李 琳，張 營(yíng)，趙晟珣，肖方喜，張林英，劉 菊

（武漢市第一醫(yī)院1.綜合醫(yī)療科，3.內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430022；2.長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430010）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見的慢性肝病，影響全球25%人口。NAFLD包括一系列肝病變，包括單純性肝脂肪變性和與纖維化進(jìn)展相關(guān)的小葉炎癥為特征的非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）以及可能導(dǎo)致肝功能衰竭或肝細(xì)胞癌的肝硬化［1］。肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征、血脂異常和心血管疾病在NAFLD中很常見，盡管肝病變相關(guān)死亡率在增加，但心血管疾病仍是NAFLD患者死亡的主要原因，尤其是NASH患者［2］。NAFLD的病理生理學(xué)極其復(fù)雜，其進(jìn)展的分子機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，幾乎所有NAFLD患者均存在肝胰島素抵抗（insulin resistance，IR），且IR的嚴(yán)重程度與NAFLD病情進(jìn)展密切相關(guān)［3］。盡管在治療靶點(diǎn)鑒定和治療策略方面取得了很大進(jìn)展，但目前仍無(wú)可有效治療NASH藥物獲批?；诖?，尋找有效的中藥或生物活性化合物的治療NASH的研究越來(lái)越引起人們關(guān)注。

天麻（Gastrodia elataB1.）又名赤箭，是蘭科天麻屬多年生草本植物，以其根莖入藥。藥典記載天麻味甘，性微濕，入肝經(jīng)，具有平肝熄風(fēng)、祛風(fēng)定驚的功效。天麻素（gastrodin，GSTD）是一種從天麻根莖中提取的低分子量生物活性化合物，臨床用于治療眩暈、癲癇和椎基底動(dòng)脈供血不足等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。據(jù)報(bào)道，癲癇發(fā)作時(shí)，GSTD通過(guò)升高神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）和抑制負(fù)責(zé)GABA代謝或降解的GABA氨基轉(zhuǎn)移酶或琥珀酸半醛還原酶，減少神經(jīng)元異常和過(guò)度放電［4］。在帕金森病中，GSTD通過(guò)上調(diào)核紅細(xì)胞2 p45相關(guān)因子（nuclear erythroid 2 p45-related factor，Nrf）表達(dá)，減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，降低病理刺激后神經(jīng)元和腦組織中促炎細(xì)胞因子水平，抑制多巴胺神經(jīng)元凋亡，減緩了帕金森病的進(jìn)展［5］。在認(rèn)知功能障礙和腦缺血再灌注損傷等其他疾病中，GSTD被認(rèn)為通過(guò)與上述類似的機(jī)制起作用，影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放、氧化應(yīng)激或細(xì)胞凋亡［6］。關(guān)于GSTD對(duì)NAFLD的保護(hù)作用的研究報(bào)道很少。近年來(lái)，GSTD已被證明可改善由高脂飲食或膽管結(jié)扎引起的肝細(xì)胞促炎癥反應(yīng)和纖維化［7］。然而，GSTD對(duì)高脂和高膽固醇（high fat and high cholesterol，HFHC）飲食引起的NASH的治療作用和機(jī)制尚不清楚。本研究探討GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠中的保護(hù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

HFHC飼料（14%蛋白質(zhì)、42%脂肪、44%碳水化合物和0.2%膽固醇）購(gòu)自中國(guó)南通特菲洛飼料科技有限公司；GSTD（純度＞98%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸二甲雙胍片（metformin hydrochloride，Met）（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20023371）購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruciv transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、膽固醇（cholesterol，TC）和游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；胰島素酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒購(gòu)于江蘇晶美生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒、RIPA組織蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；非凍型組織RNA保存液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Trizol總RNA抽提試劑購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒和2x SYBR qPCR擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；一抗：兔抗小鼠胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）多克隆抗體和磷酸化IRS1（phospho-IRS1，p-IRS1）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；兔抗小鼠蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）多克隆抗體、p-Akt單克隆抗體和β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠NF-κB單克隆抗體和p-NF-κB多克隆抗體購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司；二抗：HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司。血糖儀（安穩(wěn)+型）購(gòu)自三諾生物傳感股份有限公司；LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司；Infinite 200 PRO型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自?shī)W地利TECAN公司；AG 22331型低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；蛋白電泳和電轉(zhuǎn)移裝置購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Amersham Image 600凝膠成像儀，美國(guó)GE公司；T10B型電動(dòng)組織勻漿機(jī)購(gòu)自德國(guó)IKA公司；IX53PIF型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.2 動(dòng)物分組和給藥

6周齡雄性C57BL/6J小鼠，體重18～20 g，購(gòu)自于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0012，所有小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食和飲水，光照/黑暗環(huán)境循環(huán)為12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度保持在20℃～25℃，相對(duì)濕度保持在50%～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由武漢市第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理審核編號(hào)2018012。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為6組，每組8只：正常對(duì)照組、模型組、模型+GSTD 12.5，25.0 和50.0 mg·kg-1組及模型+Met 100 mg·kg-1組（陽(yáng)性對(duì)照，Met給藥劑量參考文獻(xiàn)［8］）。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠給予HFHC飲食24周建立NASH模型；第17周開始，HFHC飲食的同時(shí)ig給與相應(yīng)分組藥物，每天1次，連續(xù)8周。模型組和正常對(duì)照組ig給予等體積生理鹽水。

1.3 樣本制備和肝濕重、體重和肝指數(shù)檢測(cè)

1.2分組小鼠，GSTD和Met末次給藥2 h后，稱量小鼠體重。尾靜脈采血，血糖儀檢測(cè)血糖。眼球采血后處死小鼠，血樣不抗凝，靜置1 h后，3000×g常溫離心15 min，分離血清，分裝保存于-80℃。采血后，分離完整肝組織，稱量肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝重（g）/體重（g）×100。

取小鼠部分肝組織，0℃生理鹽水中勻漿，制成10%肝組織勻漿；部分肝組織采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，厚度5 μm；部分肝組織經(jīng)OCT包埋劑包埋后，恒冷箱切片機(jī)切片（-22℃），片厚10 μm，貼于預(yù)處理的載玻片上，-20℃冰箱保存；另取30 mg肝組織浸入1 mL非凍型組織RNA保存液中，置4℃冰箱過(guò)夜后，從RNA保存液中取出組織塊，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存；剩余肝組織經(jīng)液氮速凍后，-80℃冰箱保存。

1.4 HE、Masson和油紅O染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)損傷、膠原增生和脂質(zhì)沉積

取1.3制備的石蠟切片，脫蠟后進(jìn)行HE和Masson染色，光學(xué)顯微鏡明場(chǎng)狀態(tài)下HE染色觀察肝組織形態(tài)、脂肪變性和炎癥浸潤(rùn)情況；Masson染色觀察肝組織膠原纖維增生情況。參照文獻(xiàn)［9］標(biāo)準(zhǔn)對(duì)HE染色結(jié)果進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度積分（NAFLD activity score，NAS）評(píng)定。每組8只小鼠，每只小鼠HE拍照視野共15個(gè)，NAS以每只小鼠15個(gè)視野3部分〔脂肪變性（0～3）、小葉炎癥（0～3）和肝細(xì)胞氣球樣變（0～2）〕評(píng)分求和的均值表示。另取1.3制備的冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，光學(xué)顯微鏡明場(chǎng)狀態(tài)下拍照，觀察肝組織內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。

1.5 ELlSA檢測(cè)血清胰島素水平并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)

取1.3中分離的血清樣本，按ELISA說(shuō)明書檢測(cè)胰島素水平，胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=血清葡萄糖濃度（mmol·L-1）×血清胰島素濃度（mIU·L-1）/22.5。

1.6 化學(xué)顯色法檢測(cè)血清GPT和GOT活性

取1.3中分離的血清樣本，參照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)肝功能指標(biāo)GPT和GOT活性。

1.7 化學(xué)顯色法檢測(cè)肝組織TG，TC和NEFA水平

取1.3中制備的肝組織勻漿，5000×g4℃離心10 min，收集上清，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)肝組織TG、TC和NEFA水平。

1.8 化學(xué)顯色法檢測(cè)肝組織MDA和GSH水平及SOD和CAT活性

取1.3中制備的肝組織勻漿，5000×g4℃離心10 min，收集上清，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)MDA和GSH水平及SOD和CAT活性。

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝組織中脂質(zhì)合成、氧化、炎癥因子和纖維化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

取1.3中RNA保存液處理后的肝組織，Trizol法抽提總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書采用RevertAid first strand cDNA synthesis kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將模板、引物、水以及2x SYBR qPCR Master Mix按比例混合進(jìn)行RT-PCR，使用LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)條件為95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct表示待測(cè)基因mRNA相對(duì)水平。實(shí)時(shí)定量PCR引物由生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.10 Western印跡法檢測(cè)肝組織胰島素及炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化水平

取1.3中經(jīng)液氮速凍后保存的肝組織30 mg，加入2 mL RIPA裂解液4℃勻漿，按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取肝組織總蛋白，BCA比色定量蛋白。取40 μg蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液（體積比4∶1）混勻，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗（IRS，p-IRS：1∶1000；Akt，p-Akt：1∶2000；NF-κB，p-κB：1∶1500；β肌動(dòng)蛋白：1∶5000）4℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000），37℃室溫孵育1 h，經(jīng)ECL底物化學(xué)發(fā)光顯影，結(jié)果用Quantity One軟件定量分析條帶積分吸光度值，以p-IRS-1/IRS-1、p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB積分吸光度比值表示待測(cè)蛋白磷酸化水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，滿足方差同質(zhì)性的數(shù)據(jù)以±s表示。單因素方差分析比較各組間差異，組間兩兩比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，分析NAS評(píng)分結(jié)果，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝濕重、體重和肝指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠在HFHC飲食誘導(dǎo)24周后，肝濕重和體重增加（P＜0.01），肝指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組相比，模型+GSTD 50.0 mg·kg-1組肝濕重、體重和肝指數(shù)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+Met 100 mg·kg-1組肝濕重、體重和肝指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

Tab.2 Effect of gastrodin（GSTD）on liver mass，body mass，liver indexes of nonalcoholic steatohepatitis（NASH）mice fed with a high fat and high cholesterol（HFHC）diet

2.2 GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝組織結(jié)構(gòu)、膠原增生和脂質(zhì)沉積的影響

HE、Masson和油紅O染色結(jié)果見圖1，HE染色的NAS評(píng)分結(jié)果見圖2，正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周整齊排列，肝血竇可見少數(shù)枯否細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞內(nèi)有少量脂質(zhì)沉積，無(wú)明顯膠原增生。模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞質(zhì)疏松，出現(xiàn)嚴(yán)重的大泡性脂肪變性，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝組織匯管區(qū)有大量增生的膠原纖維。模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1組HFHC所致的肝脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維增生均有所改善。HE染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝NAS評(píng)分明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1組小鼠肝NAS評(píng)分顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Effect of GSTD on hepatic morphology，collagen deposition and lipid content of NASH mice fed with an HFHC diet by HE，Masson and Oil red O staining（×200）.See Tab.2 for the mouse treatment.Black arrows show liver pathological changes of the liver including inflammatory infiltration and steatosis，purple arrows show the fibrotic area，and blue arrows show the area of lipid deposiion.

Fig.2 Effect of GSTD on nonalcoholic fatty liver an disease activity score（NAS）of NASH mice fed with HFHC diet.See Tab.2 for the mouse treatment.NAS is the sum of the scores of three components：steatosis（0-3），lobular inflammation（0-3）and hepatocyte ballooning（0-2）.There are eight mice per group，with 15 images for each mouse.＊＊P＜0.01，compared with normal control group by Kruskal-Wallis H test；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group by Kruskal-Wallis H test.

2.3 GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠血糖、血清胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血糖和血清胰島素水平增加（P＜0.01），胰島素抵抗指數(shù)升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1組小鼠血糖和血清胰島素水平降低，胰島素抵抗指數(shù)降低（P＜0.01）（表3）。

Tab.3 Effect of GSTD on blood glucose，an insulin and HOMA-lR in serum of NASH mice fed with HFHC diet

2.4 GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠血清GPT和GOT活性的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清GPT和GOT活性明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+GSTD 12.5，25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1組血清GPT和GOT活性顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）（表4）。

Tab.4 Effect of GSTD on activities of glutamic pyruciv transaminase（GPT）and glutamic oxaloacetic transaminase（GOT）in serum of NASH mice fed with an HFHC diet

2.5 GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝組織TG，TC和NEFA水平的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織TG，TC和NEFA水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+GSTD 50.0 mg·kg-1和模型+Met 100 mg·kg-1組肝組織TG和NEFA水平降低（P＜0.01）。同時(shí)，與模型組相比，模型+GSTD 50.0 mg·kg-1組小鼠肝組織TC水平顯著降低（P＜0.01），而模型+Met 100 mg·kg-1組TC水平無(wú)明顯變化（表5）。

Tab.5 Effect of GSTD on levels of triglyceride（TG），cholesterol（TC）and nonestesterified fatty acid（NEFA）in liver tissue of NASH mice fed with an HFHC diet

2.6 GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝組織MDA和GSH水平及CAT和SOD活性的影響

結(jié)果如表6所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織MDA水平升高（P＜0.01），SOD、CAT活力和GSH水平降低（P＜0.01）；與模型組小鼠比較，模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1組肝組織MDA水平降低（P＜0.05，P＜0.01），SOD、CAT 活性和GSH水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，模型+Met 100 mg·kg-1組SOD、CAT活性和GSH水平升高（P＜0.01，P＜0.05），而MDA水平與模型組比較無(wú)明顯變化。

Tab.6 Effect of GSTD on levels of MDA，GSH，and activities of CAT and SOD in liver tissue of mice fed with an HFHC diet

2.7 GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝脂質(zhì)合成和氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果如表7所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織FASN，CD36，SCD1和PPARγmRNA水平升高（P＜0.01），PPAR α和CPT1αmRNA水平降低（P＜0.01）；與模型組小鼠比較，模型+GSTD 50.0 mg·kg-1組肝組織FASN、CD36、SCD1 和PPARγmRNA水平明顯降低（P＜0.01），PPARα和CPT1αmRNA水平升高（P＜0.01），模型+Met 100 mg·kg-1組肝組織CD36 mRNA水平明顯降低（P＜0.01），CPT1αmRNA水平明顯升高（P＜0.01）。

Tab.7 Effect of GSTD on levels of FASN，CD36，SCD1，PPAR γ，PPAR α and CPT1 α mRNA in liver tissues of NASH mice fed with an HFHC diet by RT-qPCR

2.8 GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝組織炎癥因子基因mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果如表8所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織TNF- α，IL-6，IL-1β，CCL2和CCL5mRNA水平升高（P＜0.01）；與模型組小鼠比較，模型+GSTD25.0和50.0mg·kg-1以及模型+Met100mg·kg-1組肝組織TNF- α、IL-6、IL-1β、CCL2和CCL5mRNA水平均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.8 Effect of GSTD on levels of TNF- α，IL-1 β，IL-6，CCL2 and CCL5 mRNA in liver tissue of NASH mice fed with an HFHC diet by RT-qPCR

2.9 GSTD對(duì)HFHC誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝組織纖維化標(biāo)志物基因mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果如表9所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織ColⅠ α1，Actα2，CTGF和TGF- β1mRNA水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+GSTD25.0 和 50.0 mg·kg-1組肝組織ColⅠ α1，Actα2，CTGF和TGF- β1mRNA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；模型+Met 100 mg·kg-1組肝組織ColⅠ α1和TGF- β1mRNA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），而Actα2和CTGFmRNA水平與無(wú)明顯變化。

Tab.9 Effect of GSTD on levels of ColⅠ α1，Act α2，CTGF and TGF- β1 mRNA in liver tissue of NASH mice fed with an HFHC diet by RT-qPCR

2.10 GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝組織lRS-1，Akt和NF- κB蛋白磷酸化水平的影響

Western印跡結(jié)果如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中IRS-1和Akt磷酸化水平降低（P＜0.01），NF-κB的磷酸化水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+GSTD 25.0和50.0 mg·kg-1及模型+Met 100 mg·kg-1組小鼠肝組織中IRS-1和Akt磷酸化蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），NF-κB磷酸化蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of GSTD on phosphorylation levels of insulin receptor substrate 1（lRS-1），protein kinase B（Akt）and NF- κB in liver tissue of NASH mice fed with HFHC by Western blotting.See Tab.2 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝功能受損，肝組織內(nèi)脂質(zhì)（TG，TC和NEFA）沉積增加，脂質(zhì)合成基因FASN，CD36，SCD1和PPAR γmRNA水平增加，脂質(zhì)氧化基因PPAR α和CPT1 αmRNA水平下降。同時(shí)，肝組織內(nèi)MDA含量升高，抗氧化系統(tǒng)中SOD和CAT活性及GSH水平降低，并伴有較高的炎癥因子（TNF-α，IL-6，IL-1β，CCL2和CCL5）和纖維化標(biāo)志物（ColⅠα1，Actα2，CTGF和TGF-β1）基因mRNA水平。與臨床NASH患者表現(xiàn)出相似的病理特征。ig給予GSTD治療后，肝功能受損、脂質(zhì)代謝紊亂、肝內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和纖維化指標(biāo)均明顯逆轉(zhuǎn)，表明GSTD對(duì)HFHC所致的NASH具有顯著改善效果。

NAFLD的病因及發(fā)病機(jī)制具有多樣性，IR和脂質(zhì)代謝紊亂仍是目前該病發(fā)生的關(guān)鍵因素［10］。多項(xiàng)研究表明，脂質(zhì)代謝主要受胰島素信號(hào)通路調(diào)節(jié)，肝脂質(zhì)積累與IR密切相關(guān)［11］。生理狀態(tài)下，人體攝入的NEFA會(huì)被輸送到肝，轉(zhuǎn)化為TG并轉(zhuǎn)運(yùn)至脂肪組織。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)IR時(shí)，隨著NEFA的大量增多，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性。IRS-1作為一種由胰島素受體酪氨酸激酶磷酸化的蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。已在包括2型糖尿病和NAFLD代謝疾病中觀察到，IR導(dǎo)致胰島素敏感性降低，并伴隨p-IRS-1水平降低［12-13］。IRS-1的激活對(duì)于胰島素信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要，這可能有利于減輕NAFLD。而Akt是胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)的另一個(gè)重要組成部分。胰島素與胰島素受體結(jié)合后，胰島素受體酪氨酸位點(diǎn)被磷酸化，隨后觸發(fā)Akt激活［14］。IR伴隨著NAFLD中Akt磷酸化的降低，維持適當(dāng)?shù)膒-Akt水平可以改善肝脂肪變性［15］。因此，激活I(lǐng)RS-1/Akt信號(hào)是提高胰島素敏感性和改善NAFLD的有效途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，GSTD能逆轉(zhuǎn)HFHC造成的NASH小鼠肝脂肪樣變，改善肝功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GSTD能明顯激活肝內(nèi)IRS-1/Akt信號(hào)通路，可能是GSTD改善HFHC所致NASH的潛在部分機(jī)制。值得一提的是，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）是影響脂質(zhì)積累關(guān)鍵因素，GSTD主要通過(guò)激活A(yù)MPKα來(lái)減弱肝脂質(zhì)積累，但不影響白色脂肪組織中的脂質(zhì)積累［16］。然而，AMPK強(qiáng)大而普遍的病理生理功能可能會(huì)引發(fā)某些不良副作用。NASH作為一種具有多種代謝并發(fā)癥的疾病（如高血糖、高血脂和肥胖等），針對(duì)其病理環(huán)節(jié)的單一靶點(diǎn)藥物治療效果有限。本研究發(fā)現(xiàn)，GSTD的藥理作用不局限于對(duì)脂質(zhì)代凋紊亂的調(diào)節(jié)作用，其對(duì)NASH病變相關(guān)的高糖血癥、肥胖和肝纖維化素均有顯著緩釋作用。因此，相比AMPK激動(dòng)劑或降糖藥來(lái)說(shuō)，GSTD可能是一種很有前景的治療NASH藥物。

促氧化物與抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)失衡將導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激與隨后產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化和炎癥反應(yīng)則是促進(jìn)NAFLD發(fā)展的重要因素［17］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)以還原型GSH和CAT等為主的抗氧化系統(tǒng)未能及時(shí)清除活性氧時(shí)，氧化還原失衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激。值得注意的是，脂質(zhì)誘導(dǎo)反應(yīng)性氧化物產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，然后通過(guò)NF-κB激酶抑制因子激酶途徑促進(jìn)肝細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子。隨后，被激活募集的炎癥細(xì)胞持續(xù)釋放炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)一步加劇肝炎癥反應(yīng)［18］。此外，在氧化應(yīng)激的整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，免疫系統(tǒng)的反應(yīng)也會(huì)增強(qiáng)，增加ColⅠ沉積，促使纖維化的發(fā)生［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，GSTD能明顯緩解NASH小鼠肝內(nèi)氧化應(yīng)激，抑制肝纖維化的發(fā)展，抑制NF-κB蛋白磷酸化，減輕炎癥反應(yīng)，這可能是GSTD改善NASH的另一種機(jī)制。

綜上，GSTD對(duì)HFHC飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH具有明顯改善效果，其作用機(jī)制可能與激活肝內(nèi)IRS-1/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、緩解氧化應(yīng)激和抑制NF-κB信號(hào)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。