錢 程 高 振 陳 卓

(1.南通大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)務科，江蘇 南通 226001；2. 南通大學第二附屬醫(yī)院放療科，江蘇 南通 226001;3. 南通大學第二附屬醫(yī)院介入科，江蘇 南通 226001)

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中預后不良的重要因素[1]，目前其發(fā)生機制尚不十分清楚。已有研究表明，腦缺血再灌注損傷會導致星形膠質細胞體積增大、分支增多，并且膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽性細胞增多。GFAP是星形膠質細胞活化的標志物，參與腦缺血再灌注損傷[2-3]。同時有研究報道，核因子E2相關因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)活化調控星形膠質細胞，在脊髓缺血耐受中發(fā)揮著重要作用[4-5]，但是目前尚不明確Nrf2在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮的作用。目前，腦缺血再灌注損傷尚無有效的治療藥物。蟾酥是一味傳統(tǒng)中藥，能治療多種疾病[6-7]。有研究證明，蟾酥注射液具有抑制下丘腦環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、前列腺素E2(PGE2)釋放的作用[8-9]。本研究通過對腦缺血再灌注損傷小鼠進行蟾酥預處理干預，觀察小鼠腦組織星形膠質細胞特異性標志物GFAP和Nrf2的變化，以期為蟾酥的臨床應用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及設備

1.1.1 動物 健康雄性C57小鼠60只，平均體質量(23±2.65)g，被安置在12 h的光/暗循環(huán)條件下，溫度(22±2)℃，濕度(65±5)%，自由攝食和飲水，實驗動物和飼料購自南通大學實驗動物中心，動物合格證號：NT89202135。本研究所用的實驗方案經南通大學動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑及藥物 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma公司，貨號：T8877)；GFAP抗體(Abcam公司，貨號：ab7260)，Nrf2抗體(Abcam公司，貨號：ab62352)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；RIPA組織蛋白裂解液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：R0010)；TBST 緩沖液(ThermoFisher，貨號：37571)；3.5%水合氯醛(克拉瑪爾，上海譜振生物有限公司，貨號:150042)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司，貨號：28718-L)；4%甲醛溶液(Sigma公司，貨號：47083-U)。蟾酥注射液(江蘇浦金藥業(yè)有限公司，國藥準字Z32020694)。

1.1.3 設備 紅外燈(FHC，Bowdoinham，ME，USA)；激光多普勒血流儀(PeriFlux 5000，瑞典Perimed AB)；圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics Co. USA)；激光共聚焦掃描分析儀(STELLARIS 5，德國Leica)；凝膠成像儀和分析軟件(iBright CL750，ThermoFisher)。

1.2 實驗方法 將60只C57小鼠隨機分為假手術組、模型組和蟾酥注射液低、中、高劑量組，每組12只。模型組采用線栓法制備腦缺血再灌注模型。術前禁食不禁水12 h，3.5% 水合氯醛 (1 mL/100 g)腹膜內注射麻醉，仰臥位固定。腹中線頸部縱向切口，暴露右頸總動脈(CCA)、右頸外動脈(ECA)和右頸內動脈(ICA)。將右ECA的分支結扎并在距右CCA分叉20 mm處切斷，輕輕插入帶有圓形尖端的肝素阻尼單絲尼龍縫合線至距右ECA 切口20 mm處，用縫合線結扎以阻塞右側大腦中動脈(MCA)。閉塞2 h后，拔出尼龍縫合線以恢復血流。用激光多普勒血流儀檢測，局部腦血流量減少至20%并恢復到基線的80%以上表明造模成功。手術過程中，用直腸探頭連續(xù)監(jiān)測核心體溫，并用恒溫控制的紅外燈使其保持在(38±0.5)℃。假手術組術前準備、麻醉、切口同模型組，血管分離后不插入線栓，結扎消毒后縫合皮下組織及皮膚即可。蟾酥注射液低、中、高劑量組分別于缺血前30 min經腹腔注射蟾酥注射液1.6、3.2、6.4 mL/kg，其余操作同模型組。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 小鼠神經功能 在小鼠再灌注后24 h，采用Longa's評分法評定各組小鼠神經功能。0分：無明顯神經功能缺損；1分：癱瘓側前爪不能完全伸展；2分：行走時向癱瘓側轉圈；3分：行走時向癱瘓側傾倒；4分：無法自主行走，意識水平下降[10]。

1.3.2 小鼠腦梗死體積 采用TTC染色法檢測。再灌注后72 h立即對各組小鼠實施安樂死并斷頭。迅速取出大腦并在-20 ℃下冷凍20 min。然后，將大腦冠狀面按順序切取5個切片(2 mm厚度)，置于2% TTC溶液中，在 37 ℃ 下避光孵育30 min，然后用10%甲醛固定、拍照，使用圖像分析軟件計算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比(%) =梗死面積×厚度/全腦體積×100%。

1.3.3 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測小鼠腦組織 GFAP 和 Nrf2蛋白表達水平 取各組小鼠腦組織，稱質量，剪碎后，置于玻璃勻漿器中，按比例加入RIPA組織蛋白裂解液，裂解、勻漿、離心，取上清，于-80 ℃ 冰箱保存。取部分蛋白提取液，用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質提取液的濃度。蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，分離總蛋白 (50 μg)并轉移到聚偏二氟乙烯膜上，將膜在室溫下用 5%脫脂牛奶封閉1 h，然后加入相應一抗 [GFAP抗體(1∶1000 )，Nrf2抗體(1∶1000)],4℃孵育過夜,TBST緩沖液洗滌 3次，將膜與特定的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在 37 ℃下孵育1 h。PBST洗滌后,用凝膠成像儀和分析軟件掃描免疫印跡并分析每個條帶的相對密度。最終結果表示為目標蛋白的光密度與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的光密度之比。

1.3.4 免疫熒光法檢測小鼠腦組織 GFAP 和 Nrf2陽性表達 將腦切片用4%甲醛溶液室溫固定30 min，1% Triton X-100孵育30 min，5%山羊血清37 ℃封閉1 h。然后分別加入GFAP 和 Nrf2抗體，4 ℃下孵育過夜。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌 3 次，加入二抗，37 ℃ 下反應 1 h。DAPI(1∶200) 在 37 ℃ 下染色細胞核10 min，次日4%多聚甲醛固定4 h，用含15%蔗糖的PBS共孵育4 h，去離子水清洗玻片，使用激光共聚焦掃描分析切片，對每組12只小鼠中每只小鼠5個不同視野中的陽性細胞進行計數。

2 結果

2.1 各組小鼠再灌注后24 h Longa's評分比較 再灌注后24 h，模型組小鼠Longa's 評分顯著高于假手術組(P<0.05)；蟾酥注射液低、中、高劑量組小鼠Longa's評分均顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠再灌注后24 h Longa's評分比較 分，

2.2 各組小鼠再灌注后72 h腦梗死體積百分比比較 再灌注后72 h，模型組小鼠腦梗死體積百分比顯著高于假手術組(P<0.05)；蟾酥注射液低、中、高劑量組小鼠腦梗死體積百分比均顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠再灌注后72 h腦梗死體積百分比比較

2.3 各組小鼠腦組織GFAP、Nrf2蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組小鼠腦組織GFAP蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Nrf2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，蟾酥注射液低、中、高劑量組GFAP蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，Nrf2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腦組織 GFAP、Nrf2蛋白表達比較

2.4 各組小鼠腦組織GFAP、Nrf2陽性細胞數比較 與假手術組比較，模型組小鼠腦組織GFAP陽性細胞數明顯升高(P<0.05)，Nrf2陽性細胞數明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，蟾酥注射液低、中、高劑量組GFAP陽性細胞數明顯降低(P<0.05)，Nrf2陽性細胞數明顯升高(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 各組小鼠腦組織 GFAP、Nrf2陽性細胞數比較 個/高倍鏡視野，

圖1 各組小鼠腦組織 GFAP、Nrf2陽性表達(免疫熒光染色)

3 討論

目前，腦缺血再灌注損傷已成為神經內外科研究的熱點，有關其發(fā)生機制的研究也很多，特別是有關星形膠質細胞與腦缺血再灌注損傷之間的關系，已有多項研究表明其參與腦缺血再灌注損傷發(fā)生。星形膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中最主要的膠質細胞，對神經元的生成、發(fā)育、再生和分化均有重要作用[11-12]。GFAP是來源于神經細胞的特異性蛋白因子，是膠質細胞特有的骨架蛋白，在維持神經細胞結構及功能完整性方面均發(fā)揮著積極作用，是星形膠質細胞活化的標志物。腦損傷發(fā)生后，損傷區(qū)域的星形膠質細胞增生，形成膠質“瘢痕”，隨后GFAP的表達增加[13]。因此，腦組織GFAP升高是中樞神經系統(tǒng)損傷的標志[14]。Nrf2活化在調控星形膠質細胞在脊髓缺血耐受中發(fā)揮著重要作用[15]，但是與腦缺血再灌注后星形膠質細胞增生的關系尚不清楚。有研究認為，Nrf2 是一種重要的抗氧化轉錄因子，作用于抗氧化應激系統(tǒng)，能夠通過抗炎、抑制氧化應激和神經細胞凋亡、促進血管生成等作用來減輕腦缺血再灌注損傷[16-17]。此外，Nrf2 已被證明可以負向調節(jié)核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體激活，因此在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用。另有研究表明，Nrf2通過調節(jié)活性氧水平、硫氧還蛋白系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)來抑制NLRP3 炎癥小體激活，從而降低氧化應激水平[18-19 ]。

蟾酥由蟾蜍表皮腺體的分泌物經干燥而成，味辛、性溫、有毒，具有清熱解毒、醒腦開竅等功效，其藥理活性強?，F(xiàn)代藥理研究證實，蟾酥具有抗炎、抗氧化應激等作用[20]；可增強心搏出量，降低心率，增強心肌收縮力[21]；還具有升壓作用，蟾酥的升壓作用平緩而迅速，維持時間長，能夠使腦、冠狀動脈、腎的血流量增加[22]；蟾酥還具有抗腫瘤作用，對人體免疫系統(tǒng)以及循環(huán)系統(tǒng)也有很強的保護作用[23]?，F(xiàn)代醫(yī)學技術通過改變劑型、聯(lián)合用藥等，使蟾酥的臨床應用范圍不斷擴大，被廣泛用于惡性腫瘤、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、惡性血液病等疾病的治療。蟾酥對腦缺血再灌注時星形膠質細胞的作用目前尚不清楚。本研究結果顯示，蟾酥注射液預處理后，各劑量組腦缺血再灌注小鼠Longa's 評分降低，腦梗死體積百分比縮小，GFAP蛋白表達及陽性細胞表達均明顯降低，Nrf2蛋白表達及陽性細胞表達均明顯升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明蟾酥對腦缺血再灌注小鼠腦功能具有一定的保護作用。

綜上，本研究結果初步表明蟾酥對腦缺血再灌注損傷小鼠腦功能具有一定的保護作用，可能是通過抑制GFAP 表達和增加Nrf2表達來實現(xiàn)的。但是蟾酥是如何調控GFAP 和Nrf2來使星形膠質細胞反應減輕的，尚需進一步深入研究。