理接種于BACTEC MGIT 960分枝桿菌生長指示管(美國BD公司)，然后在BACTEC MGIT 960儀器(美國BD公司)中孵育，儀器報陽后按照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》[5]要求進行涂片萋尼染色鏡檢，確認分枝桿菌生長。并采用MTB64抗原檢測試劑(杭州創(chuàng)新生物檢控技術有限公司)鑒定結核分枝桿菌。

3.pDST試驗：pDST是采用分枝桿菌藥敏試劑盒(培養(yǎng)法)(珠海市銀科醫(yī)學工程股份有限公司)對患者痰液標本培養(yǎng)所得MTB陽性菌液進行微孔板法的pDST檢測。對利福平提供1.0、2.0、4.0和8.0 μg/ml藥物濃度進行微孔板稀釋法體外藥敏檢測。按照制造商操作手冊進行操作。根據中國食品藥品監(jiān)督管理局批準的制造商說明，微孔板法利福平判讀標準為：1.0 μg/ml敏感，2.0 μg/ml敏感，4.0 μg/ml耐藥，8.0 μg/ml耐藥。每批次微孔板法試驗均用MTB標準參考菌株(H37Rv標準株)進行同步室內質量控制。

4.基因型藥敏試驗：熔解曲線法耐藥基因檢測采用結核分枝桿菌耐藥基因突變檢測試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)對患者痰液標本提取的MTB陽性核酸進行耐藥性檢測。根據制造商說明書進行試驗操作。結果判斷參考試劑說明書：通過結核分枝桿菌rpoB基因507～533共27個氨基酸密碼子的突變判定利福平耐藥性；比較檢測樣品與陽性對照之間熔解曲線的熔點(Tm值)的差異判斷樣品是否發(fā)生突變。

5.rpoB基因測序及分析：應用煮沸法對培養(yǎng)后的細菌提取基因組DNA。參考以往報道[6]將提取后DNA核酸應用引物rpoB-F (5′-CTTGCACGA-GGGTCAGACCA-3′)和rpoB-R (5′-ATCTCGTC-GCTAACCACGCC-3′)進行擴增，擴增程序為95 ℃ 5 min 預變性，95 ℃ 30 s變性, 60 ℃ 30 s退火和72 ℃ 45 s延伸，共擴增35個循環(huán)。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳確認后送檢生工生物工程有限公司(上海，中國)進行Sanger測序分析。測序結果應用MEGA-X軟件以H37Rv標準菌株進行序列比對。本研究是基于大腸桿菌編號系統(tǒng)進行分析。

結 果

一、兩種檢測方法利福平耐藥檢測結果

1294例結核病患者在西安市胸科醫(yī)院同時進行熔解曲線法耐藥基因檢測和微孔板法藥敏檢測，其中熔解曲線法檢測206例(15.92%)為突變型，微孔板法檢測169例(13.06%)為耐藥型。54例(4.17%)熔解曲線法耐藥基因檢測與微孔板法檢測結果不一致的患者中，45例為熔解曲線法檢測突變而微孔板法檢測敏感，8例為熔解曲線法檢測野生型而微孔板法檢測耐藥。其中1例在熔解曲線法耐藥基因檢測中顯示異質性耐藥而微孔板法顯示敏感，未納入分析。對納入分析的53株菌株進行微孔板法藥敏的復核，發(fā)現除1株菌株丟失未進行復核和1株結果無效外，其余結果與首次的微孔板法結果相同。且8株熔解曲線法檢測野生型而微孔板法檢測耐藥的菌株全部為同時耐異煙肼的耐多藥菌株。

二、熔解曲線法檢測rpoB突變區(qū)域與微孔板法 MIC結果分析

熔解曲線法檢測到的206例突變型，其中rpoB基因507～512位密碼子突變占16.50%(34/206)，rpoB基因513～520位密碼子突變占3.40%(7/206)，rpoB基因521～528位密碼子突變占14.56%(30/206)，rpoB基因529～533位密碼子突變占57.77%(119/206)，另有16例多位點突變；其中rpoB基因在507～512位密碼子發(fā)生突變時，其與微孔板法結果不一致率最高，為70.59%(24/34)，且不一致的菌株微孔板法MIC的測定值多分布在≤1 μg/ml。當rpoB基因在529～533位密碼子發(fā)生突變時，其與微孔板法結果不一致率最低，為6.72%(8/119)(表1)。

表1 熔解曲線法檢測rpoB突變區(qū)域與微孔板法MIC結果分析

三、基因型與pDST不一致菌株rpoB基因突變位點分布

本研究對納入分析的53株不一致分離株rpoB基因的部分DNA片段使用Sanger測序。在熔解曲線法突變而微孔板法敏感的45株菌株中rpoB基因RRDR序列均發(fā)現了突變，42株菌株為單位點突變，3株菌株發(fā)生了2～3個位點突變。其中Leu511Pro是觀察到最多的突變位點，占所有不一致菌株的45.28%(24/53)，集中在熔解曲線法檢測突變區(qū)域的507～512位密碼子，另外還有2株多位點突變菌株也發(fā)生了Leu511Pro突變；其次觀察到較多的突變是Leu533Pro，占所有不一致菌株的15.09%(8/53)，Asp516Tyr 和His526Asn突變率均為5.66%(3/53)；rpoB基因Leu511Pro、Leu533 Pro、Asp516Tyr 和His526Asn是導致熔解曲線法與微孔板法藥敏結果不一致的主要突變點，占測序結果突變而微孔板法敏感菌株的84.44%。8株熔解曲線法檢測敏感而微孔板法檢測耐藥的菌株進行測序，結果顯示rpoB基因區(qū)域未發(fā)生突變。本研究未發(fā)現RRDR區(qū)域內的同義突變和沉默突變(表2)。

討 論

近幾年，隨著熔解曲線法、Xpert等多種MTB基因型藥敏試驗的廣泛應用，明顯提高了利福平耐藥結核病的診斷與管理水平[7]。然而隨之出現的MTB利福平基因型和pDST檢測不一致結果成為結核病診斷治療的一個新難題。筆者回顧性分析了53例利福平熔解曲線法與微孔板法藥敏結果不一致患者的標本，通過rpoB基因測序，以評估不同基因突變位點與不一致結果的相關性。

本研究收集的54例熔解曲線法基因型與微孔板法表型檢測利福平耐藥結果不一致的患者資料。為了驗證微孔板法藥敏結果的可靠性，筆者對53例結果不一致的菌株進行微孔板法藥敏試驗，結果顯示熔解曲線法檢測突變型而微孔板檢測敏感的45例菌株重復實驗均為敏感， 8例熔解曲線法檢測野生型而微孔板法檢測耐藥患者均為耐藥，且全部為同時對異煙肼耐藥的耐多藥菌株。分析這8例患者熔解曲線檢測敏感的原因可能為該菌株有發(fā)生在RRDR區(qū)域外的其他突變，據報道只有95%的利福平耐藥分離株在rpoB基因的81 bp熱點區(qū)域內發(fā)生突變[8]，剩余5%的耐藥性可能由其他位點突變或者存在其他對利福平耐藥的機制,比如MTB外排泵基因的過表達[9]。

研究中值得注意的是，當熔解曲線法檢測rpoB基因在507～512位密碼子發(fā)生突變時，其與微孔板法結果不一致率高達70.59%，且不一致的菌株在微孔板法中MIC的測定值多分布在≤1 μg/ml。Miotto等[10]對意大利地區(qū)的研究顯示,與pDST結果相比有爭議的突變位點為511、516、526、533密碼子，與本文的研究相似，且與無爭議的位點相比較，表現出更低的MIC值，和本文結論不同的是其與pDST結果比較不一致率最高的突變位點為526位密碼子。國內也有報道MIC的測定值在≤1 μg/ml的菌株在所有不一致菌株中占比較大，且Leu511Pro為觀察到的導致這種不一致結果的最常見的突變[11]。后者與本文研究結果相似。分析兩者不同的原因可能與地域差異有關。由于在臨床工作中，熔解曲線檢測方法結果回報時間往往早于微孔板法檢測，這提示我們在臨床工作中要高度重視熔解曲線法507～512位密碼子突變的菌株，這些患者極有可能會出現基因型與pDST結果不一致的情況，有必要觀察利福平對結核病患者的療效并及時調整用藥方案。另外，目前對于熔解曲線法耐藥檢測結果的報告格式，很多醫(yī)院僅給予耐藥或者敏感的結論是不夠的，實際工作中檢驗科應該出具包含耐藥突變區(qū)域的報告單以對臨床提供參考。甚至還可以通過提供不同區(qū)域的ΔTm值來初步評估可能出現的突變位點，正如有研究顯示，在不同區(qū)域及不同位點發(fā)生的突變所對應的ΔTm均有所差異[12]。

本研究顯示rpoB基因Leu511Pro、Leu533 Pro、Asp516Tyr 和His526Asn是導致熔解曲線法與微孔板法結果不一致的主要突變點，占測序結果突變而微孔板法敏感菌株的84.44%。Huo等[11]研究顯示Leu511Pro、Leu533 Pro、His526Leu、Asp516Tyr是導致基因型與pDST結果不一致的主要突變位點，和本研究結果相似。然而，由于測序的樣本量有限或者地區(qū)分布原因，Shea等[13]研究RRDR內不會出現影響利福平耐藥的非同義突變(Thr427Ala)和沉默突變(Thr427Thr和Arg447Arg)。本研究未發(fā)現此結論。多項研究顯示這些特定位點的突變，會導致突變菌株出現低水平耐藥[11,14]。但是對于Leu533Pro突變的發(fā)生，前者MIC值為≤0.25 μg/ml，表現為敏感，而后者的研究中顯示Leu533Pro突變的MIC值為1～4 μg/ml，表現為低水平耐藥。所以對上述位點的突變所對應的MIC值還需要進一步數據的驗證。

Rigouts等[15]研究顯示，除了突變位點的影響因素，不同的pDST方法也會對以上位點突變的菌株呈現不一致的結果，對位于密碼子Lys513Pro 和Leu531Trp的突變，羅氏固體比例法藥敏試驗和BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗結果完全一致，以上突變在兩種方法中均表現為耐藥。然而對于Leu511Pro，Asp516Tyr， Leu533 Pro，Ile572Phe突變，羅氏固體比例法藥敏試驗和BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗結果高度不一致，常表現為固體比例法結果為耐藥而BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗結果為敏感，這樣導致BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗對部分耐藥菌株發(fā)生漏檢。而目前尚未有微孔板法藥敏試驗與固體藥敏對以上突變位點利福平耐藥結果的差異性研究，本研究使用的微孔板法藥敏試驗是否因為方法學而導致基因型與pDST結果不一致還值得進一步深入研究。

本研究的局限性：(1)微孔板藥敏檢測試劑盒雖然經過了中國食品藥品監(jiān)督管理局的批準，但是其基于肉湯培養(yǎng)基的微量稀釋法與WHO推薦的臨界濃度(1 μg/ml)存在一定的系統(tǒng)差異。(2)熔解曲線法雖然在耐藥結核病的診斷上應用廣泛，但是其對于細菌低載量的標本無法得到有效檢測結果，這也使得我們的研究無法評估細菌低載量標本的一致性。(3)部分rpoB基因測序，而不是全基因組測序可能會漏掉RRDR區(qū)域之外的耐藥性突變，對于基因型敏感而表型耐藥的菌株解釋不到位。(4)熔解曲線法能夠清晰地辨別異質性耐藥，當結核分枝桿菌復合群內同時存在敏感菌和耐藥菌時，結果會呈現2個不同的峰線[2]。本研究中出現1例熔解曲線法檢測出異質性耐藥而微孔板法檢測為敏感的患者標本。然而微孔板法作為pDST的檢測方法，并不能檢測出異質性耐藥，故此例患者標本未納入比較分析。這可能是因為樣本中耐藥菌株比例過低引起的，也提示在解釋基因型與pDST不一致的結果時，不能排除異質性耐藥的影響。

綜上，引起結核分枝桿菌基因型與表型利福平藥敏試驗結果不一致的rpoB基因主要突變位點為Leu511Pro、Leu533 Pro、Asp516Tyr和His526Asn。這些突變位點的描述可以解釋臨床工作中遇到的不一致的藥敏試驗結果。同時也亟需一個新的臨界濃度來區(qū)分利福平敏感與耐藥，以便更好的治療利福平耐藥患者。