孫朋真，曹建新，趙天瑞，程桂廣*

（昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650500）

紫色西番蓮（Passiflora edulisSims）屬西番蓮科，俗稱(chēng)熱情果和雞蛋果，在我國(guó)云南、海南、臺(tái)灣等地區(qū)種植歷史悠久[1]。紫色西番蓮果皮（the peel ofPassiflora edulisSims，PEP）具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病等作用，這些作用歸因于生物活性化合物如酚類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物和多糖等[2-4]。然而，西番蓮果實(shí)多被用于果汁生產(chǎn)，PEP卻被當(dāng)作工業(yè)廢料處理，造成極大的浪費(fèi)。

酚類(lèi)化合物以游離態(tài)、酯化態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)存在于植物中[5]。先前的研究表明，PEP富含可溶性酚類(lèi)化合物（游離態(tài)酚類(lèi)化合物：用不同溶劑通過(guò)超聲波輔助提取、超臨界流體萃取等傳統(tǒng)方法獲得的酚類(lèi)物質(zhì)）[6]，而忽略了酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)（與某些大分子、細(xì)胞壁多糖或蛋白質(zhì)結(jié)合）[7]，因此PEP中酚類(lèi)物質(zhì)的含量及其生物活性可能被低估。另外，多酚類(lèi)物質(zhì)是公認(rèn)的抗氧化劑，在飲食中添加抗氧化劑以增強(qiáng)人體抗氧化機(jī)制是預(yù)防各種慢性疾病的重要手段[8]。因此，提高PEP的多酚提取率和生物活性具有重要意義。

近年來(lái)，超高壓預(yù)處理已成為提高某些化合物提取率和生物活性的有效手段[9]。超高壓（壓力范圍在100～600 MPa）預(yù)處理可用于提取水果、果汁等物料中的生物活性物質(zhì)[10]。對(duì)植物材料施加壓力可以破壞其三維結(jié)構(gòu)，破壞材料大分子間的氫鍵、離子鍵以及疏水鍵等非共價(jià)鍵，還可以破壞細(xì)胞膜中的鹽橋和疏水相互作用，提升滲透率，從而促進(jìn)酚類(lèi)等生物活性物質(zhì)的釋放[11-12]。此外，超高壓已經(jīng)成功地被應(yīng)用到棕櫚果、龍眼果皮、茶多酚等活性成分的提取[9,13-14]，但是，目前鮮有關(guān)于超高壓預(yù)處理對(duì)PEP中游離態(tài)、酯化態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)多酚提取的研究。因此，本研究旨在探討超高壓預(yù)處理對(duì)PEP中不同形態(tài)酚類(lèi)及其抗氧化能力和細(xì)胞保護(hù)作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色西番蓮果實(shí)于2018年從中國(guó)云南省昆明當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買(mǎi)，并在中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所進(jìn)行鑒定。將這些水果人工分成果肉和果皮，然后將果皮切成小塊，用冷凍干燥機(jī)凍干。

福林-酚試劑、2,2-二苯基-1-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氨-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、噻唑藍(lán)（methylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、胰蛋白酶消化液 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；HepG2細(xì)胞中國(guó)科學(xué)院昆明野生動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素、鏈霉素、培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM） 美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒 北京四正柏生物科技有限公司；沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）、蘆?。╮utin，R）（純度≥98%） 成都曼斯特生物科技有限公司；其他試劑是國(guó)產(chǎn)分析級(jí)純度。

1.2 儀器與設(shè)備

HHP-600型超高壓設(shè)備 包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；Epoch 2微孔板分光光度計(jì) 美國(guó)伯騰公司。

1.3 方法

1.3.1 超高壓預(yù)處理及PEP游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的提取

取上述冷凍干燥的PEP，將其研成粉末。稱(chēng)取20 g PEP粉末（3 份）放入真空包裝密封，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最合適的超高壓條件：500 MPa下超高壓處理10 min，以水作為壓力傳遞介質(zhì)，電壓380 V，溫度25 ℃，將此記為超高壓組。

未超高壓組和超高壓預(yù)處理組的果皮粉游離態(tài)、酯化態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)多酚的提取參考Zhang Chengting等[15]的方法。首先用石油醚以料液比1∶10混合脫脂處理未超高壓組和超高壓預(yù)處理組果皮粉5 min，重復(fù)3 次。脫脂樣品在空氣中干燥后，兩組樣品（10 g）用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液（1∶10，m/V）100 mL在25～30 ℃下超聲提取30 min，抽濾后，濾渣按照上述料液比和超聲條件重復(fù)提取兩次。收集3 次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至黏稠狀，用D101大孔樹(shù)脂富集，用水洗脫除糖后，再用95%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液并濃縮[16]，濾渣保留用于結(jié)合態(tài)多酚的收集。濃縮后液體用6 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 2.0，然后用乙酸乙酯萃取5 次，收集上層萃取液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮后，所得浸膏采用真空冷凍干燥機(jī)凍干得到游離態(tài)多酚。萃余相（水相）先用4 mol/L NaOH溶液以體積比1∶10水解4 h，然后將pH值調(diào)至2.0，接著按照游離態(tài)多酚的提取方法進(jìn)行萃取、收集、濃縮、凍干，從而得到酯化態(tài)多酚。對(duì)于結(jié)合態(tài)多酚的提取，首先用4 mol/L NaOH以體積比1∶10水解濾渣4 h，將pH值調(diào)至2后過(guò)濾，然后按照提取游離多酚的方法進(jìn)行萃取、收集、濃縮、凍干得到結(jié)合態(tài)多酚。

1.3.2 PEP不同形態(tài)多酚和黃酮含量的測(cè)定

精準(zhǔn)稱(chēng)取各提取物5 mg（3 份），配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液，采用福林-酚法[17]對(duì)PEP超高壓前后的游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果用每克多酚提取物含沒(méi)食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）（mg GAE/g提取物）表示，提取率用每克PEP含沒(méi)食子酸當(dāng)量（mg GAE/g PEP）表示。參考劉南波等[18]的方法測(cè)定PEP超高壓前后的游離態(tài)、酯化態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)黃酮含量，結(jié)果用每克多酚提取物含蘆丁當(dāng)量（rutin equivalent，RE）（mg RE/g提取物）表示，提取率用每克PEP含蘆丁當(dāng)量（mg RE/g PEP）表示。

1.3.3 PEP不同形態(tài)多酚抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考Thaipong等[19]的方法通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)對(duì)PEP超高壓前后的游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，DPPH自由基清除能力按公式（1）計(jì)算。

式中：A1為空白組的吸光度；A2為樣品組的吸光度。

計(jì)算PEP超高壓前后不同形態(tài)多酚DPPH自由基清除能力的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）（DPPH自由基清除能力達(dá)到50%時(shí)的多酚質(zhì)量濃度）。

1.3.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

參照沙玉歡等[20]的方法測(cè)定超高壓前后PEP的3 種多酚的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力， ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力按公式（2）計(jì)算。

式中：A1為空白組的吸光度；A2為樣品組的吸光度。

計(jì)算PEP超高壓前后不同形態(tài)多酚ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的IC50（ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力達(dá)到50%的多酚質(zhì)量濃度）。

1.3.3.3 鐵離子還原能力測(cè)定

鐵離子還原能力（ferric-reducing antioxidant power capacity，F(xiàn)RAP）測(cè)定在李新原等[10]的方法上稍作修改，用FeSO4當(dāng)量（μmol Fe2+/g提取物）表示各種形態(tài)多酚的FRAP。

1.3.4 HepG2細(xì)胞氧化損傷模型的建立

1.3.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品細(xì)胞毒性測(cè)定

用含有10% FBS和1%抗生素（青霉素和鏈霉素混合物）的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。通過(guò)MTT法[9]檢測(cè)PEP不同形態(tài)多酚對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性，以此確定合適濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4.2 HepG2細(xì)胞活性氧含量的測(cè)定

采用Yang Meilian等[21]的方法稍作修改，測(cè)定H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平。將HepG2細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔密度接種2 mL于6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，然后樣品組加入含PEP超高壓處理前后的游離態(tài)、酯化態(tài)和不溶性結(jié)合態(tài)多酚（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）的培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加入含質(zhì)量濃度10 μg/mL VC的培養(yǎng)基，空白組和模型組更換DMEM培養(yǎng)基。24 h后，去除培養(yǎng)基，各組（不含空白組）加入0.7 mmol/L H2O2孵育6 h，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗2 次，37 ℃黑暗中用10 mmol/L DCFHDA孵育20 min。孵育結(jié)束后，用無(wú)FBS的預(yù)冷培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞兩次，然后立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組的熒光信號(hào)，并計(jì)算細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。

1.3.4.3 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，分析PEP不同形態(tài)多酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)量重復(fù)3 次，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 17.0和Origin 8.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用單因素方差分析和Duncan法確定差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓預(yù)處理對(duì)PEP中不同形態(tài)多酚提取率的影響

未超高壓組的游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的提取率分別為（3.25±0.49）、（0.61±0.02）、（0.21±0.03）mg GAE/g PEP。如表1所示，經(jīng)超高壓預(yù)處理后，游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的提取率均顯著增加（P＜0.05），分別為（6.90±0.13）、（0.80±0.07）、（0.28±0.02）mg GAE/g PEP（P＜0.05）。對(duì)于PEP而言，不同形態(tài)多酚的提取率由高到低依次為游離態(tài)多酚＞酯化態(tài)多酚＞結(jié)合態(tài)多酚。超高壓預(yù)處理后不同形態(tài)黃酮的提取率也都顯著增加，尤其是酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)黃酮的提取率，分別提升了4.63 倍和3.80 倍?？赡苁且?yàn)槌邏焊蟪潭壬细淖兞薖EP的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，破壞了多酚、黃酮類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子的結(jié)合，使多酚、黃酮類(lèi)化合物最大限度釋放出來(lái)，尤其是酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚、黃酮類(lèi)化合物，從而提高其提取率[10,22]。

表1 超高壓預(yù)處理對(duì)PEP中不同形態(tài)多酚提取率的影響Table 1 Extraction rates of free, esterified, and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.2 超高壓處理對(duì)PEP提取物中多酚和黃酮含量的影響

如圖1所示，就提取物而言，未超高壓組的PEP的3 種形態(tài)多酚中，游離態(tài)多酚和黃酮含量最高，分別為（78.52±1.14）mg GAE/g提取物和（51.65±1.06）mg RE/g提取物，其次是結(jié)合態(tài)多酚和黃酮，酯化態(tài)多酚和黃酮含量最少，分別為（53.77±0.71）mg GAE/g提取物和（6.67±0.71）mg RE/g提取物。之前的報(bào)道發(fā)現(xiàn)紫色馬鈴薯皮[23]和紅辣椒[24]中也主要含有游離態(tài)多酚，而花生皮中酯化態(tài)多酚含量更高[25]，棠梨果皮中結(jié)合態(tài)多酚最多[7]。超高壓預(yù)處理后顯著提高了游離態(tài)多酚和黃酮含量，分別為（174.30±0.80）mg GAE/g提取物和（101.25±2.01）mg RE/g提取物，較未超高壓組提高了1.22 倍和0.96 倍。之前有研究報(bào)道超高壓預(yù)處理可以提高游離態(tài)多酚含量[9]。與游離態(tài)多酚不同的是，超高壓預(yù)處理后，酯化態(tài)多酚含量降低，但酯化態(tài)黃酮含量升高，結(jié)合態(tài)多酚含量降低，而結(jié)合態(tài)黃酮含量無(wú)顯著變化（P＞0.05）。這可能是未超高壓的PEP中部分多酚和黃酮類(lèi)化合物與其他大分子結(jié)合，導(dǎo)致正常條件下提取困難，超高壓預(yù)處理破壞了PEP中多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)與生物大分子間化學(xué)鍵的連接，從而顯著提高了游離態(tài)多酚、游離態(tài)和酯化態(tài)黃酮類(lèi)物質(zhì)含量[9]。

圖1 未超高壓和超高壓處理的紫色西番蓮果皮提取物的游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚和黃酮的含量Fig.1 Phenol and flavonoid contents of free, esterified, and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.3 超高壓預(yù)處理對(duì)PEP提取物不同形態(tài)多酚抗氧化活性的影響

2.3.1 超高壓預(yù)處理對(duì)PEP提取物不同形態(tài)多酚DPPH自由基清除能力的影響

如圖2所示，超高壓預(yù)處理前后，所有形態(tài)的多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力與不同形態(tài)多酚含量呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其中相同劑量下，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)超高壓預(yù)處理，游離態(tài)多酚的DPPH自由基清除率都是3 種多酚中最強(qiáng)的。未超高壓游離態(tài)多酚IC50為（126.75±6.71）μg/mL，超高壓游離態(tài)多酚IC50為（71.25±6.65）μg/mL，與未超高壓處理組相比，超高壓預(yù)處理能顯著提高游離態(tài)多酚的DPPH自由基清除能力（P＜0.05）。

圖2 未超高壓和超高壓預(yù)處理的紫色西番蓮果皮提取物游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.3.2 超高壓預(yù)處理對(duì)PEP提取物不同形態(tài)多酚ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的影響

由圖3可知，超高壓預(yù)處理前后的6 組提取物均表現(xiàn)出良好的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，且清除能力大小順序?yàn)槌邏河坞x態(tài)多酚＞未超高壓游離態(tài)多酚＞未超高壓結(jié)合態(tài)多酚＞未超高壓酯化態(tài)多酚＞超高壓酯化態(tài)多酚＞超高壓結(jié)合態(tài)多酚。未超高壓的PEP中，游離態(tài)多酚表現(xiàn)出最高的清除活性，其IC50為（176.35±4.56）μg/mL。經(jīng)過(guò)超高壓處理后，不僅游離態(tài)多酚和游離態(tài)黃酮含量升高，其ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力也顯著升高（P＜0.05），IC50為（91.28±6.34）μg/mL，明顯低于未超高壓的游離態(tài)多酚。

圖3 未超高壓和超高壓預(yù)處理的紫色西番蓮果皮提取物游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力Fig.3 ABTS cation radical scavenging activity of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.3.3 超高壓預(yù)處理對(duì)PEP提取物不同形態(tài)多酚鐵離子還原能力的影響

超高壓預(yù)處理前后，PEP 3 種形態(tài)多酚的FRAP如圖4所示，6 個(gè)組的FRAP均表現(xiàn)出與DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力相同的規(guī)律。超高壓預(yù)處理前后，相同質(zhì)量濃度、同種形態(tài)多酚組的FRAP有顯著性差異（P＜0.05），與各組多酚含量表現(xiàn)出相同變化規(guī)律，各組FRAP可能與多酚類(lèi)物質(zhì)良好的抗氧化作用有關(guān)。另外，經(jīng)過(guò)超高壓預(yù)處理的游離態(tài)多酚的FRAP最大，達(dá)到（970.26±22.85）μmol Fe2+/g提取物。

圖4 未超高壓和超高壓預(yù)處理的紫色西番蓮果皮提取物的游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的FRAPFig.4 Ferric reducing antioxidant power (FRAP) of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.4 超高壓預(yù)處理對(duì)PEP提取物不同形態(tài)多酚對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的影響

2.4.1 超高壓預(yù)處理PEP提取物不同形態(tài)多酚對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量的影響

ROS是正常細(xì)胞代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性自由基之一[26]。ROS可以作為體內(nèi)的信號(hào)傳遞物質(zhì)，但如果ROS過(guò)量積累則將攻擊身體組織、器官和細(xì)胞，導(dǎo)致慢性疾病[27]。H2O2容易穿透細(xì)胞膜，是最常見(jiàn)的ROS產(chǎn)生源，因此本實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建氧化損傷模型[28]。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品在100 μg/mL對(duì)該細(xì)胞無(wú)毒，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用此濃度。如圖5A所示，經(jīng)H2O2處理的模型組熒光信號(hào)明顯向右偏移（P＜0.05），說(shuō)明經(jīng)過(guò)處理后模型組細(xì)胞產(chǎn)生了大量的ROS。將空白組ROS水平設(shè)為100%，由圖5B定量結(jié)果可知，H2O2處理后細(xì)胞產(chǎn)生的ROS相對(duì)含量高達(dá)（172.36±5.13）%，經(jīng)過(guò)VC處理后，細(xì)胞產(chǎn)生的ROS相對(duì)含量為（101.43±2.31）%，顯著低于模型組（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)樣品處理后，未超高壓和超高壓預(yù)處理的PEP中3 種形態(tài)多酚處理組的細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量較模型組顯著降低（P＜0.05），尤其是酯化態(tài)多酚處理組中細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量（未超高壓組為（105.46±2.84）%、超高壓組為（101.74±3.46）%）與VC組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。超高壓預(yù)處理后，游離態(tài)多酚處理組細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量與未超高壓組相比沒(méi)有顯著性差異，而結(jié)合態(tài)多酚處理組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高（P＜0.05），可能是因?yàn)槌邏侯A(yù)處理PEP中結(jié)合態(tài)多酚顯著減少。有研究報(bào)道，棕櫚果超高壓預(yù)處理后多酚提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的氧化損傷所引起ROS含量增加的抑制作用均強(qiáng)于未超高壓組[9]，這與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果不完全相同。然而棕櫚果中結(jié)合態(tài)多酚保護(hù)作用最優(yōu)，使用質(zhì)量濃度為120 μg/mL，高于本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)量濃度，但效果與本研究同條件下得到的結(jié)合態(tài)多酚接近，因此可推知PEP中各類(lèi)形態(tài)多酚都有很好的細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用。

圖5 未超高壓和超高壓預(yù)處理的紫色西番蓮果皮提取物游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚對(duì)H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)ROS生成的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated P.edulis peel on H2O2-induced formation of intracellular ROS in HepG2 cells

2.4.2 超高壓預(yù)處理PEP提取物不同形態(tài)多酚對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡水平的影響

細(xì)胞凋亡本來(lái)是機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)的一種生理現(xiàn)象，然而氧化損傷等原因會(huì)造成細(xì)胞不正常凋亡[21]。由圖6可知，與空白組相比，H2O2處理顯著增加了模型組HepG2細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)VC處理，細(xì)胞凋亡率較模型組顯著降低（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)樣品處理后，不同形態(tài)多酚的細(xì)胞凋亡率較模型組均顯著下降（P＜0.05），其中未超高壓處理的酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的細(xì)胞凋亡率與陽(yáng)性對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。超高壓預(yù)處理后的PEP提取物中酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的細(xì)胞凋亡率較未超高壓組顯著增高（P＜0.05），可能是因?yàn)槌邏侯A(yù)處理后總酚含量有所下降。整體來(lái)看，PEP中游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚均能對(duì)氧化損傷引起的細(xì)胞凋亡起到良好的保護(hù)作用。

圖6 未超高壓和超高壓預(yù)處理的紫色西番蓮果皮提取物的游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚對(duì)H2O2造成的HepG2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用Fig.6 Cytoprotective effect of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated P.edulis peel on H2O2-induced HepG2 cells

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以PEP為原料，研究超高壓預(yù)處理對(duì)其游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚抗氧化能力和細(xì)胞保護(hù)能力的影響。結(jié)果表明，超高壓預(yù)處理顯著提高了PEP中3 種形態(tài)多酚的提取率，同時(shí)顯著提高了PEP中游離、酯化和結(jié)合態(tài)多酚和黃酮含量。對(duì)于不同提取物而言，游離態(tài)多酚和黃酮含量及其體外抗氧化活性顯著升高，然而結(jié)合態(tài)和酯化態(tài)多酚含量及體外抗氧化能力降低。對(duì)于3 種不同形態(tài)多酚，超高壓處理后游離態(tài)多酚和黃酮含量最高，并顯示出最強(qiáng)的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力以及最高的FRAP，各類(lèi)多酚的抗氧化能力與其含量呈正相關(guān)，與之前的報(bào)道結(jié)果[24,29]相似。未超高壓和超高壓預(yù)處理的PEP中3 種提取物均表現(xiàn)出很好的細(xì)胞保護(hù)作用，可以有效地降低H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ROS的含量和H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡率，其中酯化態(tài)多酚的效果最好?？赡苁且?yàn)槲鞣徆ぬ崛∥镏絮セ瘧B(tài)酚類(lèi)物質(zhì)具備更好的自由基清除能力，已有研究人員發(fā)現(xiàn)，花生皮中酯化態(tài)酚類(lèi)化合物具有最強(qiáng)的抗氧化能力，其主要成分為兒茶素和表兒茶素等黃酮類(lèi)成分[25]，西番蓮果皮經(jīng)超高壓預(yù)處理后，黃酮類(lèi)物質(zhì)顯著升高，但主要成分有待進(jìn)一步考證。綜上，超高壓預(yù)處理可顯著提高PEP的游離態(tài)多酚含量和抗氧化能力，能更高效地增加其在功能食品和營(yíng)養(yǎng)食品工業(yè)中的應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。