胡康棣, 趙玉琪, 姚改芳, 周志林, 唐 君, 張 華

(1.合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601; 2.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所,江蘇 徐州 221131)

甘薯的栽培歷史悠久,是世界第七大重要的糧食作物[1],因其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適應性強、易于管理、營養(yǎng)豐富而在全球推廣。目前國內的甘薯栽培品種繁多,各地區(qū)氣候及栽培方法差異較大,在塊根大小、形狀、薯皮顏色等方面均有差異[2]。甘薯貯藏是甘薯生產(chǎn)銷售過程中的一個重要環(huán)節(jié),貯藏根是甘薯生產(chǎn)中最重要的經(jīng)濟農(nóng)藝性狀,主要用于自身營養(yǎng)儲存和繁殖[3],也是人們食用的主要部位[4]。甘薯貯藏根中的水分和碳水化合物含量很高,表皮較薄,收獲后有很強的呼吸代謝,由此產(chǎn)生的熱量會加速塊根的質地軟化和腐爛進程。因此,收獲后貯藏條件不合適,會導致甘薯很容易腐爛變質[5]。文獻[6]在美國調查甘薯運輸、貯藏、加工等一系列銷售環(huán)節(jié)時發(fā)現(xiàn),在各個環(huán)節(jié)中因貯藏不當造成的損失約為總量的25%,其中在批發(fā)和銷售過程中損失約占總量的19%;在我國,甘薯在貯藏過程中因腐敗變質造成的損失約為總量的30%[7]。

影響甘薯貯藏的因素很多,除溫度、濕度、空氣、微生物病害、機械損傷等外部條件外,甘薯內部過多的活性氧(ROS)也會通過氧化應激對其造成膜脂過氧化、酶活性喪失、核酸結構破壞等[8-10]。研究表明,在果蔬采后貯藏過程中,活性氧積累是導致果蔬采后衰老的重要因素。龍眼果實在貯藏期間出現(xiàn)活性氧積累、膜結構破壞等現(xiàn)象[11];活性氧積累是導致荔枝質膜受損及代謝失衡的重要原因[12]。此外,采后枇杷ROS代謝失衡削弱了果皮的保護能力,導致果實內外環(huán)境的惡化,與枇杷采后衰老變質有關[13]。脂氧合酶(LOX)也會對甘薯脂質過氧化產(chǎn)生影響[14],膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物是丙二醛(MDA)[15],因此LOX活性水平和MDA含量是反映植物氧化程度的重要指標[16]。膜脂過氧化會導致甘薯產(chǎn)生不良風味和顏色,導致甘薯質量和營養(yǎng)價值的下降,貯藏時間縮短等問題[17]。植物的抗氧化酶系統(tǒng)是其自身在長期進化過程中形成的對外界不良環(huán)境脅迫和衰老所產(chǎn)生的自我保護系統(tǒng),能夠轉移、消除活性氧及氧化中間產(chǎn)物,在果實采后衰老進程中起著十分重要的作用[18]。

甘薯對于貯藏條件要求比較高,在運輸和貯藏過程中損失較大,這嚴重限制了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文研究不同品種的甘薯在耐貯性、ROS、抗氧化酶、MDA、LOX等相關指標的差異,為甘薯耐貯藏品種的選育提供理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗甘薯材料為徐55-2(品種1)、徐32(品種2)、Z15-1(品種3)、美99573(品種4)、商薯9號(品種5)、Sinjami(品種6)、徐22-5(品種7)、Z11-1(品種8)、煙25(品種9)、徐薯23(品種10),均由江蘇省徐州市國家甘薯改良中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 超氧陰離子產(chǎn)生速率的測定

超氧陰離子(·O2-)產(chǎn)生速率的測定參照文獻[19]方法。稱取甘薯葉片0.5 g,加入5 mL 200 mmol/L的4 ℃預冷的PBS緩沖液(pH 值為7.0),研磨至勻漿并于4 ℃、10 000g離心30 min,上清液即為待測液。取待測液和1 mmol/L鹽酸羥胺各1 mL混勻,30 ℃水浴30 min,再加入各1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸和7 mmol/L α-萘胺溶液混勻,25 ℃保溫20 min,8 000g離心5 min,取上清液于530 nm處測定其吸光度。同時,以NaNO2制備NO2-標準曲線,根據(jù)回歸方程計算出樣品中·O2-的產(chǎn)生速率。

1.2.2 MDA的量測定

參照文獻[20]方法,稱取1 g甘薯葉片,加入5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液,于研缽研磨成勻漿后,于4 ℃、10 000g離心20 min,收集上清液,低溫保存?zhèn)溆谩Ｈ? mL上清液(對照空白管中以100 g/L三氯乙酸溶液代替),加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸溶液,混合均勻后沸水水浴20 min,取出冷卻至室溫后10 000g離心20 min,取上清液,分別測定其在450、532、600 nm處的吸光度。根據(jù)回歸方程計算出反應混合液中MDA的量。

1.2.3 過氧化氫產(chǎn)生速率的測定

參照文獻[21]方法,將2 g的甘薯葉片在液氮中研磨并在3 mL預冷(-20 ℃)丙酮中萃取,10 000g離心20 min取上清液,測量其在508 nm處的吸光度。

1.2.4 抗氧化相關酶活性的測定

粗酶液的制備。將2 g的甘薯葉片在3 mL 4 ℃預冷的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L苯甲烷磺酰氟、5 mmol/L抗壞血酸鈉和5%聚乙烯吡咯烷酮,pH值7.5)中勻漿,12 000g、4 ℃下離心30 min后,將上清液分成等份試樣,-80 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻[22]方法測定抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性。APX活性測定反應體系為3 mL,含有2.5 mL 50 mmol/L、pH值為7.0的PBS緩沖液(1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L 抗壞血酸、0.1 mmol/L H2O2),0.5 mL粗酶液,各成分混勻后立即于290 nm處測定其吸光度。以每min內吸光度變化0.01記為1個活性單位(U)。

過氧化物酶(POD)的活性測定參照文獻[17]方法。3 mL的反應混合液含有50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)、0.2 mmol/L愈創(chuàng)木酚和10 mmol/L H2O2。反應開始前快速加入100 μL的粗酶液啟動反應,于470 nm處測定吸光度。以每min內吸光度變化0.01記為1個酶活性單位(U)。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參照文獻 [23]方法,5 mL反應混合液中含有5 mmol/L HEPES(pH值為7.6)、0.1 mmol/L EDTA,50 mmol/L Na2CO3(pH值為10.0)、13 mmol/L蛋氨酸、0.025%Triton X-100、63 μmol NBT、1.3 μmol核黃素和酶提取液,4 000 lx日光光照15 min后測定反應液在560 nm處的吸光值。以每min每g甘薯樣品的反應體系對核黃素光化還原的抑制為50%為1個SOD活性單位(U)。

過氧化氫酶(CAT)活性測定按文獻[24]方法。反應體系為1 mL,包含150 μL的粗酶液、850 μL的反應液(10 mmol/LH2O2、30 mmol/L磷酸鉀緩沖液,pH 值為7.0)?；旌虾笤?40 nm處檢測吸光度的變化。以每min內吸光度變化0.01記為1個活性單位(U)。

1.2.5 LOX活性的測定

LOX活性測定參照文獻[25]方法。稱取甘薯樣品0.5 g,放入預冷的研缽中加入5 mL預冷的PBS緩沖液(200 mmol/L,pH 值為6.5),在冰上研磨至勻漿,轉移至10 mL離心管,4 ℃ 10 000g離心20 min,上清液即為LOX粗酶液。反應體系為PBS緩沖液(200 mmol/L,pH 值為6.5),0.25%吐溫20與0.25%亞油酸的混合物,加入適量粗酶液,于234 nm處測定其吸光度,記錄3 min內每隔10 s的吸光度。以每min內吸光度變化0.01記為1個活性單位(U)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析方法

均值及標準偏差計算及作圖采用Excel 2010,動態(tài)熱圖、組內相關性分析、主成分分析于https://www.omicshare.com/在線工具進行。

2 結果與分析

2.1 不同品種甘薯的貯藏特性分析

薯塊在溫度為11～15 ℃、相對濕度為80%～90%的甘薯庫中貯藏,貯藏6個月后觀察記錄薯塊的腐爛率,并進行分級。每個甘薯品種貯藏特性實驗包括3個生物學重復,每個生物學重復包含15個塊根。10個甘薯品種的腐爛率與貯藏特性見表1所列。

表1 10個甘薯品種的貯藏特性分析

2.2 抗氧化酶和LOX的活性分析

為研究活性氧清除能力與甘薯貯藏性能之間的關系,本文測定了不同品種甘薯葉片中抗氧化酶和LOX的活性，結果如圖1所示。

由圖1可知,耐貯藏甘薯品種(徐55-2、徐32、Z15-1、美99573、商薯9號和Sinjami)的APX活性普遍高于不耐貯藏的甘薯品種(徐22-5、Z11-1、煙25、徐薯23)的APX活性,徐55-2和商薯9號的APX活性基本一致,徐32和美99573的APX活性基本一致,且略低于徐55-2和商薯9號;耐貯藏品種徐32的CAT活性最高,與6種耐貯藏品種的CAT活性相比,不耐貯藏品種的CAT活性普遍偏低;甘薯中POD、SOD活性與APX、CAT活性結果相類似;不耐貯藏品種(徐22-5、Z11-1、煙25、徐薯23)的LOX活性明顯高于耐貯藏品種,耐貯藏品種的LOX活性均不到不耐貯藏品種的1/2。

圖1 不同甘薯品種中抗氧化酶和LOX的活性分析

總體上,與不耐貯藏品種相比,耐貯藏品種的抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性較高,有利于清除活性氧;LOX的活性較低,有利于防止不飽和脂肪酸的氧化,進而避免膜質過氧化[26]。

2.3 ROS代謝物及MDA的量分析

不同甘薯品種的ROS代謝物及MDA量的分析結果如圖2所示。

圖2 不同甘薯品種的ROS代謝物及 MDA的量分析

由圖2a、圖2b可知,與不耐貯藏品種相比,耐貯藏品種(徐55-2、徐32、Z15-1、美99573、商薯9號和Sinjami)的H2O2的量和·O2-產(chǎn)生速率更低;由圖2c可知,耐貯藏品種的MDA的量普遍低于不耐貯藏品種,但耐貯藏品種Sinjami的MDA的量略高于不耐貯藏品種煙25?？傊?與耐貯藏品種相比較,不耐貯藏品種中的H2O2、·O2-和膜質過氧化產(chǎn)物MDA的量較高。

2.4 抗氧化相關指標的相關性分析

為研究甘薯ROS代謝、抗氧化酶與甘薯貯藏特性的關系,本文進行了甘薯生理生化指標間的相關性分析，結果如圖3所示。

從圖3可以看出，抗氧化酶SOD與CAT、APX活性有著明顯的正相關,相關系數(shù)分布在0.72～0.89之間;POD與SOD、CAT、APX活性也存在正相關關系,但相關系數(shù)較弱,分布在0.33～0.46之間;LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-產(chǎn)生速率之間也存在明顯的正相關關系,相關系數(shù)分布在0.83～0.98之間;但4種抗氧化酶活性與LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-產(chǎn)生速率之間呈明顯負相關,相關系數(shù)在-0.47～-0.93之間；貯藏特性與SOD、POD、CAT、APX等抗氧化酶活性呈正相關,而與LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-產(chǎn)生速率呈負相關,表明甘薯貯藏特性和ROS代謝緊密聯(lián)系。

圖3 甘薯貯藏特性、酶活性與ROS 代謝物的相關性分析

2.5 抗氧化相關指標的主成分分析

不同甘薯品種抗氧化相關指標的主成分分析如圖4所示。

圖4 不同甘薯品種指標的主成分分析

圖4中,PC1和PC2分別表示數(shù)據(jù)的79.3%和10.7%的可變性。從圖4可以看出,在PC1中耐貯藏品種徐32、徐55-2和Z15-1之間存在明顯的聚類,與耐貯藏品種美99573、商薯9號、Sinjami之間也存在明顯的聚類。此外,不耐貯藏品種徐22-5、Z11-1、煙25也存在聚類,這表明耐貯藏品種和不耐貯藏品種在生理指標上有一定的差異。

2.6 抗氧化相關指標的熱圖分析

為更直觀地展示不同甘薯品種生理指標的差異,本文進行了熱圖分析，結果如圖5所示。從圖5可以看出,徐32、徐55-2、Z15-1、美99573和Sinjami的抗氧化酶SOD、CAT、APX、POD活性比較高,而LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-產(chǎn)生速率較低;徐22-5、Z11-1、煙25和徐23品種整體情況更為接近,即抗氧化酶活性較低,同時LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-產(chǎn)生速率明顯較高。

圖5 不同甘薯品種生理生化指標的熱圖分析

總體上,徐32、徐55-2、Z15-1、美99573、Sinjami品種表現(xiàn)出較高的抗氧化能力和較好的貯藏特性;徐22-5、Z11-1、煙25和徐23品種的抗氧化能力較低,貯藏特性較差。

3 結 論

本研究從甘薯抗氧化系統(tǒng)、腐爛率等方面綜合評價了甘薯的耐貯性,發(fā)現(xiàn)甘薯的抗氧化能力在不同品種之間有顯著差異,抗氧化酶活性高的品種,其清除ROS的能力強,耐貯藏特性更強。耐貯藏品種徐55-2、徐32、Z15-1、美99573、商薯9號、Sinjami與不耐貯藏品種徐22-5、Z11-1、煙25、徐薯23相比,具有較高的APX、POD、CAT、SOD等抗氧化酶活性和較低的LOX活性。同時,耐貯藏品種中表現(xiàn)出較低的ROS代謝物的量,包括H2O2、·O2-和MDA。相關性分析結果表明,抗氧化酶活性與甘薯的耐貯性呈顯著正相關,而與ROS代謝物的量和LOX活性呈負相關。主成分分析表明,耐貯藏品種與不耐貯藏品種之間形成不同的聚類。本文為甘薯的采后貯藏保鮮、減少甘薯在貯藏過程中的經(jīng)濟損失及耐貯藏甘薯品種的快速選育提供了理論參考。