胡 睿，阿斯亞·白依賽提，祁 榮

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100191；3.新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院，新疆 克拉瑪依 834000）

柚皮素（naringenin，NGN）是二氫黃酮類化合物［1］，主要存在于柑橘類水果中［2］。研究表明，NGN具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等藥理活性［3-6］，并具有抑制肝纖維化作用，在體內(nèi)和體外肝損傷模型中具有良好的保肝活性［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NGN可通過抑制炎癥相關(guān)通路的激活達(dá)到抑制油酸和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用，以及抗蛋氨酸-膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的作用［8］，這與常規(guī)通過調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗或控制肥胖等策略治療NAFLD有所不同。

NGN水溶性和脂溶性均較差［9］，且其腸吸收受小腸上皮細(xì)胞膜表面P-糖蛋白外排作用的影響，生物利用度低，影響其藥理活性。研究者嘗試將NGN制備成納米乳［10］、納米粒［11］和自微乳［12］等制劑，以改善NGN的口服生物利用度并提高其藥理作用。本課題組前期研究結(jié)果表明，將NGN制備成納米脂質(zhì)體（nanoliposomes，NL）可明顯增加其口服吸收和抗NAFLD的藥效作用［13］，但NL仍存在制劑儲(chǔ)存穩(wěn)定性差等問題［14］。對(duì)NL進(jìn)行改進(jìn)產(chǎn)生的新一代的脂質(zhì)納米顆粒，如固體脂質(zhì)納米粒和納米脂質(zhì)載體等［15］以及大分子包覆［16］均能增加NL的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

茶多酚具有抗氧化［17］、抗炎［18］和抗菌［19］活性，但其對(duì)光、氧氣和溫度等敏感，易降解為無生物活性的中間產(chǎn)物。因此，多酚生物利用度相對(duì)較低［20］。為解決多酚穩(wěn)定性和生物利用度差的問題，有研究者將其聚合制備成納米顆粒，用于開發(fā)新型功能性食品［21］；也將其作為功能性材料組裝在各種模板表面［22］，使其兼具功能性和藥理活性。

本研究將茶多酚聚合為聚茶多酚（poly-tea polyphenol，PTP）并包覆在NGN-NL表面制成PTP包覆的NGN-NL（PTP@NGN-NL），研究PTP包覆是否增加NGN-NL制劑穩(wěn)定性，以及是否提高NGN的抗肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積作用，為開發(fā)治療NAFLD臨床新藥奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品、主要試劑和儀器

NGN（純度93%），日本TCI公司；茶多酚（純度98%），上海晶都生物有限公司；膽固醇和磷脂，上海阿拉丁生化科技有限公司；肝素，北京華中海威基因科技有限公司；油酸，日本TCI公司；LPS，上海源葉生物科技有限公司；水合氯醛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基，北京全式金公司；甘油三酯測(cè)定試劑盒（批號(hào)：R21738-96T）；北京中生北控生物科技公司；碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、三氯甲烷、甲醇、氯化鉀、氯化鈣、碳酸鈣、鹽酸和氫氧化鈉，北京精細(xì)化工廠。

超純水制備器，美國(guó)Millipore公司；Agilent1260高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC），美國(guó)安捷倫科技有限公司；紫外掃描分析系統(tǒng)，美國(guó)Kodak公司；pH計(jì)，意大利Hanna公司；1/1000電子天平，美國(guó)Ohaus公司；Zetasizer Nano分析儀，英國(guó)Malvern Instruments公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器，鄭州明天儀器設(shè)備有限公司；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)5810 R，德國(guó)Eppendorf公司；-80℃超低溫冰箱和孵箱，日本Sanyo公司；渦旋混合器，北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司；光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Leica公司和超凈工作臺(tái)，北京長(zhǎng)城空氣凈化公司；Tecnai TF30透射電鏡（transmission electron microscope，TEM），美國(guó)FEI公司。

1.2 動(dòng)物和細(xì)胞

18只8周齡雄性C57小鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部），體重24～26 g，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2016-0041，倫理學(xué)批準(zhǔn)文號(hào)：LA2016035，飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)室。所有動(dòng)物正常飲食飲水，在室溫（18～22℃），濕度45%～55%，12 h晝夜交替條件下飼養(yǎng)。人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3 NGN-NL和PTP@NGN-NL的制備

NGN-NL的制備：磷脂225 mg、膽固醇25 mg和NGN 25 mg置茄形瓶中，加3.00 mL溶劑（甲醇∶氯仿=2∶1）溶解混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min（37℃，100 r·min-1）至成膜。吸取3.00 mL PBS水化，冰浴狀態(tài)下超聲至泛淡藍(lán)色乳光，即得NGN-NL。將制備好的NGN-NL過0.22 μm濾膜，取濾液于5 mL EP管中4℃保存。NL的制備除不加NGN外，其余制備步驟與NGN-NL一致。

PTP@NGN-NL的制備：茶多酚粉末30 mg溶解于1 mL水中，吸取3.00 mL NGN-NL于西林瓶中，在300 r·min-1磁力攪拌下，將1.00 mL茶多酚溶液緩慢加入西林瓶中，用NaOH 0.01 mol·L-1調(diào)節(jié)溶液至pH8.5，持續(xù)攪拌反應(yīng)24 h。用去離子水在9391×g，10 min離心3次，洗去未聚合的多酚和游離的NGN，4℃下保存。PTP@NL載體的制備：除將NGN-NL替換為NL外，其余制備步驟均同PTP@NGN-NL制備。

1.4 NGN-NL和PTP@NGN-NL表征檢測(cè)

1.4.1 粒徑、Zeta電位測(cè)定及表觀形態(tài)觀察

分別精密吸取100 μL PTP@NGN-NL或NGN-NL于10.00 mL容量瓶中，取適量去離子水振搖混勻后，稀釋至刻度搖勻。吸取1.00 mL上述樣品，用馬爾文粒徑儀測(cè)定粒徑以及Zeta電位；將樣品置小燒杯中，用鑷子夾住銅網(wǎng)邊緣并在樣品溶液中浸潤(rùn)數(shù)秒，干燥后用透射電鏡觀察樣品表觀形態(tài)。

1.4.2 HPLC法測(cè)定包封率和載藥量［13］。

首先吸取1.3制備的NGN-NL或PTP@NGN-NL 100 μL，置10.00 mL容量瓶中，用甲醇定容，超聲（頻率：40 kHz，功率：100 W）破乳10 min，計(jì)算NGN-NL或PTP@NGN-NL中NGN的質(zhì)量即為總含藥量（N，g）。另吸取200 μL NGN-NL，超速離心（84 518×g，2 h，4℃）后，精密吸取上清液100 μL，測(cè)定NGN濃度，即為NGN-NL中游離藥物含量（Cfree，g·L-1）；或吸取1.00 mL PTP@NGN-NL，離心（9391×g，10 min，4℃）后，吸取上清于EP管中，再補(bǔ)充1.00 mL去離子水于PTP@NGN-NL中，重復(fù)離心3次，合并上清液（總體積為V），測(cè)定NGN濃度，即為PTP@NGN-NL中的Cfree。計(jì)算包封率和載藥量。包封率（%）=（N-Cfree×V）/N×100%，載藥量（%）=（N-Cfree×V）/（N+W）×100%，式中，W為藥物載體總量（g）。

1.5 HPLC法測(cè)定PTP@NGN-NL的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

分別平行制備3份NGN-NL和PTP@NGN-NL，各取2.00 mL置相同體積EP管中，加氮?dú)飧艚^空氣，封口膜封EP管管口，分別保存在室溫和4℃，于第0，3和7天取樣，按1.4.2處理，測(cè)定NGN含量，計(jì)算載藥量，以載藥量反映制劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

1.6 HPLC法測(cè)定PTP@NGN-NL在模擬胃液和腸液中溶出率

據(jù)2015版《中國(guó)藥典》［23］制備模擬胃液：取稀鹽酸1.64 mL，加水稀釋至100.00 mL，使溶液pH值為1.2；模擬腸液制備：取25.00 mL 0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液，加入0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液11.80 mL，用水稀釋至 100.00 mL，搖勻，即得，使溶液pH值為6.8。

精密吸取9.00 mL配置好的模擬胃液，平行3份，分別加入1.00mLNGN，NGN-NL或PTP@NGNNL溶液（均7 g·L-1），放入搖床中，37℃，100 r·min-1振動(dòng)，分別于0，2和4 h取樣品溶液200 μL，加入氫氧化鈉中和至pH=7，13 523×g離心30 min后，取上清用HPLC法測(cè)定NGN量，計(jì)算胃液溶出的NGN與加入量的比例（%）以反映制劑在胃液中的穩(wěn)定性。

精密吸取配置好的模擬腸液9.00 mL，平行3份加入1.00 mL NGN，NGN-NL或PTP@NGNNL溶液（均7 g·L-1），分別在0，2和4 h取樣品溶液200 μL，樣品溶液經(jīng)13 523×g離心30 min，取上清用HPLC法測(cè)定NGN的量，計(jì)算腸液溶出的NGN與加入量的比例（%）以反映制劑在腸液中的穩(wěn)定性。

1.7 HPLC法測(cè)定PTP@NGN-NL的體外釋放

首先活化透析袋（分子截留量為8000～14000ku），隨后在透析袋中加入相當(dāng)于含1 mg NGN的NGN，NGN-NL和PTP@NGN-NL樣品溶液，用水稀釋至1 mL，用透析夾將透析袋兩端夾緊固定，防止液體流出。以PBS緩沖液（含0.25%吐溫80）為釋放介質(zhì)，將透析袋置200.00 mL 37℃恒溫釋放介質(zhì)中磁力攪拌（300 r·min-1）。分別在0.5，1，2，4，8，12和24 h吸取1.00 mL透析袋外的釋放介質(zhì)，并補(bǔ)充等體積新鮮釋放介質(zhì)。采用HPLC法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)所取樣品中NGN濃度并計(jì)算累積釋放百分率。

1.8 PTP@NGN-NL的小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)

1.8.1 分組和樣制備

18只小鼠，分為NGN-NL 12.5，25.0 mg·kg-1和PTP@NGN-NL 12.5 mg·kg-1組（劑量為相當(dāng)于NGN的含量），每組6只，ig給藥。給藥前禁食12 h，自由飲水。每組再分為2個(gè)亞組，亞組1在給藥后0.083，0.25，1，6和12 h眼眶取血100 μL；亞組2在給藥后 0.167，0.5，2，8 和 24 h 眼眶取血 100 μL。血液樣品置肝素處理的離心管中，1502×g離心10 min，取上清得血漿樣品，冷凍保存于-20℃。

1.8.2 血漿樣品處理和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)測(cè)定

β-葡萄糖醛酸酶溶液制備：精密稱取10 mg β-葡萄糖醛酸酶，加入2.00 mL PBS溶液，制得濃度5000 kU·L-1的β-葡萄糖醛酸酶溶液。

酶解樣品制備：將冰凍血漿進(jìn)行解凍，精密吸取40 μL于離心管中，隨后加入β-葡萄糖醛酸苷酶溶液50 μL，渦旋1 min，在37℃恒溫水浴條件反應(yīng)1 h后，加入1.00 mL甲醇，渦旋1 min，1502×g，4℃離心10 min，取上清液于離心管中，在40℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈伞Ｔ诖蹈蓸悠分屑尤?.10 mL流動(dòng)相進(jìn)行溶解，渦旋1 min，使其混勻，1502×g，4℃離心10 min，吸取上清液用0.45 μm針孔式過濾器過濾，取上清液，采用HPLC測(cè)定血漿中NGN濃度［13］。采用DAS 2.0軟件對(duì)小鼠血藥濃度進(jìn)行非房室模型擬合，得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

1.9 MTT法確定HepG2細(xì)胞PTP@NGN-NL安全濃度

將HepG2細(xì)胞接種在96孔板中〔每孔（5～6）×104個(gè)細(xì)胞〕，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后用DMEM培養(yǎng)基處理12 h，每組設(shè)6個(gè)平行孔。分為空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組、模型組（加含油酸0.3 mmol·L-1和LPS 2.5 mg·L-1的 DMEM溶液 0.20 mL）、模型+NGN 100 和 200 μmol·L-1組、模型 +NGN-NL 100 和 200 μmol·L-1組、模型+PTP@NL 100 和200 μmol·L-1及模型+PTP@NGN-NL 載體 100 和200 μmol·L-1組。模型組分別加含相應(yīng)終濃度載體溶液0.20 mL。細(xì)胞置37℃孵箱（相對(duì)濕度90%，CO2濃度5%）培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液。加入DMEM稀釋的MTT溶液（5.0 g·L-1）0.02 mL繼續(xù)置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后吸棄上清，加入0.15 mL DMSO，37℃避光100 r·min-1振動(dòng)條件下反應(yīng)8 min，待藍(lán)色結(jié)晶甲臜完全溶解后，用酶標(biāo)儀在560 nm波長(zhǎng)處讀取溶液吸光度（A560nm）值。細(xì)胞存活率（%）=（藥物組A560nm-空白對(duì)照組A560nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A560nm-空白對(duì)照組A560nm）×100%。以細(xì)胞存活率≥80%對(duì)應(yīng)的濃度為安全藥物濃度［8］。

1.10 試劑盒測(cè)定HepG2細(xì)胞甘油三酯含量

將HepG2細(xì)胞接種在6孔板中〔每孔（5～6）×105個(gè)細(xì)胞〕，每組設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后用DMEM培養(yǎng)基處理12 h，分為細(xì)胞對(duì)照組、模型組（加含油酸0.3 mmol·L-1及LPS 2.5 mg·L-1的DMEM溶液 1 mL）、模型+NGN 100和200 μmol·L-1組、模型+NGN-NL 50 和 100 μmol·L-1組、模型+PTP@NL 載體 100 和 200 μmol·L-1組和模型+PTP@NGN-NL 50 μmol·L-1組。處理組分別加入含相應(yīng)終濃度溶液1.00 mL，孵育24 h。用1×PBS洗3次，0.5 mL胰酶消化1 min，吸棄胰酶，加入1.00 mL空白培養(yǎng)基反復(fù)吹打細(xì)胞，直至細(xì)胞完全脫落并裝在EP管中。4℃，375×g離心10 min，棄上清，加入1.00 mL 1×PBS再離心，再加入1.00 mL 1×PBS，并將其轉(zhuǎn)移至新玻璃管中，加入2∶1氯仿/甲醇溶液（2∶1）4.00 mL，封蓋。渦旋1 min，直至充分混勻，4℃預(yù)冷，375×g離心30 min將水相和油相分離，棄最上層水相，取下層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈珊蠹尤?.50 mL 3%Triton X-100（V/V）溶液，渦旋使玻璃管壁上脂質(zhì)完全溶解，再將其置55℃恒溫?fù)u床，100 r·min-1振蕩2 h使脂質(zhì)完全溶解。用試劑盒測(cè)定樣品中甘油三酯含量（μmol·L-1）。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，實(shí)驗(yàn)中所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行，組間比較采用one way-ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為具有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTP@NGN-NL的粒徑、Zeta電位、包封率和載藥量

NGN-NL及PTP@NGN-NL均為圓整的球狀粒子（圖1），馬爾文粒徑儀測(cè)試結(jié)果與電鏡檢測(cè)結(jié)果基本一致（表1）。NGN-NL和PTP@NGN-NL的粒徑分別為125±4和（159±6）nm；Zeta電位分別為-4.3±0.0和（-23.0±2.5）mV；包封率分別為（94.8±1.2）%和（93.4±0.6）%，載藥量分別為（9.1±0.0）%和（8.2±0.1）%。其中PTP@NGN-NL的粒徑明顯大于NGN-NL（P＜0.01），表明PTP已包覆在NGN-NL表面，提示NL作為基底膜材，可使NGN-NL充分包載在PTP囊殼內(nèi)；PTP包覆后Zeta電位絕對(duì)值增加（P＜0.01），表明PTP包覆能明顯增加NGN-NL制劑穩(wěn)定性；同時(shí)PTP包覆不會(huì)影響NGN-NL包封率，但因使用囊材質(zhì)量增加導(dǎo)致載藥量略微降低。

Fig.1 Representative transmission electron microscope(TEM)image of naringenin nanoliposomes(NGN-NL)(A)and poly-tea polyphenol coated NGN-NL(PTP@NGN-NL)(B).

Tab.1 Characterizations of NGN-NL and PTP@NGN-NL measured by Marlvern laser particle size analyzer and hith performance liquid chromatography（HPLC）

2.2 PTP@NGN-NL的穩(wěn)定性

2.2.1 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

與0 h相比，室溫儲(chǔ)存至第3天和第7天（圖2），NGN-NL和PTP@NGN-NL的載藥量均明顯降低（P＜0.01）；4℃儲(chǔ)存至第3天，二者的載藥量均無明顯變化，儲(chǔ)存至第7天載和PTP@NGN-NL藥量均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。表明 NGN-NL和PTP@NGN-NL在4℃時(shí)相較室溫更穩(wěn)定。

Fig.2 Storage stability of NGN-NL and PTP@NGN-NL at room temperature（A）and 4℃（B）measured by HPLC.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the coresponding 0 h group.

2.2.2 在模擬胃液和模擬腸液中穩(wěn)定性

在模擬胃液中，與0 h相比（圖3），4 h時(shí)NGN,NGN-NL和PTP@NGN-NL組NGN含量均顯著降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），PTP@NGN-NL組 NGN含量顯著高于NGN原料藥組（P＜0.05）和NGN-NL組（P＜0.05），表明PTP@NGN-NL在胃液中穩(wěn)定性高于NGN原料藥和NGN-NL。在模擬腸液中，與0 h相比，4 h，NGN，NGN-NL和 PTP@NGN-NL組NGN含量均顯著降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），NGN原料藥與NGN-NL組相當(dāng)，PTP@NGN-NL組明顯高于NGN-NL和NGN原料藥組（P＜0.05）。表明PTP@NGN-NL在胃腸液中穩(wěn)定性均優(yōu)于NGN-NL。

Fig.3 Stability of NGN，NGN-NL and PTP@NGN-NL in simulated gastric fluid（A）and simulated intestinal fluid （B）measured by HPLC.x± s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding 0 h of the same group；#P＜0.05，compared with NGN group at the same time；ΔP＜0.05，compared with NGN-NL group at the same time.

2.3 PTP@NGN-NL的體外累積釋放率

如圖4所示，NGN-NL和PTP@NGN-NL中NGN的24 h累積釋放率明顯高于NGN原料藥（P＜0.01），提示NL和PTP包覆均能增加NGN原料藥體外釋放；與NGN-NL相比，PTP@NGN-NL釋藥曲線中24 h時(shí)NGN含量仍在緩慢上升未達(dá)到穩(wěn)態(tài)（P＜0.01），表明PTP包覆增加了 NGN-NL緩釋作用。

Fig.4 In vitro accumulative release profile of NGN，NGN-NL and PTP@NGN-NL detected by dialysis bag method.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with NGN group；##P＜0.01，compared with NGN-NL group.

2.4 PTP包覆對(duì)NGN-NL小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

如圖5所示，NGN-NL組和PTP@NGN-NL組均在0.083 h（約5 min）達(dá)Cmax值，均出現(xiàn)雙峰，說明藥物在體內(nèi)出現(xiàn)了肝腸循環(huán)現(xiàn)象。如表2所示，NGN-NL 12.5 mg·kg-1組與NGN-NL 25.0 mg·kg-1組相比，藥動(dòng)學(xué)參數(shù) AUC 和Cmax均有明顯差異（P＜0.01，P＜0.05），PTP@NGN-NL 12.5 mg·kg-1組與 NGN-NL 12.5 mg·kg-1組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC，t1/2和Cmax均無明顯差異，表明PTP包覆可能不影響NGN-NL的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)。

Fig.5 Plasma NGN-time curves of NGN-NL and PTP@NGN-NL after single ig administration in mice.Male mice were ig given NGN-NL 12.5，25.0 mg·kg-1or PTP@NG-NL 12.5 mg·kg-1，and plasma concentrations of NGN were measured by HPLC.±s，n=3.

Tab.2 Pharmacokinetic parameters of NGN-NL and PTP@NGN-NL in mice

2.5 PTP@NGN-NL對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

2.5.1 PTP@NGN-NL安全濃度

MTT結(jié)果（表3）可見，NGN 100，200 μmol·L-1、NGN-NL 100，200 μmol·L-1、PTP@NL載體100，200 μmol·L-1和 PTP@NGN-NL 100，200 μmol·L-1組HepG2細(xì)胞存活率均高于80%。

Tab.3 Cell viability of HepG2 treated with NGN formulations by MTT

2.5.2 PTP@NGN-NL對(duì)HepG2細(xì)胞甘油三酯含量的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞甘油三酯含量顯著增加（P＜0.01），模型+NGN-NL 50 μmol·L-1與模型+NGN 200 μmol·L-1組甘油三酯含量相當(dāng)，模型+PTP@NGN-NL 50 μmol·L-1組甘油三酯含量明顯低于模型+NGN-NL 50 μmol·L-1組（P＜0.05）（表4），表明NGN-NL抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積作用優(yōu)于NGN原料藥組，且PTP可增加NGN降低肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積作用。同時(shí)，模型+PTP@NGN-NL組與模型+NGN 200 μmol·L-1組甘油三酯含量相當(dāng)，表明PTP也具有抑制細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用。

Tab.4 Effects of NGN formulations on triglycerides(TG)in HepG2 cells induced by oleic acid and lipid polysaccharide.

3 討論

本研究結(jié)果表明，茶多酚不僅因氧化成膜增加NGN-NL的穩(wěn)定性，還能增加NGN-NL的緩釋作用，還可因其藥理作用增加NGN抗肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積作用。

PTP含有鄰位酚羥基，在pH驅(qū)動(dòng)下可自行發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，賈鑫教授課題組前期研究結(jié)果表明，多酚氧化聚合24 h可達(dá)到聚合穩(wěn)態(tài)［24］。因此，本課題在上述條件下制備了PTP@NGN-NL，通過電子顯微鏡及馬爾文粒徑儀均觀察到PTP在NGN-NL表面形成了約20 nm厚的薄膜，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致［25］。儲(chǔ)存穩(wěn)定性和胃腸液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTP包覆后，NGN-NL穩(wěn)定性明顯增加。

體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在腸液中釋放24 h時(shí)，NGN-NL累積釋放率比原料藥高2.7倍，達(dá)85.2%；PTP@NGN-NL累積釋放率為68.1%，且釋藥曲線中NGN含量還在緩慢上升尚未達(dá)到穩(wěn)態(tài)，表明PTP包覆增加了NGN-NL在腸液中的緩釋作用。

本研究肝細(xì)胞脂質(zhì)抽提結(jié)果表明，PTP@NL空載體（相當(dāng)于給予PTP@NGN-NL 100 μmol·L-1的載體量）與NGN 200 μmol·L-1具有相似的抗油酸和LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積作用，說明PTP具有抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積藥理活性。NGN-NL抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用是NGN原料藥的4倍，且PTP@NGN-NL具有比NGN-NL更好的抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用。上述結(jié)果表明，NGN與PTP存在協(xié)同抗肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積作用。

本課題組前期研究結(jié)果表明，NGN-NL抗NAFLD 最低有效劑量為 25 mg·kg-1［13］。因此，在小鼠藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，以NGN-NL 25 mg·kg-1體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為做為參考。若PTP與NGN存在協(xié)同藥理活性，PTP@NGN-NL12.5 mg·kg-1也許可增強(qiáng)NGN抗NAFLD作用。因此，分別選用NGN-NL 12.5和25.0 mg·kg-1及PTP@NGN-NL12.5 mg·kg-1觀察PTP包覆對(duì)NGN-NL體內(nèi)吸收的影響。NGN-NL 12.5 mg·kg-1與PTP@NGN-NL12.5 mg·kg-1的AUC（0-t）無明顯差異，表明PTP包載不影響NGN-NL體內(nèi)吸收。

綜上所述，PTP包覆不影響NGN-NL的包封率、載藥量及體內(nèi)吸收，可增加其的穩(wěn)定性，并具有比NGN-NL更好的緩釋作用；PTP可與NGN-NL協(xié)同抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積。提示PTP在體內(nèi)可能具有與NGN協(xié)同抑制NAFLD的作用。