朱紫晴 黃守龍 張學(xué)勝 汪 梅 王 寧 李玉成

(安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

多氯代二苯并噻吩(PCDTs)是含硫“類(lèi)二噁英”化合物，疏水性高，在環(huán)境中可長(zhǎng)期存在，易在生物體內(nèi)富集并產(chǎn)生毒性效應(yīng)[1-2]。

PCDTs主要產(chǎn)生于城市垃圾和危險(xiǎn)廢物焚燒、冶金和金屬回收的高溫過(guò)程、制造多氯聯(lián)苯和三氯苯磺酸鹽的過(guò)程[3-5]。PCDTs已在河湖沉積物、造紙廢水、垃圾焚燒飛灰和水生生物等環(huán)境樣品中檢出[6]。BUSER等[7]在瑞士焚燒飛灰中測(cè)得PCDTs總質(zhì)量濃度為55 ng/g，其中2,3,7,8-四氯代二苯并噻吩(2,3,7,8-TCDT)質(zhì)量濃度達(dá)到35 ng/g；BUSER等[8]在美國(guó)的螃蟹和龍蝦中測(cè)得2,3,7,8-TCDT質(zhì)量濃度分別為8.3、1.0 ng/g。可以發(fā)現(xiàn)，2,3,7,8-TCDT是PCDTs中檢出濃度較高的化合物。

KOPPONEN等[9]發(fā)現(xiàn)，2,3,7,8-TCDT對(duì)大鼠肝臟癌細(xì)胞有內(nèi)分泌干擾作用。MANTYLA等[10]發(fā)現(xiàn)，2,3,7,8-TCDT對(duì)小鼠肝臟正常細(xì)胞也有內(nèi)分泌干擾作用。NAKAI等[11-12]通過(guò)免疫分析也證實(shí)了2,3,7,8-TCDT的內(nèi)分泌干擾作用。由于水是生命之源，水生生物相比陸地生物更易暴露于水中溶解的污染物下，但對(duì)于2,3,7,8-TCDT在水生生物體內(nèi)的毒性研究相對(duì)較少。

錦鯽(Carassiusauratus)，一種典型淡水魚(yú)，在中國(guó)普遍存在，易于獲得，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴養(yǎng)簡(jiǎn)單，因此是一種理想的水生生物毒理學(xué)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[13-15]。肝臟是錦鯽體內(nèi)最主要的代謝器官，對(duì)外源污染物反應(yīng)靈敏，被認(rèn)為是研究氧化損傷的最佳器官[16-18]。機(jī)體氧化損傷可以通過(guò)抗氧化酶(包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)等)的活力變化來(lái)體現(xiàn)[19]。SOD和CAT是對(duì)抗氧化損傷的第一道防線，SOD可以催化活性氧自由基(ROS)轉(zhuǎn)變?yōu)樗瓦^(guò)氧化氫，CAT能分解過(guò)氧化氫生成水和氧氣[20]。GPx屬于第二道防線，在細(xì)胞代謝和自由基清除中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。另外，當(dāng)細(xì)胞受到ROS攻擊時(shí)，會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化而引起細(xì)胞功能的紊亂，因此脂質(zhì)過(guò)氧化物的降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)也常被用于生物體氧化損傷的評(píng)估[22]。

本研究首先探究了錦鯽不同組織(肌肉、鰓和肝臟)中的2,3,7,8-TCDT生物富集規(guī)律，在得出肝臟富集能力最強(qiáng)的情況下又對(duì)不同劑量的2,3,7,8-TCDT氧化損傷錦鯽肝臟的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)錦鯽經(jīng)過(guò)安徽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與管理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2020-026)。實(shí)驗(yàn)用魚(yú)無(wú)明顯的疾病和肉眼可見(jiàn)的畸形。實(shí)驗(yàn)前，錦鯽需在室內(nèi)馴養(yǎng)1周，每天定時(shí)喂食一次，并持續(xù)充氧。實(shí)驗(yàn)用水為活性炭去氯的曝氣自來(lái)水。

1.1 錦鯽不同組織的生物富集實(shí)驗(yàn)

以50 L實(shí)驗(yàn)用水作為錦鯽的生存環(huán)境，選取尺寸大小相近的錦鯽(約20.35 g)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)暴露實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)溶劑(丙酮)對(duì)照組。前期96 h急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2,3,7,8-TCDT在錦鯽體內(nèi)的半數(shù)致死濃度(LC50，以質(zhì)量濃度計(jì))大于1.0 mg/L。按照《化學(xué)品 生物富集 半靜態(tài)式魚(yú)類(lèi)試驗(yàn)》(GB/T 21858—2008)，生物富集暴露實(shí)驗(yàn)最高濃度不超過(guò)LC50的1%，設(shè)置3個(gè)暴露實(shí)驗(yàn)組的2,3,7,8-TCDT 暴露質(zhì)量濃度分別為0.1、1.0、10.0 μg/L，每組設(shè)3個(gè)平行，以體積分?jǐn)?shù)0.01%的丙酮作為助溶劑，對(duì)照組中只加等量的丙酮。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中錦鯽無(wú)發(fā)育異?；蛩劳霈F(xiàn)象出現(xiàn)。暴露期間，每天更換一半體積的暴露實(shí)驗(yàn)用水并按相應(yīng)比例重新投毒，使2,3,7,8-TCDT在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)保持穩(wěn)定。第28天取樣后更換全部體積的暴露實(shí)驗(yàn)用水并停止投毒，轉(zhuǎn)為凈化期間，之后每天換一次全部體積的暴露實(shí)驗(yàn)用水。每天換水前2 h喂食。每天監(jiān)測(cè)并控制水相的理化條件：pH 7.56±0.06、DO(9.31±0.06) mg/L、溫度(20.27±0.12) ℃。分別于第0、1、3、7、14、21、28、30、32、36、42天取一條魚(yú)，立即解剖取出肌肉、鰓和肝臟，用生理鹽水洗凈后立即液氮冷凍，置于-80 ℃條件下保存；同時(shí)取100 mL水樣置于0～4 ℃條件下保存。

1.2 錦鯽肝臟氧化損傷實(shí)驗(yàn)

以35 L的實(shí)驗(yàn)用水作為錦鯽的生存環(huán)境，選取大小尺寸相近的錦鯽(約20.35 g)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)暴露實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)溶劑(丙酮)對(duì)照組。參照文獻(xiàn)[23]，氧化損傷暴露實(shí)驗(yàn)最高濃度不超過(guò)LC50的10%，設(shè)置3個(gè)暴露實(shí)驗(yàn)組的2,3,7,8-TCDT 暴露質(zhì)量濃度分別為1.0、10.0、100.0 μg/L，每組設(shè)3個(gè)平行，以體積分?jǐn)?shù)0.01%的丙酮作為助溶劑，對(duì)照組中只加等量的丙酮。暴露實(shí)驗(yàn)過(guò)程中錦鯽無(wú)發(fā)育異?；蛩劳霈F(xiàn)象出現(xiàn)。第7天暴露結(jié)束后取一條魚(yú)立即置于冰塊上解剖取出肝臟，用生理鹽水洗凈后，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.10 g，加入5 mL生理鹽水中制成勻漿液，分別使用A001-1-2型總SOD測(cè)試盒、A007-1-1型CAT測(cè)試盒、A005-1-2型GPx測(cè)試盒和A003-1-2型MDA測(cè)試盒測(cè)定SOD活力、CAT活力、GPx活力和MDA含量。

1.3 樣品處理與分析

使用Labconco FreeZone 4.5型冷凍干燥機(jī)將錦鯽的組織樣品進(jìn)行冷凍干燥，研磨過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.10 g，加入5 mL生理鹽水中制成勻漿液，置于10 mL離心管中，使用CT14RD型離心機(jī)離心3次(轉(zhuǎn)速8 000 r/min)。取上清液加入5 mL正己烷和二氯甲烷的混合液(體積比1∶1，下同)，超聲萃取10 min，重復(fù)3次，合并萃取液并移入分液漏斗中，加入10 mL濃H2SO4以去除脂肪，再加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaCl溶液，振蕩5 min后棄去水相，加入2 g無(wú)水Na2SO4干燥，用IKA HB10/RV1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至約1 mL，最后過(guò)自填復(fù)合硅膠柱凈化。

自填復(fù)合硅膠柱凈化步驟：(1)在有聚四氟乙烯活塞和硅篩板的玻璃色譜柱中自下而上依次填裝1 g去活硅膠(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的水)、1 g酸性硅膠(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的H2SO4)、1 g堿性硅膠(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的NaOH)、1 g活化硅膠和1 g無(wú)水Na2SO4；(2)用15 mL正己烷清洗自填復(fù)合硅膠柱；(3)將濃縮的萃取液加入自填復(fù)合硅膠柱中；(4)將50 mL正己烷和二氯甲烷混合液加入自填復(fù)合硅膠柱中進(jìn)行洗脫，收集洗脫液后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到約1 mL，用D10-12型氮吹儀吹至近干，用正己烷定容至1 mL，過(guò)0.45 μm濾膜后轉(zhuǎn)移至色譜小瓶，封口，待Agilent 7980A/5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀分析。上機(jī)前加入1 ng13C標(biāo)記的2,2’,3,4,5-五氯二苯基醚(MCDE-86)作為替代標(biāo)。

水樣用固相萃取法(SPE)進(jìn)行處理，具體方法參照文獻(xiàn)[24]，在氣質(zhì)聯(lián)用儀上機(jī)分析前加入1 ng替代標(biāo)。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為99.999%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣采用不分流模式，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣體積為1.0 μL；升溫程序?yàn)橄?0 ℃保持2 min，再以12 ℃/min升至240 ℃后保持1 min，再以15 ℃/min升至280 ℃后保持4 min。質(zhì)譜條件：真空度小于10-5Pa，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，采用全掃描模式(FS)定性，選擇離子模式(SIM)定量。2,3,7,8-TCDT的保留時(shí)間為16.62 min，選定的定量離子質(zhì)荷比為322。

1.4 生物富集動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算

通過(guò)式(1)擬合凈化期間的數(shù)據(jù)得到斜率a，其數(shù)值取絕對(duì)值即為錦鯽對(duì)2,3,7,8-TCDT的凈化速率(k2，d-1)，半衰期(t1/2，d)為ln2/k2；通過(guò)式(2)擬合暴露期間的數(shù)據(jù)可得吸收速率，生物富集因子(BCF，L/g)為k1/k2[25]。

lnCT=aT+b

(1)

(2)

式中：CT為凈化期間T時(shí)錦鯽組織中2,3,7,8-TCDT的質(zhì)量濃度，μg/g；a、b分別為凈化期間數(shù)據(jù)的回歸斜率和常數(shù)；Ct為暴露期間t時(shí)錦鯽組織中2,3,7,8-TCDT的質(zhì)量濃度，μg/g；Ct’為水中2,3,7,8-TCDT的質(zhì)量濃度，μg/L；k1為錦鯽對(duì)2,3,7,8-TCDT的吸收速率，L/(d·g)。

1.5 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

(1) 確保對(duì)照組未檢出2,3,7,8-TCDT。(2)2,3,7,8-TCDT的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.999 2。(3)錦鯽組織中2,3,7,8-TCDT的定量限為0.08～0.14 μg/g。(4)替代標(biāo)在肌肉、鰓和內(nèi)臟中的回收率分別為87.25%～102.85%、77.95%～95.37%、75.84%～94.26%。(5)式(1)和式(2)擬合的相關(guān)系數(shù)均在0.8以上。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)得數(shù)據(jù)均通過(guò)正態(tài)分布測(cè)試和方差齊性檢驗(yàn)。使用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan’s多重比較分析組間的差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 2,3,7,8-TCDT在錦鯽各組織中的生物富集濃度

不同2,3,7,8-TCDT暴露濃度下錦鯽組織中2,3,7,8-TCDT的質(zhì)量濃度見(jiàn)圖1。由于第0天各實(shí)驗(yàn)組均未檢出2,3,7,8-TCDT，對(duì)照組在整個(gè)暴露和凈化期間也均未檢出2,3,7,8-TCDT，因此圖1中省略了相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

圖1 錦鯽體內(nèi)不同組織中的2,3,7,8-TCDT

暴露1 d后，錦鯽所有組織中均檢出了2,3,7,8-TCDT，說(shuō)明2,3,7,8-TCDT可快速被錦鯽吸收并轉(zhuǎn)移。2,3,7,8-TCDT在肝臟中的濃度總體高于鰓中，鰓中又高于肌肉中，說(shuō)明鰓和肝臟容易富集2,3,7,8-TCDT，特別是肝臟[26]，這是因?yàn)楦闻K是負(fù)責(zé)生物代謝的主要組織[27],[28]857。

3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，錦鯽3種組織中2,3,7,8-TCDT的濃度在暴露期間呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)，到了凈化期間開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。在10.0 μg/L的2,3,7,8-TCDT中暴露28 d時(shí)，錦鯽的肌肉、鰓和肝臟中2,3,7,8-TCDT的質(zhì)量濃度分別達(dá)到了12.40、17.65、22.22 μg/g?？梢园l(fā)現(xiàn)，2,3,7,8-TCDT在錦鯽各組織中的生物富集濃度與暴露濃度、暴露時(shí)間均正相關(guān)。在凈化期間，各組織中2,3,7,8-TCDT濃度逐漸下降，說(shuō)明錦鯽對(duì)2,3,7,8-TCDT具有一定的解毒能力，可能是因?yàn)?,3,7,8-TCDT被轉(zhuǎn)運(yùn)或轉(zhuǎn)移到肝臟中代謝而解毒[29]。

2.2 2,3,7,8-TCDT在錦鯽組織中的生物富集動(dòng)力學(xué)參數(shù)

錦鯽各組織中2,3,7,8-TCDT的生物富集動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 錦鯽各組織中2,3,7,8-TCDT的生物富集動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2,3,7,8-TCDT在肌肉、鰓和肝臟中的k1分別為0.233～3.204、0.368～6.577、0.412～6.917 L/(d·g)，說(shuō)明錦鯽從水中生物富集2,3,7,8-TCDT速度最快的組織是肝臟，鰓次之，最后是肌肉，與2,3,7,8-TCDT在錦鯽各組織中的生物富集濃度測(cè)定結(jié)果吻合。隨著2,3,7,8-TCDT暴露濃度的升高，3種組織中的k1均明顯降低，說(shuō)明2,3,7,8-TCDT暴露濃度越低，吸收速率越快。

2,3,7,8-TCDT在肌肉、鰓和肝臟中的k2分別為0.154～0.177、0.176～0.222、0.126～0.181 d-1。2,3,7,8-TCDT在肌肉、鰓和肝臟中的t1/2分別為3.916～4.501、3.112～3.938、3.830～5.501 d。由此說(shuō)明，凈化2,3,7,8-TCDT最快的組織是鰓，而不是肝臟。由于凈化期間水中已不含2,3,7,8-TCDT，因此之前的暴露濃度對(duì)k2、t1/2的影響不大。

2,3,7,8-TCDT在肌肉、鰓和肝臟中的BCF分別為1.316～20.805、1.658～37.369、2.382～54.897 L/g，可以明顯地看出，肝臟的生物富集能力最強(qiáng)，肌肉最弱。隨著2,3,7,8-TCDT暴露濃度的升高，BCF逐漸降低，與磺胺類(lèi)抗生素和羥基化多溴聯(lián)苯醚在魚(yú)體內(nèi)的生物富集效應(yīng)相似[30-31]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能有：(1)雖然實(shí)驗(yàn)過(guò)程中錦鯽無(wú)發(fā)育異?；蛩劳霈F(xiàn)象出現(xiàn)，但經(jīng)2,3,7,8-TCDT誘導(dǎo)后會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，對(duì)2,3,7,8-TCDT的代謝作用逐漸減弱[32]；(2)錦鯽組織對(duì)2,3,7,8-TCDT的吸收能力有限，會(huì)隨2,3,7,8-TCDT暴露濃度的升高而減弱；(3)2,3,7,8-TCDT具有高疏水性(正辛醇/水分配系數(shù)為6.87)，高濃度時(shí)易吸附于懸浮顆粒物上或形成膠團(tuán)[28]859。整體來(lái)看，2,3,7,8-TCDT在錦鯽體內(nèi)具有較強(qiáng)的生物富集效應(yīng)，其潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。

2.3 2,3,7,8-TCDT對(duì)錦鯽肝臟氧化損傷的影響

在2,3,7,8-TCDT暴露下錦鯽肝臟中的抗氧化損傷指標(biāo)見(jiàn)圖2。

注：*表示與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)。

與SOD相似，CAT也被認(rèn)為是抗氧化損傷的第一道防線，它可以分解過(guò)氧化氫產(chǎn)生水和氧氣[36]。與對(duì)照組相比，CAT活力在暴露質(zhì)量濃度為1.0 μg/L時(shí)顯著上升，但在2,3,7,8-TCDT暴露質(zhì)量濃度為10.0、100.0 μg/L時(shí)顯著降低，分別下降了21.21%、28.95%，這可能與ROS的變化以及SOD作用過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫變化有關(guān)。此外，CAT需要還原型輔酶Ⅱ(NADPH)來(lái)激發(fā)其活力，因此如果缺乏NADPH也可能會(huì)降低CAT的活力[37]。

GPx為對(duì)抗氧化損傷的第二道防線，在清除自由基和減少過(guò)氧化物方面都發(fā)揮著重要作用，它可以催化過(guò)氧化氫或脂質(zhì)過(guò)氧化氫(LOOH)轉(zhuǎn)化為水[38]236。GPx活力隨2,3,7,8-TCDT暴露濃度的變化趨勢(shì)與SOD活力和CAT活力基本一致。因?yàn)楦闻K受到低劑量2,3,7,8-TCDT暴露時(shí)會(huì)同時(shí)誘導(dǎo)SOD、CAT和GPx的產(chǎn)生以清除過(guò)量的ROS或過(guò)氧化物，而隨著2,3,7,8-TCDT暴露濃度升高，谷胱甘肽水平降低、ROS和過(guò)氧化物增加，GPx活力將受到顯著抑制[38]236。

MDA是機(jī)體在抗氧化損傷過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化物的降解產(chǎn)物。MDA隨2,3,7,8-TCDT暴露濃度的升高而上升，1.0 μg/L時(shí)MDA相對(duì)對(duì)照組變化不明顯，可能是肝臟可以對(duì)抗低劑量的2,3,7,8-TCDT暴露引起的氧化損傷，不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的脂質(zhì)過(guò)氧化，從3種抗氧化酶活力的數(shù)據(jù)也可證實(shí)這一點(diǎn)。但是，在2,3,7,8-TCDT暴露質(zhì)量濃度為10.0、100.0 μg/L時(shí)，MDA相對(duì)對(duì)照組分別增加了39.61%、63.80%，并且差異極顯著。如前所述，隨著2,3,7,8-TCDT暴露濃度升高，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增加，而抗氧化防御系統(tǒng)不能清除過(guò)量的ROS和過(guò)氧化物，從而導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，MDA升高。

3 結(jié) 論

(1) 2,3,7,8-TCDT在錦鯽體內(nèi)各組織中的富集能力表現(xiàn)為肝臟>鰓>肌肉。2,3,7,8-TCDT在錦鯽體內(nèi)各組織中的生物富集濃度與暴露時(shí)間、暴露濃度均正相關(guān)。在2,3,7,8-TCDT 質(zhì)量濃度0.1 μg/L的低劑量暴露下也會(huì)引起錦鯽體內(nèi)的生物富集，并且暴露濃度越低，吸收速率越快。

(2) 與對(duì)照組相比，錦鯽肝臟中抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)活力在2,3,7,8-TCDT 質(zhì)量濃度為1.0 μg/L暴露下升高，在10.0、100 μg/L暴露下降低；MDA隨2,3,7,8-TCDT暴露濃度升高而上升，特別是在中高劑量下與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)。由此說(shuō)明，低劑量2,3,7,8-TCDT暴露時(shí)會(huì)誘導(dǎo)錦鯽肝臟抗氧化酶的產(chǎn)生以清除過(guò)量的ROS或過(guò)氧化物，而隨著2,3,7,8-TCDT暴露濃度升高抗氧化酶受到抑制，錦鯽肝臟會(huì)出現(xiàn)氧化損傷。