祝沖之 余 冉# 龍 濤 張曉東 羅默也 孫麗偉

(1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210096；2.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210019)

微生物是環(huán)境中的重要組成，通過分析微生物豐度和多樣性有助于了解環(huán)境因素的變化和環(huán)境污染的情況。研究微生物群落豐度和多樣性的方法種類繁多，其中生物標(biāo)記法受到廣泛關(guān)注。類異戊二烯醌(以下簡稱“醌”)幾乎存在于所有生物體中，在呼吸和光合作用過程的電子傳輸中擔(dān)任重要作用。同時，醌的結(jié)構(gòu)具有多樣性，一種微生物通常主要含有一種醌，因此可以作為微生物化學(xué)分類的參數(shù)之一。本研究將綜述一種通過分析微生物菌群中電子傳遞體的種類和數(shù)量來表征其群落豐度和多樣性的方法——醌指紋法[1]95。醌指紋法在20世紀(jì)80年代創(chuàng)立，近年來，隨著化學(xué)分析技術(shù)的進步和微生物特征醌數(shù)據(jù)的完善，醌指紋法在廢水處理、水環(huán)境分析、土壤監(jiān)測和堆肥處理等場景有所應(yīng)用[2]1,[3]393,[4]3,[5]1，但對研究結(jié)果缺乏系統(tǒng)的歸納總結(jié)。本研究重點探討醌指紋法的原理與作用及其在環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用情況。

1 醌指紋法的原理

醌是一類含共軛環(huán)狀二酮的母核連接異戊二烯側(cè)鏈的有機化合物。醌根據(jù)其極性環(huán)狀結(jié)構(gòu)通常分為苯醌和萘醌。苯醌含有一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，苯醌包括泛醌、質(zhì)體醌和紫醌等；萘醌含有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，萘醌包括甲基萘醌、葉綠醌、去甲基萘醌和甲硫基萘醌等。

微生物細胞主要含有泛醌和甲基萘醌，它們在生物膜系統(tǒng)作為呼吸鏈中專一的電子和質(zhì)子載體[6]，也被稱為呼吸醌，并可以進一步以其側(cè)鏈中的異戊二烯單元數(shù)和飽和度來分類。

甲基萘醌又稱維生素K2，是一類2-甲基-1-萘醌化合物，連接可變數(shù)量的異戊二烯鏈。甲基萘醌位于細胞的胞質(zhì)和類囊體膜中，或一些細菌的光合系統(tǒng)的反應(yīng)中心，在電子傳遞途徑中的蛋白質(zhì)復(fù)合物間轉(zhuǎn)移電子和質(zhì)子[7-8]。通常，將側(cè)鏈中含有n個異戊二烯單元的甲基萘醌記為MK-n，如果其側(cè)鏈中的異戊二烯雙鍵飽和，則記為MK-n(Hx)，x為飽和氫原子數(shù)。

泛醌又稱輔酶Q，是一類2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的化合物，連接可變數(shù)量的異戊二烯側(cè)鏈。泛醌通常包含6～10個異戊二烯單元，很少能達到14個。大多數(shù)泛醌分布在革蘭氏陰性菌的細胞膜、真核細胞中線粒體的內(nèi)膜和葉綠體的類囊體膜上。泛醌在需氧呼吸電子傳輸鏈中起強制性輔因子的作用，充當(dāng)電子和質(zhì)子載體[9]。與甲基萘醌類似，側(cè)鏈中含有n個異戊二烯單元的泛醌通常記為UQ-n，含有x個飽和氫原子記為UQ-n(Hx)。

葉綠醌也稱維生素K1，它和質(zhì)體醌作為光系統(tǒng)Ⅰ中電子轉(zhuǎn)移輔助因子[10]，存在于光合細菌或真菌中。

一種微生物通常只有一種優(yōu)勢醌型[11]，醌種類的多樣性使其可作為一種有效的生物化學(xué)分類學(xué)指標(biāo)[12]247。醌指紋法利用這一特性，以樣品中的醌作為生物標(biāo)志物來表征微生物群落結(jié)構(gòu)和活性。典型醌的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

圖1 典型醌的結(jié)構(gòu)示意圖

2 醌的提取和檢測

2.1 醌的提取

醌是一種中性脂質(zhì)，可以溶解于常見的脂溶性溶劑(如丙酮、甲醇、二氯甲烷和氯仿等)中。故萃取法是從環(huán)境樣品或凍干細胞中提取醌的最常用的方法[12]247。常用的萃取劑有氯仿/甲醇(體積比2∶1)或二氯甲烷/甲醇/磷酸鹽緩沖液(體積比2.0∶1.0∶0.8)。由于環(huán)境中的脂質(zhì)提取物可能含有磷脂或非脂質(zhì)的雜質(zhì)，所以需通過銀離子硅膠色譜或者反相薄層色譜對提取物進一步分離和純化[13]，但回收率不高(<90%)。因此現(xiàn)在通常使用固相萃取柱(如Waters Sep-Pak硅膠柱)進行純化，這種方法的回收率高于96%[3]393。

為了克服傳統(tǒng)萃取法耗時、繁瑣和溶劑有毒的缺點，最近研究者開發(fā)出一種應(yīng)用超臨界流體萃取(SFE)提取樣品中醌的方法[14-15]。這種方法在55 ℃和25 MPa下，以甲醇作為改性劑，使用超臨界CO2萃取活性污泥中的醌，發(fā)現(xiàn)萃取后沒有使用Sep-Pak柱和經(jīng)Sep-Pak柱純化的醌總量分別為390、410 μmol/kg，和傳統(tǒng)萃取法的回收量(420 μmol/kg)相當(dāng)。另有一種僅在凍干細胞中應(yīng)用的新型檢測技術(shù)，它不使用有機溶劑，僅通過脫水破壞細胞并將其中的醌轉(zhuǎn)移到氧化銦錫電極上進行檢測[16]。

2.2 醌的檢測

提取出的醌通常用高效液相色譜(HPLC)檢測并定量，HPLC的流動相可以是甲醇/異丙醚、甲醇/異丙醇或乙腈/異丙醇等混合物[3]394,[4]75。通常，在紫外光譜檢測器下甲基萘醌的檢測波長是270 nm，泛醌是275 nm。然而，HPLC易受環(huán)境中雜質(zhì)的影響，靈敏度有限，無法鑒定醌結(jié)構(gòu)。因此，液相色譜(LC)與質(zhì)譜(MS)耦合技術(shù)在醌檢測中愈發(fā)被重視[17-18]。某些醌型(如MK-8(H4)和MK-9)在HPLC檢測下保留時間十分接近，LC—MS可以更好地分離這些醌[19]。其中MS主要使用的電離模式是正離子的大氣壓化學(xué)電離模式[20]。圖2為環(huán)境樣品中醌的主要檢測流程。

圖2 環(huán)境樣品中微生物醌的主要檢測流程

色譜檢測需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而目前部分醌型缺少市售的標(biāo)準(zhǔn)品(比如含有飽和氫原子的泛醌和甲基萘醌)，所以通常從已知醌型的微生物中分離獲得醌標(biāo)準(zhǔn)品[3]395。所選用的菌株需具備醌型單一、培養(yǎng)快速和簡單等特點[21-22]。此外，泛醌和甲基萘醌中異戊二烯單元數(shù)和色譜保留時間的對數(shù)具有線性關(guān)系，可以基于此計算未知醌組分的異戊二烯單元數(shù)目[23]455。

3 醌指紋法的作用

3.1 醌指示的環(huán)境微生物

環(huán)境樣品中的醌指紋可以推斷樣品的微生物種群結(jié)構(gòu)和對應(yīng)的種屬豐度與活性，表1列舉了已知所含醌型的微生物的種類。

表1 常見醌型指示的環(huán)境微生物

3.2 數(shù)據(jù)分析

醌指紋法可以檢測出樣品中醌的種類及數(shù)量的直接信息，為了比較樣品間的差異，通常要進行統(tǒng)計學(xué)分析。目前，分析醌指紋常用的指數(shù)有總醌指數(shù)(TQ)、多樣性指數(shù)(DQ)、均勻性指數(shù)(EQ)和非相似性指數(shù)(D)[45]，公式見表2。

表2 醌指紋法的常見指數(shù)1)

TQ能夠反映樣品中具有活性的微生物數(shù)量，因為醌在死細胞內(nèi)會很快分解。在水環(huán)境和土壤中，TQ和細胞豐度呈線性關(guān)系[46-47]。在湖泊中，1 nmol醌約對應(yīng)0.67 mg微生物碳。然而，在不同水深下TQ與微生物碳含量的比例會變化，同時也會在一些深度中沒有明顯相關(guān)性[48]250。

醌的多樣性水平可以代表微生物群落的多樣性水平。最初曾用香農(nóng)指數(shù)來量化基于醌指紋法的微生物多樣性，但由于它對變化的敏感性不高，尤其是對摩爾占比較小的物種[23]455，所以目前通常使用DQ和EQ[1]96來量化。DQ越高表明微生物的多樣性越高。EQ越高，表明微生物的分布比例越接近，當(dāng)EQ達到最大值1時，表明所有含有不同醌型的微生物比例相同。此外，D可以比較兩個樣品間微生物群落的相似性，D值越小，兩組樣品越相似。

4 醌指紋法在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用

4.1 廢水生物處理系統(tǒng)

醌指紋法能用于反映污泥系統(tǒng)中微生物的情況。當(dāng)BOD負荷為0.2～0.4 kg/(kg·d)時，活性污泥中甲基萘醌與泛醌的摩爾比(P)介于0.6～1.0，大部分在0.9～1.0；BOD較低或者保留時間較長的活性污泥中P會提高到1.2～4.0[23]454。在穩(wěn)定的活性污泥系統(tǒng)中，UQ-8是最主要的泛醌類型[49]146,[50],[51]198,[52]，而在絲狀菌膨脹期間，UQ-9占主導(dǎo)地位[53]，UQ-10也是常見的類型。同時，MK-7是最主要的甲基萘醌[49]146，其他常見的甲基萘醌有MK-8、MK-6或MK-9。在循環(huán)生物流化床系統(tǒng)的生物膜中，UQ-8和UQ-10增加而UQ-9減少[54]，代表硝化細菌增加的同時變形細菌的γ亞類數(shù)量減少，生物膜中微生物種群均勻性變化較小。在膜生物反應(yīng)器(MBR)中，泛醌的種類通常比甲基萘醌少。此外，膜表面生物膜的UQ-9、MK-7、MK-8(H2)、MK-8(H4)和MK-10(H4)含量的增加可能與MBR膜污染有關(guān)[55]，MBR污泥的DQ可能會略低于懸浮微生物和生物膜中的DQ。

4.2 水環(huán)境和沉積物

河流、湖泊和海洋等水生系統(tǒng)中的醌含量往往不高，但通過醌指紋法可以推測水環(huán)境中有氧與無氧條件的變化情況。水系統(tǒng)中的醌以MK-6和UQ-8為主[48]250。醌分布受環(huán)境變量影響較大，但沒有季節(jié)性規(guī)律。BECKER等[2]7發(fā)現(xiàn)有氧區(qū)的醌濃度比有氧-缺氧化變層提高了7倍，最深的水柱樣品中醌濃度最低，并且缺氧區(qū)中不飽和甲基萘醌和泛醌的相對豐度較高。

醌種類和豐度分布可與沉積物的地理位置和深度關(guān)聯(lián)[56]。潮汐沉積物中主要的醌是UQ-10和UQ-8，而潮下沉積物中以MK-6和UQ-9為主，主要原因可能是溶解性有機碳、氨氮、溶解氧濃度的變化影響了微生物活動[57]。LI等[58]發(fā)現(xiàn)在海灣冷滲流和可燃冰附近的沉積物中，泛醌含量相似(分別為51.7 pmol/g和55.0～57.3 pmol/g)，UQ-8含量最高，并隨深度增加而急劇下降；而冷滲流中甲基萘醌含量只有可燃冰的1/8～1/4，以MK-4和MK-6最為豐富。另外，還有研究表明海灣沉積物中DQ與總有機碳含量正相關(guān)，與鹽度和導(dǎo)電性負相關(guān)，與重金屬含量無顯著相關(guān)關(guān)系[59]。

4.3 土 壤

醌指紋法可以間接反映土壤污染狀況及其變化。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤在受碳氫化合物污染后，TQ會顯著增加，其中MK-8(H4)、MK-9(H2)和UQ-9顯著增加，高濃度的碳氫化合物會使DQ有所降低，碳氫化合物被降解去除后，TQ和DQ與未污染土壤的差異消失[60]。KATAYAMA等[61]報道了土壤在多種農(nóng)藥殺蟲劑施用下醌指紋的變化情況，其中殺螟松、利谷隆和西瑪津不影響醌的濃度和種類；而百菌清會降低DQ但不改變TQ；三氯硝基甲烷會降低醌的數(shù)量和多樣性。在重金屬污染土壤中，土壤酶活性與甲基萘醌種類有明顯的正相關(guān)關(guān)系，并且污染前后土壤中的泛醌含量變化較小，表明部分微生物對重金屬存在耐受機制[62]。

4.4 堆 肥

有研究發(fā)現(xiàn)，堆肥初期MK-7和UQ-9通常是優(yōu)勢醌型[4]88,[5]79,[63]，隨著堆肥的進行，泛醌含量會有所下降，長鏈(含有9個及以上異戊二烯單元)甲基萘醌含量會有所增加，醌的多樣性通常會下降，但有時候也會持續(xù)增加[5]73。隨著堆肥過程的進行，微生物中變形菌綱的微生物會減少，而放線菌綱微生物會增加。

5 醌指紋法的優(yōu)缺點

目前，碳源利用法(如Biolog法)和生物標(biāo)記法(如磷脂脂肪酸分析法)已廣泛用于自然環(huán)境中微生物群落的表征[64-65]。首先，與碳源利用法等培養(yǎng)法相比，醌指紋法優(yōu)勢在于無需培養(yǎng)微生物，可以直接反映環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)。此外，醌指紋法可以有效指示古細菌，而磷脂脂肪酸分析無法檢測古細菌，因為它們的極性脂質(zhì)是醚鍵而不是酯鍵。

另外，分子生物學(xué)方法是鑒定微生物最常用的方法，它在微生物分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究中作用明顯。已有研究發(fā)現(xiàn)，醌指紋法表征微生物多樣性的結(jié)果與變形梯度凝膠電泳(DGGE)、熒光原位雜交(FISH)、16S rRNA克隆和測序的結(jié)果基本一致[23]456,[51]198,[66]。此外，醌是細胞呼吸作用中的活性物質(zhì)，所以它的濃度可以直接反映微生物的活度；同時醌指紋法更易于表征放線菌和古細菌[2]2，而這些微生物難以定量提取核酸來表征。

但是，醌指紋法也有局限性。首先，醌指紋法指示的分類水平較低，不能精確到物種的種屬層面。其次，尚未完全掌握環(huán)境中所有微生物醌，所以某些特定情況下醌指紋所包含的生物學(xué)意義尚未完全解讀。再次，在少數(shù)情況下，一種細菌的主要醌型也會發(fā)生變化，這會導(dǎo)致醌指紋的誤差。此外，醌會在光下氧化，也會在強酸和強堿下發(fā)生分解，所以提取的過程可能會發(fā)生損失。

6 展 望

醌指紋法是研究環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的有效方法，它無需培養(yǎng)微生物，能避免死亡細胞的干擾，加之化學(xué)檢測技術(shù)的進步和微生物特征醌指紋數(shù)據(jù)庫的逐漸完善，使得分析環(huán)境樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)和活性更加便捷、高效和準(zhǔn)確。在環(huán)境治理領(lǐng)域，往往只需要了解功能微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化情況，而非具體的微生物種屬，所以醌指紋法的這些特性預(yù)示它具有廣泛的應(yīng)用前景。

未來，醌指紋法的發(fā)展需要進一步總結(jié)不同環(huán)境條件下醌指紋的變化規(guī)律，深入分析菌群的醌組成和分布與環(huán)境微生物的對應(yīng)關(guān)系，降低檢測成本。在微生物治理領(lǐng)域，醌指紋法可以和其他生物標(biāo)志物法或分子生物學(xué)方法結(jié)合，以提供更為全面的系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)和活性分析。