岑鎧麗，陳 明，莢耘路，沈 朋

（浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院腫瘤內科，浙江 杭州 310000）

順鉑是一種具有抗癌活性的金屬鉑類配合物。自1978年在美國批準上市后，被廣泛應用于胃癌、卵巢癌和肺癌等多種實體腫瘤的治療［1］。但在治療過程中，大多數(shù)患者出現(xiàn)順鉑耐藥，不僅影響了順鉑的療效，還成為腫瘤復發(fā)的主要原因［2］。因此，明確順鉑耐藥的機制有助于研發(fā)新藥，改善臨床治療手段。

氧化應激是順鉑發(fā)揮抗腫瘤效應的主要機制之一。順鉑不僅能夠結合并消耗細胞內的還原性物質，而且能與線粒體DNA形成絡合物，導致線粒體功能紊亂，活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生增加，從而誘導氧化應激，最終導致細胞死亡［2］。然而，腫瘤在不斷接受順鉑刺激并最終演變成耐藥細胞的過程中，ROS代謝異常與順鉑耐藥的發(fā)生密切相關。一方面，順鉑耐藥細胞通過促進順鉑外排、減少ROS產生、增加谷胱甘肽等還原物質合成等降低順鉑誘導的氧化應激，增強其對順鉑的抵抗。另一方面，細胞內ROS還參與調控順鉑作用的多個環(huán)節(jié)，包括順鉑的轉運、DNA損傷修復和信號通路等。本綜述將對順鉑耐藥腫瘤中的ROS代謝特點以及ROS對順鉑耐藥的調控機制進行闡述，并總結目前基于ROS代謝的治療策略，為提高順鉑的臨床療效提供參考。

1 順鉑耐藥腫瘤中的活性氧代謝

1.1 活性氧概述

ROS是氧分子衍生物的統(tǒng)稱，包括單線態(tài)氧、過氧化氫（H2O2）、羥自由基、超氧陰離子、一氧化氮和過氧亞硝基陰離子等［3］。在真核生物中，超氧陰離子往往是ROS的最初形式，但其性質不穩(wěn)定，易轉化成相對較穩(wěn)定、長效的H2O2。因此，H2O2是細胞內最主要的ROS形式［4］。正常情況下，細胞內的ROS能夠維持在較低的生理水平，調控細胞增殖、遷移和血管生成等活動［5］。但當細胞內ROS含量大幅度增加，遠超過細胞的生理水平以及代償范圍時，就會導致核酸和蛋白質等發(fā)生氧化變性，導致細胞死亡［6］。

為維持氧化還原的動態(tài)平衡，細胞內存在多種抗氧化系統(tǒng)，主要包括：①谷胱甘肽（glutathione，GSH）系統(tǒng)。GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成，是細胞內最豐富的還原性物質［4］，其與谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）以及NADPH共同組成了GSH還原系統(tǒng)。在GPx的作用下，還原型GSH提供電子轉化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），同時，H2O2被還原生成水。而GSSG又能在GR的作用下，由NADPH提供電子，重新生成GSH［6］。② 硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）系統(tǒng)。TRX是小蛋白抗氧化劑，其與TRX還原酶（TRX reductase，TrxR）和NADPH組成硫氧還蛋白系統(tǒng)，在生物中高度保守［7］。還原型TRX將H2O2還原成水，生成的氧化型TRX又能夠在TrxR作用下，由NADPH提供電子，重新還原成還原型TRX［8］。

1.2 順鉑作用下腫瘤細胞中ROS來源

1.2.1 線粒體電子傳遞鏈

目前研究認為，在多種類型的腫瘤細胞中，順鉑誘導的ROS主要來源于線粒體電子傳遞鏈。Marullo等［9］發(fā)現(xiàn)，在線粒體DNA缺失的前列腺癌細胞中，順鉑誘導ROS生成的能力明顯下降，同時該類腫瘤對順鉑的敏感性也減弱。Kleih等［10］在卵巢腫瘤中發(fā)現(xiàn)，順鉑能夠通過促進線粒體生成來提高線粒體ROS水平，而用寡霉素A（ATP合酶抑制劑）抑制線粒體氧化磷酸化，能夠有效降低線粒體ROS水平以及順鉑的細胞毒性。表明線粒體電子傳遞鏈在順鉑誘導的氧化應激中發(fā)揮了重要作用。

1.2.2 NADPH氧化酶

NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）也是順鉑作用下細胞內ROS的重要來源［11］。研究表明，NOX蛋白家族由NOX1～NOX5及雙氧化酶1和雙氧化酶2組成，它們能夠利用供體NADPH將其電子傳遞給分子氧，從而生成超氧陰離子［5］。然而，NOX表達具有組織特異性。如，NOX2在肺泡上皮組織中高表達，介導順鉑作用下肺癌細胞內ROS產生［12］。而膠質瘤組織中則高表達NOX4，通過提高細胞內ROS促進腫瘤對順鉑的應答［13-14］。

1.3 順鉑耐藥腫瘤中ROS的代謝異常

在順鉑治療過程中，腫瘤細胞會逐漸適應并調整細胞內的ROS代謝活動，最終導致順鉑耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑耐藥的腫瘤中，順鉑誘導ROS的能力明顯下降［15］?？蓺w結于以下3個方面機制。

1.3.1 胞內順鉑的累積減少

目前為止，多種順鉑轉運體被相繼報道，它們能夠參與順鉑的跨膜運輸。按功能可分為攝取型和外排型2類。

銅離子轉運體 1（copper transporter 1，Ctr1）是細胞攝取銅離子的主要轉運體，也是腫瘤細胞主動攝取順鉑的主要轉運體［16］。在順鉑耐藥的卵巢腫瘤中，Ctr1蛋白不僅表達下降，且易發(fā)生核心巖藻糖基化修飾，導致其對順鉑的攝取能力降低［17-19］。ATP7A和ATP7B是P-型銅外排ATP酶，被證明能夠分別介導早期和晚期順鉑外排活動［20-21］。在部分順鉑耐藥的腫瘤中存在ATP7A和ATP7B高表達，與其耐藥特性密切相關［22-23］。此外，ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉運蛋白家族成員中的ABCB1、ABCC1和ABCG2等，亦被證明參與順鉑等化療藥物的外排，與腫瘤的多藥耐藥相關［24］。

攝取型轉運體減少，外排型轉運體增加，導致腫瘤細胞內順鉑累積減少，氧化應激誘導受限，是介導順鉑耐藥的重要機制之一［2］。

1.3.2 ROS生成減少

線粒體和NOX作為細胞內ROS的主要來源，其含量以及功能異常會直接影響順鉑誘導下ROS的產生，調控腫瘤耐藥。Kleih等［10］發(fā)現(xiàn)，相較于親本細胞，順鉑耐藥的卵巢腫瘤細胞線粒體含量明顯減少，同時在順鉑刺激下產生ROS的能力也明顯下降。在順鉑耐藥的骨肉瘤中，DNA脫嘌呤或嘧啶位點核酸內切酶在線粒體中富集，它通過抑制小GTP結合蛋白RAC1磷酸化，從而減少線粒體ROS的產生［25］。此外，在順鉑耐藥的卵巢腫瘤和肺癌中，極性蛋白scribble表達減少，其能夠通過富含亮氨酸的重復片段結構域與NOX2結合，防止NOX2被蛋白酶體降解［25］。Pan等［26］發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細胞系中，肌醇-三磷酸3-激酶B的蛋白表達水平與腫瘤對順鉑的耐受程度呈正相關。機制上，其代謝產物肌醇1，3，4，5-四磷酸鹽能夠競爭性結合并抑制NOX4的活性，從而減少ROS的產生。

1.3.3 還原性物質增加

腫瘤細胞內還原性物質增加，也是導致ROS代謝異常的重要原因。核轉錄因子紅系2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是細胞內重要的抗氧化組分，其在腫瘤細胞中的高表達被證明與順鉑耐藥密切相關［27-28］。作為轉錄因子，Nrf2能夠促進多種抗氧化相關基因的轉錄，如過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等，緩解細胞內的氧化應激，從而削弱順鉑的抗腫瘤效應［29］。GPx是機體內廣泛分布的過氧化物分解酶，能通過催化GSH，將有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物［30］。研究表明，GPx1［31］和 GPx2［32］在順鉑耐藥的肺癌細胞系中高表達，通過降解細胞內的ROS來介導腫瘤對順鉑耐藥。溶質載體蛋白家族7成員A11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）是細胞氨基酸轉運系統(tǒng)Xc-的功能性亞基，介導細胞對胱氨酸的攝取，參與胞內GSH的合成。研究表明，順鉑耐藥的胃癌細胞高表達SLC7A11，采用柳氮磺吡啶（SLC7A11抑制劑）能夠明顯提高腫瘤細胞內ROS水平，降低GSH水平，增加細胞對順鉑的敏感性［33］。谷胱甘肽 S 轉移酶（glutathione S-transferase，GST）是GSH合成的關鍵酶。在順鉑耐藥的腫瘤細胞中，GST活性明顯提高，敲減GST能夠降低腫瘤對順鉑的耐藥［34］。H-鐵蛋白亦是抗氧化系統(tǒng)的重要組成成分，它能夠包裹細胞內鐵，從而抑制鐵離子介導ROS產生［35］。Salatino等［36］發(fā)現(xiàn)，H-鐵蛋白在順鉑耐藥的OVCAR3卵巢癌細胞中表達增加，表明其參與了腫瘤順鉑耐藥的調控。

2 活性氧調控腫瘤順鉑耐藥的機制

目前研究認為，ROS是腫瘤進展過程中的一把雙刃劍。一方面，ROS是多種化療藥物發(fā)揮抗腫瘤效應的主要機制之一［37］，另一方面，ROS能夠調節(jié)順鉑作用的諸多環(huán)節(jié)，如上調順鉑轉運體的表達、增強細胞DNA損傷修復能力、提高Nrf2和低氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的蛋白水平和轉錄活性以及調控線粒體動態(tài)活動等，最終影響腫瘤的耐藥進程。

2.1 上調順鉑轉運體表達

研究表明，在非小細胞肺癌中，限糖［38］和表沒食子兒茶素沒食子酸酯［39］能夠通過增加細胞內ROS上調Ctr1蛋白表達，從而促進順鉑在胞內的累積，增加腫瘤對順鉑敏感性。然而，同樣也是在非小細胞肺癌，高表達的EF手域家族成員D2則通過上調NOX4/ROS/ABCC1通路來促進順鉑外排，從而介導順鉑耐藥［40］。低氧條件誘導的ROS則能通過提高HIF-1α水平，促進ABCB1和ABCC1轉錄，促進順鉑的外排［41］。此外，在頭頸部鱗癌中，跨膜蛋白16A（Ca2+激活的氯離子通道）能夠通過上調NOX2來促進提高細胞內ROS，后者能夠上調ATP7B表達，減少順鉑的胞內累積，介導順鉑耐藥［42］。以上研究表明，細胞內ROS對順鉑轉運體的調控可能受多種因素影響，如刺激的種類、腫瘤細胞品系、細胞內ROS升高幅度、持續(xù)時間及ROS產生的部位。

2.2 增強細胞DNA損傷修復能力

DNA損傷應答包括細胞對損傷的感知、信號的轉導以及修復或者死亡程序的執(zhí)行等多個過程［43］。應答初期，損傷信號能夠招募并激活共濟失調毛細血管擴張突變蛋白［44］、共濟失調毛細血管擴張突變和RAD3相關蛋白（ataxia telangiectasia-mutated and Rad3 related factor，ATR）等損傷識別蛋白［45］，通過細胞周期檢測點激酶1（checkpoint kinase1，Chk1）和Chk2等轉導損傷信號，調控細胞周期檢查點蛋白活性，導致細胞周期阻滯［46］。與此同時，多種修復程序，包括核苷酸切除修復、同源或非同源重組修復等啟動，開始修復損傷的DNA。若DNA損傷被修復，細胞則重新進入細胞周期；但當DNA損傷超過了自身的修復能力，損傷信號持續(xù)存在，Chk1/Chk2能夠通過激活p53等下游信號，啟動細胞死亡相關程序［47］。因此，ROS對細胞命運的調控也受細胞本身損傷修復能力的影響。一方面，ROS能夠介導多種理化因素，如電離輻射及蒽環(huán)類和順鉑等化療藥物對細胞DNA造成不可逆損傷，直接導致細胞死亡［48］。另一方面，ROS也能通過激活細胞內DNA損傷應答，啟動多種修復相關程序，從而維持基因組的完整性［49］。在卵巢腫瘤中，ROS能夠通過激活ATR/Chk1通路，促進DNA損傷修復，從而介導對順鉑耐藥［50］。在結腸癌和肝癌中，ROS也能夠通過激活組蛋白去乙?；?，使尿嘧啶DNA糖苷酶2上第78位賴氨酸去乙酰化，減少其被泛素化降解，而后者則能夠切除DNA分子上錯誤形成的胞嘧啶堿基，是堿基切除修復的重要組分［51］。此外，ROS還能夠通過促進RNA去甲基化酶ALKB同源蛋白5類泛素化，從而抑制其功能，導致細胞整體mRNA m6A水平增加，促進DNA修復相關基因表達，以保持基因完整性［52］。

2.3 提高Nrf2蛋白水平和轉錄活性

Nrf2是細胞內抗氧化系統(tǒng)的重要組成之一。正常情況下，Nrf2與Keap1-cullin3-E3泛素連接酶復合體結合，通過蛋白酶體系統(tǒng)降解，維持在低水平穩(wěn)態(tài)。但當細胞內ROS水平提高時，Nrf2與復合體解離，入核并啟動下游基因的轉錄［37］。Nrf2異常表達與腫瘤順鉑耐藥密切相關，抑制Nrf2也被認為是克服腫瘤順鉑耐藥的治療手段。在非小細胞肺癌中，高表達的孕激素和脂聯(lián)素分子受體家族4能夠通過抑制Nrf2與Keap1結合，從而促進Nrf2入核轉錄NADPH醌氧還原酶1、谷氨酸-半胱氨酸連接酶重鏈亞基及修飾亞基、GR和TrxR等抗氧化蛋白，增強腫瘤對順鉑的耐受［53］。此外，絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1能夠與Nrf2結合并抑制其被泛素化降解，從而促進細胞內GSH合成，提高細胞糖酵解代謝，增加腫瘤細胞對順鉑的耐受［54］。在順鉑耐藥的胃癌細胞中，轉錄激活因子3低表達與腫瘤的不良預后相關，而過表達轉錄激活因子3則能通過抑制Nrf2/Keap1/SLC7A11通路而增加腫瘤對順鉑的敏感性［55］。此外，Nrf2還能夠通過調控順鉑轉運蛋白 ABCG2［56］和 ABCB1［57］影響腫瘤對化療藥物的敏感性。

2.4 提高HlF-1α蛋白水平和轉錄活性

在血管平滑肌細胞中，ROS能夠降低細胞內的抗壞血酸鹽，而后者能夠增加HIF-1α脯氨酰羥化酶活性，促進HIF-1α降解［58］。此外，在結腸癌中，溶質載體蛋白家族34成員A2（solute carrier family 34 member 2，SLC34A2）對HIF-1α表達的調控也依賴于ROS，使用抗氧化劑丁基羥基茴香醚能夠下調SLC34A2過表達的結腸癌細胞中HIF-1α的蛋白水平［59］。而作為轉錄因子，HIF-1α能夠促進多種耐藥相關基因轉錄。在結腸癌中，HIF-1α能夠通過轉錄Zeste基因增強子人類同源物2來介導結腸癌對順鉑的耐藥［60］。此外，在膀胱癌中，HIF-1α被證明能夠通過促進miR-424轉錄來抑制UNC5同源家族B和去乙?；?的表達，從而降低腫瘤細胞對順鉑的應答［61］。免疫球蛋白樣和上皮生長因子樣域酪氨酸激酶1（tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1，Tie1）曾被證明能夠通過增強細胞核苷酸切除修復能力來介導對順鉑等DNA 損傷藥物耐藥［62］。Li等［63］發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌中，HIF-1α能夠通過直接結合Tie1基因上游的缺氧反應元件，從而促進Tie1轉錄，介導腫瘤干細胞性以及順鉑耐藥。此外，HIF-1α還能通過促進自噬相關蛋白4B［64］、真核細胞翻譯起始因子5A2［65］等自噬相關基因的轉錄，啟動細胞保護性自噬，介導腫瘤對順鉑的耐受。

2.5 調控線粒體動態(tài)活動

線粒體是真核細胞的能量代謝中心，同時在細胞凋亡進程中發(fā)揮重要作用，其數(shù)量、形態(tài)和功能受到多種因素的精密調控［66］。其中，ROS能夠通過調控細胞線粒體的動態(tài)活動來影響細胞代謝以及凋亡等進程，從而影響腫瘤對順鉑敏感性。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活物1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α，PGC-1α）能夠通過促進核轉錄復合體以及線粒體DNA轉錄相關因子的形成，來調節(jié)線粒體關鍵蛋白的合成，因而是線粒體生成的重要蛋白［67］。在非小細胞肺癌［68］和卵巢腫瘤［69］中，ROS能夠通過提升PGC-1α的表達，增加線粒體數(shù)量，提高線粒體內膜電位，同時促進細胞代謝向氧化磷酸化轉化，導致耐藥腫瘤的形成。此外，在卵巢腫瘤中，ROS還能夠促進動力相關蛋白1依賴的線粒體分裂，介導順鉑耐藥［70］。而在頭頸部鱗狀細胞癌中，ROS則能通過提高HIF-1α水平來促進線粒體分裂相關因子轉錄，從而介導線粒體分裂，增加腫瘤對順鉑的敏感性［71］。腫瘤壞死因子受體相關蛋白 1（tumor necrosis factor receptor-associated protein 1，TRAP1）是一種線粒體熱休克蛋白，能通過減少線粒體ROS的產生降低化療藥物對腫瘤細胞的殺傷［72］。順鉑耐藥肺癌細胞TRAP1高表達，抑制TRAP1后能夠有效提高順鉑作用下線粒體ROS的水平，降低線粒體膜電位，促進細胞色素c的釋放，導致細胞凋亡［73］（圖1）。

圖1 活性氧調控腫瘤順鉑耐藥的機制.Ctr1：銅離子轉運體1；ABCB1：ATP結合盒亞家族B成員1；ABCC1：ATP結合盒亞家族C成員1；ATR：共濟失調毛細血管擴張突變和RAD3相關蛋白；Chk1：細胞周期檢測點激酶1；UNG2：尿嘧啶DNA糖苷酶2；m6A：N6-腺苷酸甲基化；Nrf2：核轉錄相關因子紅系2；HO-1：血紅素氧合酶1；NQO1：NADPH醌氧還原酶1；SLC7A11：溶質載體蛋白家族7成員A11；GSH:谷胱甘肽；ABCG2:ATP結合盒亞家族G成員2；HIF-1α：低氧誘導因子1α；EZH2：Zeste基因增強子人類同源物2；Tie1：免疫球蛋白樣和上皮生長因子樣域酪氨酸激酶1；ATG4B：自噬相關蛋白4B；eIF5A2：真核細胞翻譯起始因子5A2；PGC-1α：過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1α；Drp1：動力相關蛋白1.

3 靶向ROS的腫瘤治療新策略

基于耐藥腫瘤中ROS的代謝特點以及ROS調控腫瘤順鉑耐藥的機制，目前已有大量的藥理學研究據(jù)此展開，按照其作用機制可分為ROS誘導劑和抗氧化系統(tǒng)抑制劑2類（表1）。

表1 通過調節(jié)細胞內ROS促進順鉑增敏的藥物

3.1 ROS誘導劑

ROS誘導劑是指在聯(lián)合順鉑后，能夠大幅度提高腫瘤內ROS水平，使其達到細胞毒性水平的藥物。在舌鱗癌中，褪黑素（melatonin）聯(lián)合順鉑能夠明顯提高細胞內ROS水平，相較順鉑單用組，聯(lián)合用藥能夠誘導更多的腫瘤細胞發(fā)生凋亡［74］。在喉鱗癌中，姜黃素（curcumin）聯(lián)合順鉑能夠進一步提高腫瘤細胞和線粒體ROS水平，最終導致腫瘤細胞死亡［75］。此外，唑來膦酸（zoledronic acid）［76］、靈芝酸D（ganoderic acid D）［77］、白花丹素（plumbagin）［78］和蓽拔酰胺（piperlongumine）［79］等其他多種藥物亦有相似報道。

3.2 抗氧化系統(tǒng)抑制劑

抗氧化系統(tǒng)抑制劑是指能夠通過抑制細胞內的抗氧化分子，間接提高細胞內ROS的藥物。Nrf2作為細胞內主要的抗氧化蛋白，曾被證明是多種順鉑增敏藥物的作用靶點。在胃癌中，猶素修飾系統(tǒng)關鍵蛋白是預后良好的標志。它能夠通過泛素化降解Nrf2，減少下游醛酮還原酶的轉錄，從而提高順鉑作用后細胞內ROS水平，增加胃癌對順鉑的敏感性［80］。氟米松（flumethasone）［81］和葫蘆巴堿（trigonelline）［82］能夠分別通過降低細胞內 Nrf2 表達水平和功能，從而增加腫瘤對順鉑的敏感性。除Nrf2外，其他抗氧化蛋白也是作為順鉑增敏劑的潛在靶點。在結腸癌細胞中，異脫氧象皮素（isodeoxyelephantopin）能夠通過抑制TrxR1的活性，提高細胞內ROS水平［83］。在肺癌中，敲除GPx4或者采用GPx4抑制劑RSL3能夠有效增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性并促進細胞發(fā)生鐵死亡［84］。ent-貝殼杉烷類二萜（ent-kaurane diterpenoids）則能夠通過直接結合GSH并抑制其還原性，逆轉肺癌對順鉑的耐藥［85］。此外，Kawahara等［86］還設計了一種新型的一氧化碳搭載系統(tǒng)，在可見光誘導下，該系統(tǒng)能夠在腫瘤局部釋放一氧化碳，后者能夠通過抑制胱硫醚β-合成酶，降低細胞內GSH以及金屬硫蛋白的水平，從而逆轉卵巢腫瘤順鉑耐藥。Chen等［87］設計了一種包含順鉑和GST抑制劑的鉑（IV）前藥，它能夠在順鉑耐藥的肺癌細胞中造成更多的DNA損傷，介導腫瘤細胞死亡。

4 結語

順鉑是多種實體瘤臨床化療方案的基石，但是順鉑的耐藥問題極大地限制了它的臨床療效。因此，克服順鉑耐藥是亟待解決的一大臨床難題。目前為止，很多研究提示，ROS代謝異常是順鉑耐藥的重要機制，一方面腫瘤能夠通過多種機制降低細胞內活性氧，增強對化療藥物的耐受，另一方面活性氧本身在腫瘤對順鉑耐藥形成過程中亦發(fā)揮了重要作用，然而相關的分子機制仍有待進一步完善和研究。此外，ROS水平作為衡量腫瘤對順鉑等化療藥物應答能力的重要標志，如何在臨床中構建基于ROS水平的評價體系，改進化療藥物療效預估和評價也仍需進一步探索。相信ROS相關分子機制的闡明以及新型藥物的研發(fā)，定能為逆轉腫瘤順鉑耐藥提供更有效的治療策略和方案。