武杰瑞， 劉秉毅， 特木爾布和, 爽 爽, 代 蕊, 張志強

(內蒙古農業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院， 內蒙古 呼和浩特 010000)

苜蓿(MedicagosativaL.)具有高產優(yōu)質、適應性強等特點，是我國草牧業(yè)發(fā)展的重要物質基礎。隨著國家“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動”計劃的實施及“糧改飼”政策的推動下，我國苜蓿種植面積逐年增加。然而，在生產栽培過程中，蟲害嚴重影響苜蓿產量和品質。目前我國已報道的苜蓿害蟲共計297種，分屬于8個目的48個科[1]，薊馬已經成為苜蓿生產的主要害蟲之一[2-3]。薊馬以特有的銼吸式口器通過銼破植物表皮，吸吮汁液導致植株枯萎，同時還傳播包括番茄斑萎病毒在內的多種病毒[4]。據報道，每年能造成高達30%苜蓿草產量損失[5]。因此,開展苜蓿抗薊馬機理研究具有重要的經濟意義與生態(tài)意義。

為抵抗昆蟲的危害，植物在長期進化過程中形成了復雜的防御體系，包括組成型防御和誘導型防御[6]。誘導型防御是指植物在遭受病蟲危害后形成的防御機制，組成型防御體系分為物理防御和化學防御，化學防御是指植物利用自身的一些化學物質使昆蟲趨避、拒食、中毒和生長發(fā)育受抑制的防御措施。這些化學物質主要有兩類，一類是核酸、蛋白質、氨基酸、脂類等營養(yǎng)物質，另一類主要是植物的次生代謝物。研究表明，植物次生物質如生物堿、酮類、單寧類、萜類、黃酮類、有機酸等是植物抗蟲性的重要組成部分[7]，但這些生化因子有時會對植物的產量和營養(yǎng)品質產生影響。營養(yǎng)物質諸如氨基酸、磷脂、脂肪酸、類固醇和抗壞血酸也會不同程度的影響植物的抗蟲性[8-9]。一些必須氨基酸對昆蟲的生長發(fā)育和生命過程至關重要，昆蟲需要通過從植物中攝取這些氨基酸來維持自身的生長發(fā)育需要。在長期的協(xié)同進化過程中，植物也形成了通過調節(jié)自身氨基酸含量和組成來抵御蟲害的能力。研究表明，具有抗病蟲害能力的植物通常含有較高水平的酚類化合物和較低水平的氨基酸[10]。此外，氨基酸組成的不同，也會影響植物的抗蟲性。水稻(OryzasativaL.)莖稈中賴氨酸、精氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量高低與稻螟蟲生長呈正相關，谷氨酸、蘇氨酸含量高低與稻螟蟲生長呈負相關[11]。不同品系的楊樹(PopulusL.)木質部中丙氨酸、精氨酸、谷氨酸等氨基酸相對含量越高，青楊脊虎天牛(Xylotrchusrusticus)危害越嚴重[12]。然而，有關氨基酸含量及組成對于不同昆蟲與植物之間的相關研究依然較少。

特木爾布和等[13]研究發(fā)現，‘草原2號’苜蓿(MedicagovariaMartin.‘Caoyuan No.2’)的蟲情指數為0.901，為害點系數為0.61；‘草原4號’苜蓿(MedicagosativaL.‘Caoyuan No.4’)的蟲情指數僅為0.334，為害點系數為0.26，當蟲情指數低于0.5時表明品種為抗蟲品種。因此本研究以‘草原2號’感薊馬品種和‘草原4號’抗薊馬品種為材料，分別進行牛角花齒薊馬(Odontothripsloti)接蟲和不接蟲處理，分析不同處理后苜蓿葉片中氨基酸和氨基酸衍生物的種類及含量變化，探究不同氨基酸及氨基酸衍生物與苜?？顾E馬機制的關系，為薊馬防治及抗薊馬育種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

供試苜蓿材料為‘草原2號’(MedicagovariaMartin.‘Caoyuan No.2’)和‘草原4號’苜蓿(MedicagosativaL.‘Caoyuan No.4’)，供試蟲源為實驗室飼養(yǎng)的牛角花齒薊馬(Odontothripsloti)成蟲。在人工氣候室種植‘草原2號’和‘草原4號’苜蓿各20盆，每盆3株，晝夜平均氣溫分別控制在(30±5)℃，(20±5)℃，晝夜相對濕度控制在(55±5)%，(70±5)%，保證所有材料生長環(huán)境一致。待苜蓿生長60 d后，接入牛角花齒薊馬成蟲，每盆50頭，并用防蟲網罩住。分別記為：‘草原2號’接蟲(2-T)、‘草原4號’接蟲(4-T)，‘草原2號’未接蟲(2-CK)和‘草原4號’未接蟲(4-CK)。接蟲7 d后，取供試苜蓿材料倒四葉，測定氨基酸含量及氨基酸衍生物，3次重復。

1.2 試驗方法

1.2.1氨基酸含量測定 采用氨基酸分析儀(L8900，日本日立公司)測定樣品中的氨基酸含量。將苜蓿葉片烘干粉碎，準確稱取0.1 g(精確至0.0001 g),將稱量好的樣品置于水解管中，在水解管中先加入10 mL 6 mol·L-1的鹽酸溶液，再加入苯酚3滴，將水解管放入冷凍劑中冷凍3～5 min，然后對水解管重復抽真空充氮氣3次后密封，將已封口的水解管放在110℃電熱鼓風恒溫箱內，水解22 h，冷卻，過濾后定容至50 mL。準確吸取1.0 mL濾液于試管中，用平行蒸發(fā)儀在45℃加熱條件下減壓干燥，蒸干后加入2.0 mL pH值2.2檸檬酸鈉緩沖液，震蕩混勻，0.22 μm濾膜過濾，作樣品測定液，供儀器測定使用，以外標法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸濃度。色譜條件：柱溫57℃；茚三酮流速0.4 mL·min-1；緩沖液流速：0.4 mL·min-1；進樣量：20 μL[14-16]。

1.2.2氨基酸衍生物含量測定 采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜儀(1290/6460，美國Agilent公司)測定樣品中的氨基酸衍生物含量。色譜條件：色譜柱為Waters HILIC柱(3 μm,2.1×100 mm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速為400 μL·min-1，梯度洗脫條件為0～10 min A相從5%梯度升至95%并保持4～14 min，柱溫30℃，進樣量為2 μL。質譜條件為：ESI電噴霧離子源，掃描方式為多反應監(jiān)測模式，干燥氣流速8 L·min-1，干燥器溫度350℃，鞘氣流速10 L·min-1，鞘氣溫度350℃，錐孔電壓25 Psi，毛細管電壓3 500 V[17-18]。

1.3 數據統(tǒng)計

氨基酸分析儀測試數據由儀器自帶的EZChrom Elite軟件進行數據統(tǒng)計。液質聯(lián)用方法測試數據由儀器自帶的Mass Hunter定性和定量軟件進行數據統(tǒng)計。采用SPSS 19.0軟件進行數據統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析(P<0.05)比較不同處理的氨基酸含量差異。

2 結果與分析

2.1 接種薊馬后兩種苜蓿氨基酸含量分析

通過氨基酸分析儀測定了樣品中17種氨基酸的含量。如圖1所示，2-CK,4-CK和2-T,4-T的氨基酸總含量不存在顯著差異，但在受到薊馬為害后，和對照組相比，2種苜蓿的氨基酸總含量都顯著下降(P<0.05)，2-T氨基酸總含量下降29.67%，4-T氨基酸總含量下降44.28%。

圖1 牛角花齒薊馬為害7 d后苜蓿氨基酸總含量Fig.1 Total amino acid content of alfalfa damaged by Odontothrips loti after 7 days注：不同字母表示所有處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同Note:Different letters indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

在未受薊馬為害時，4-CK天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸和酪氨酸(圖2a,2b,2c,2 d)含量都顯著高于2-CK(P<0.05)，二者含量差異最大的是谷氨酸,4-CK谷氨酸含量比2-CK高38.79%；而蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、組氨酸和精氨酸含量則顯著低于2-CK(P<0.05)(圖2e,2f,2 g,2 h,2i)，二者含量差異最大的是蘇氨酸，4-CK蘇氨酸含量比2-CK低27.89%。

在薊馬為害后，與對照組相比，4-T半胱氨酸(圖3 h)含量顯著上升(P<0.05),升高了41.55%；天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸(圖2a,2b,2c,2e,2j,2l)含量顯著下降(P<0.05)，其中降低最多的是谷氨酸，達到了57.95%。2-T酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和丙氨酸(圖2d,2m,2n,2o)含量顯著上升(P<0.05),其中升高最多的是丙氨酸，達到了73.16%；天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸和纈氨酸(圖2a,2b,2c,2e,2 h,2i,2j)含量顯著下降(P<0.05)，其中降低最多的是谷氨酸，達到了46.65%。

含硫氨基酸在植物逆境抗性方面發(fā)揮著重要作用，在薊馬為害后，與對照組相比，2-T蛋氨酸(圖2 m)含量升高73.16%，半胱氨酸(圖2q)含量無顯著差異；而4-T蛋氨酸含量升高36.11%，半胱氨酸含量升高41.55%。

圖2 牛角花齒薊馬為害7 d后苜蓿17種氨基酸的含量Fig.2 Content of 17 amino acids in alfalfa damaged by Odontothrips loti for 7 days

2.2 不同處理的紫花苜蓿氨基酸衍生物含量分析

通過超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜儀在樣品中測得了93種氨基酸及其衍生物。未受到薊馬為害時，與2-CK相比，4-CK產生了11種差異氨基酸衍生物。4-CK中有6種氨基酸衍生物含量顯著高于2-CK，主要為L-半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸、L-高半胱氨酸等含硫氨基酸及左旋肌肽；有5種氨基酸衍生物含量顯著低于2-CK(P<0.05)，主要包括苯乙酰甘氨酸和N-苯乙?；?L-谷氨酰胺(表1)。

表1 未受薊馬為害苜蓿差異氨基酸衍生物的含量Table 1 Content of different amino acid derivatives in health alfalfa

與2-CK相比，2-T產生了23種差異氨基酸衍生物，其中17種氨基酸衍生物顯著下調，6種氨基酸衍生物顯著上調(P<0.05)。下調氨基酸衍生物主要為L-丙氨酸、L-天冬氨酸等營養(yǎng)物質及谷胱甘肽還原型，上調氨基酸衍生物主要為L-半胱氨酸、L-高半胱氨酸、左旋肌肽、苯乙酰甘氨酸和N-苯乙?；?L-谷氨酰胺等含硫或苯環(huán)的氨基酸(表2)。

表2 牛角花齒薊馬為害7 d后‘草原2號’苜蓿差異氨基酸衍生物的含量Table 2 Different amino acid derivatives content of ‘Caoyuan No.2’ alfalfa damaged by Odontothrips loti for 7 days

與4-CK相比，4-T產生了7種差異氨基酸衍生物，其中5種氨基酸衍生物顯著下調，2種氨基酸衍生物顯著上調(P<0.05)。下調氨基酸衍生物主要包括谷胱甘肽還原型、氧化谷胱甘肽、S-甲基谷胱甘肽等谷胱甘肽代謝通路相關氨基酸及其衍生物，上調氨基酸及其衍生物主要為苯乙酰甘氨酸和N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺2個含苯環(huán)氨基酸(表3)。

表3 牛角花齒薊馬為害7 d后‘草原4號’苜蓿差異氨基酸衍生物的含量Table 3 Different amino acid derivatives content of ‘Caoyuan No.4’ alfalfa damaged by Odontothrips loti for 7 days

3 討論

植物在長期的進化過程中對昆蟲、病原菌以及植食性動物取食形成了多種防御機制，植物抗蟲防御機制的解析對于抗蟲品種選育和害蟲的綜合防治具有重要的理論意義。通過加性遺傳方差分析發(fā)現，植物對薊馬的抗性是可遺傳的[19]，這種遺傳效應包括植物的物理防御和化學防御。當苜蓿受到薊馬為害時，苜蓿中的蛋白質、胡蘿卜素等營養(yǎng)物質含量下降，總酚、單寧、木質素等含量均升高[20-21]。

植物組織中的氨基酸為植食性昆蟲生長發(fā)育提供必不可少的營養(yǎng)物質。本試驗中，在薊馬為害后，‘草原2號’和‘草原4號’的氨基酸總含量都顯著下降(P<0.05)，可能是由于薊馬取食苜蓿葉片降低了苜蓿葉片中營養(yǎng)物質含量，導致氨基酸總量降低。研究表明，植物在受到病蟲害脅迫時，抗病蟲能力強的植物品種通常氨基酸總含量較低，低濃度氨基酸會抑制昆蟲的生長發(fā)育[22]，‘草原4號’在薊馬取食后具有更低氨基酸含量，推測與其較強的抗薊馬性有關。

研究發(fā)現，高濃度的天冬氨酸和谷氨酸可以導致桃蚜(Myzuspersicae)和煙粉虱(Bemisiatabaci)死亡率到達94%以上[23]。本試驗結果表明，在未受薊馬為害時，‘草原4號’天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸和酪氨酸含量都顯著高于‘草原2號’(P<0.05)；在薊馬為害后，‘草原2號’和‘草原4號’的天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸和纈氨酸含量都顯著下降(P<0.05)。據此推測，抗薊馬品種‘草原4號’葉片中高含量的天冬氨酸和谷氨酸可能不利于薊馬的生長發(fā)育，進而提高了其抗蟲性。

劉旭明等[24]研究發(fā)現，棉花(Gossypiumspp.)在受到蚜蟲(Aphidoidea)的脅迫時，棉株中脯氨酸含量大幅升高，從而提高棉花對蚜蟲的抗性。此外，Bt抗蟲棉葉片Bt毒素含量與天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和精氨酸及其濃度密切相關[25]。本研究中，薊馬為害后，‘草原2號’和‘草原4號’的脯氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸含量都有不同程度的上升，因此脯氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸的濃度也可能與苜蓿的抗薊馬性有關。

硫元素對于植物的抗病蟲能力起著重要作用[26]。在薊馬為害后，‘草原2號’蛋氨酸含量顯著上升(P<0.05)，‘草原4號’半胱氨酸含量顯著上升(P<0.05)，蛋氨酸含量也上升了36.11%。未受到薊馬為害時，與‘草原2號’相比，‘草原4號’的L-半胱氨酸、L-高半胱氨酸等含硫氨基酸衍生物上調?！菰?號’受到薊馬為害后，L-半胱氨酸、L-高半胱氨酸等含硫氨基酸衍生物也上調。因此，我們推測含硫氨基酸在苜蓿抗薊馬過程中具有重要作用。

‘草原2號’受到薊馬為害后產生了23種差異氨基酸衍生物，‘草原4號’受到薊馬為害后只產生了7種差異氨基酸衍生物，抗薊馬品種的氨基酸衍生物變化遠小于感薊馬品種，說明抗薊馬品種具有更強的自我緩沖能力。受到薊馬為害后2種苜蓿合成了大量的具有抗氧化能力的氨基酸衍生物，如左旋肌肽等[27]，同時合成了N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺和苯乙酰甘氨酸。因此，這些氨基酸可能同苜蓿的誘導性防御密切相關。當植物處于逆境條件下，活性氧的產生與清除的動態(tài)平衡被破壞，活性氧大量累積會損傷細胞[28]?？顾E馬苜蓿品種可以及時清除體內的活性氧使其保持在較低水平[29]。谷胱甘肽及其衍生物是植物清除活性氧的一種信號傳導物質[30]，這種調節(jié)機制可能來源于抗蟲品種合成了更多抗氧化功能的氨基酸衍生物，如谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸等。本研究發(fā)現，谷胱甘肽還原型、氧化谷胱甘肽、S-甲基谷胱甘肽等與谷胱甘肽代謝通路相關的氨基酸及其衍生物在收到薊馬為害后顯著下調，說明谷胱甘肽代謝通路可能同苜蓿抗薊馬密切相關。

本試驗探究了牛角花齒薊馬為害后，抗薊馬苜蓿和感薊馬苜蓿葉片中氨基酸及氨基酸衍生物種類和含量的變化，以及各種氨基酸含量變化與苜?？顾E馬的關系。但是對于氨基酸及氨基酸衍生物發(fā)揮的具體作用分析較少，后續(xù)將結合本試驗的結果，繼續(xù)深入探究。

4 結論

綜上所述，抗薊馬苜蓿和感薊馬苜蓿氨基酸總含量無顯著性差異。薊馬取食可以導致苜蓿葉片氨基酸總含量顯著下降，其中主要包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸和纈氨酸。相較于感薊馬材料，抗薊馬品種的天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸和酪氨酸含量較高，蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、組氨酸和精氨酸含量較低。含硫或含苯環(huán)氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、苯乙酰甘氨酸和N-苯乙?；?L-谷氨酰胺可能與苜蓿誘導性薊馬防御反應有關；谷胱甘肽還原型、氧化谷胱甘肽、S-甲基谷胱甘肽等谷胱甘肽代謝通路相關的氨基酸的變化說明谷胱甘肽可能同苜蓿的抗薊馬性密切相關。