張海祥,崔鵬程,王晉平(陜西省人民醫(yī)院中心實驗室,西安 70068;空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院耳鼻喉科;陜西省人民醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科;通訊作者,E-mail:06070789@qq.com)

氣管缺損多是由腫瘤、外傷、長時間插管和先天性疾病等所致,通常6 cm以內(nèi)的氣管缺損可通過斷端吻合完成修復(fù),但修復(fù)大于6 cm的氣管缺損就比較棘手。目前氣管移植被認為是修復(fù)大面積氣管缺損的理想方法,臨床上已有同種異體氣管移植成功的報道[1]。但移植后患者需終身應(yīng)用免疫抑制劑,會增加腫瘤復(fù)發(fā)和機會性感染的概率,對于患者顯然是不適用的。前期研究[2]已成功應(yīng)用十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)脫細胞方法在同種異體移植中,在不使用免疫抑制劑的情況下,進行了同種異體氣管的移植。由于目前供體資源緊缺,開發(fā)異種移植迫在眉睫。豬氣管作為一種極好的異種源性氣管移植物,是組織工程氣管重建的主要來源,尤其是基因敲除豬的問世,更是給異種氣管移植帶來了光明[3]。然而它經(jīng)過SDS脫細胞處理后能否在不使用免疫抑制劑的情況下,應(yīng)用于異種移植中尚無報道。本研究探討在不使用免疫抑制劑的情況下應(yīng)用SDS脫細胞方法處理后的異種氣管能否移植成功,以期為組織工程方法治療氣管疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗采用健康家豬9只,體質(zhì)量50～60 kg,雌雄不限。9只健康成年比格犬,體質(zhì)量11～14.5 kg,雌雄不限(實驗所選用家豬均由西安惠品肉業(yè)有限公司提供,比格犬均為第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心所提供,許可證號20191009)。

1.2 方法

1.2.1 供體豬氣管的收集 準備裝有高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液(器官保存液)的玻璃瓶和冰塊的轉(zhuǎn)運箱。將新鮮宰殺的9只家豬每只取喉以下隆突以上的頸段氣管(約12 cm),去除凈周圍組織后,立即放入裝有器官保存液的玻璃瓶,轉(zhuǎn)運箱即刻運回實驗室。

1.2.2 供體氣管去黏膜處理 將9段豬氣管隨機分為3組,即1%SDS處理組、3%SDS處理組和3%SDS內(nèi)外處理組。①1%SDS供體氣管內(nèi)去黏膜處理:在超凈臺內(nèi)進一步詳細去除氣管周圍的組織,將其浸泡在安爾碘中1 min消毒滅菌處理,之后反復(fù)用生理鹽水(約2 500 ml)沖洗干凈。在氣管一端塞入膠塞,并用絲線固定。管腔內(nèi)放置一根無菌細木棒,以維持氣管直立狀態(tài)。將其放入一個大試管中,氣管腔內(nèi)用移液槍注入1%SDS溶液,不能溢出。腔外注滿器官保存液,不能流入管腔內(nèi)。放入4 ℃冰箱,每日更換氣管內(nèi)外的溶液,并每日取一氣管環(huán)進行甲醛固定。于84 h后,將去黏膜處理后的豬氣管埋植于比格犬的背部。②3%SDS供體氣管內(nèi)去黏膜處理:同上,消毒滅菌并清洗后在氣管腔內(nèi)注入3%SDS溶液進行去黏膜處理,14 ℃低溫保存,每日更換相應(yīng)溶液并取一氣管環(huán)固定待檢,于96 h后行氣管異體埋植。③3%SDS供體氣管內(nèi)外去黏膜處理:同上,消毒滅菌并清洗后氣管腔內(nèi)外均充滿3%SDS溶液進行去黏膜處理,14 ℃低溫保存,隔日更換溶液并取一氣管環(huán)固定待檢,于120 h后行氣管異體埋植。

1.2.3 去黏膜氣管埋植前準備 脫細胞后的氣管放入盛有生理鹽水的密閉容器中,在震蕩床以120次/h的速度振蕩20 min。振蕩完畢后,用2 500 ml生理鹽水反復(fù)沖洗氣管,至沖洗液清亮無泡沫。氣管兩端各去除3環(huán)(防止兩端有未完全浸泡SDS的氣管組織)后,并取一環(huán)行組織學(xué)檢測,剩余氣管長約6 cm。在氣管環(huán)間做約1.5 cm的橫行切口,切開軟骨環(huán)間的韌帶。將與埋植氣管長度相等的硅膠管,交錯對稱剪菱形的小口。將硅膠管置于氣管腔內(nèi),絲線縫合固定。

1.2.4 異種異位氣管埋植 將受體動物比格犬,體質(zhì)量約11～14.5 kg左右;使用地西泮和陸眠寧(陸眠寧和地西泮均按0.1 mg/kg分別臀部注射,40 min后可按0.05 mg/kg分別追加劑量)肌肉注射比格犬臀部,完全麻醉后,將其俯臥位固定于動物手術(shù)臺;剃去背部毛發(fā),備皮;碘伏消毒后鋪無菌手術(shù)單。于犬背部行L型切口,逐層切開,掀起背闊肌筋膜;將與硅膠管固定好的氣管用筋膜包繞;逐層縫合固定。

1.2.5 埋植術(shù)后 比格犬麻醉清醒后,將其送回動物房。先少量進食水,待完全清醒后,再正常喂犬飼料,術(shù)后注意觀察傷口有無裂開、破潰、滲出以及全身的免疫排斥反應(yīng)。

1.2.6 埋植后氣管取材 將發(fā)生排斥反應(yīng)的實驗動物運回實驗室,使用地西泮和陸眠寧(劑量同1.2.4)肌肉注射比格犬臀部,將其側(cè)臥位固定于動物手術(shù)臺。觀察切口情況后,碘伏消毒后鋪無菌手術(shù)單,于氣管埋植處切開皮膚、皮下組織,筋膜層,暴露埋植的氣管。觀察氣管的形態(tài),并用相機拍照。

1.2.7 組織學(xué)檢測 切取的氣管環(huán)置于10%中性福爾馬林緩沖液中,室溫固定24 h。固定后,用蒸餾水洗滌,梯度酒精脫水,石蠟包埋,切片厚度4 μm。切片用蘇木精和伊紅染色后,觀察埋植后氣管組織結(jié)構(gòu)、細胞組成、細胞外基質(zhì)的排列等情況。

2 結(jié)果

2.1 氣管的組織學(xué)檢查

使用1%SDS及3%SDS脫細胞后的氣管,不間斷地采集氣管環(huán)標本,行HE染色。通過觀察,可以發(fā)現(xiàn)在相同的時間內(nèi)濃度高的處理組脫細胞效果更徹底。1%SDS處理組7 d時在氣管黏膜層仍有少許腺體存在(見圖1A)。3%SDS處理組4 d時氣管黏膜層已經(jīng)幾乎沒有腺體結(jié)構(gòu),上皮細胞無正常結(jié)構(gòu);在第7天時,整個黏膜下層水腫明顯,黏膜層已沒有正常的細胞及腺體結(jié)構(gòu)(見圖1B)。3%SDS內(nèi)外處理組隔日換液和取樣檢查,結(jié)果顯示,在處理4 d時氣管黏膜層腺體結(jié)構(gòu)消失,上皮細胞也無正常結(jié)構(gòu);第6天時,出現(xiàn)整個黏膜下層嚴重水腫,完全沒有正常的細胞結(jié)構(gòu)(見圖1C)。

圖1 氣管SDS脫細胞后HE染色結(jié)果 (×100)Figure 1 HE staining of tracheal after SDS decellularization (×100)

2.2 埋植后大體觀察

結(jié)合脫細胞情況,選取合適的時間點進行異種埋植,所有受體動物在埋植后,均出現(xiàn)不同程度精神、食欲差,全身乏力。傷口局部破潰,瘺口形成,膿性分泌物的滲出,埋植氣管的移位等情況,具體情況如下。

2.2.1 1%SDS氣管內(nèi)去黏膜處理后異種埋植情況 豬氣管去黏膜處理后異種埋植犬均于術(shù)后第2天傷口局部腫脹明顯,術(shù)后第4天左右,傷口局部有破潰,可見混濁的膿性分泌物排出(見圖2A),1只犬于術(shù)后第7天取材,氣管軟骨環(huán)明顯軟化,部分被吸收。其余的于術(shù)后第11天取材,氣管形態(tài)完全消失,只見軟骨碎片(見圖2B,C)。

A.埋植部位下方皮膚局部破潰,且有膿性分泌物流出;B.切開后只看到硅膠管,氣管形態(tài)完全消失,移位明顯;C.只見到軟骨碎片圖2 1%SDS氣管內(nèi)去黏膜處理后埋植氣管11 d的情況Figure 2 The general situation in 11 d after tracheal implantation in 1% SDS treatment group

2.2.2 3%SDS氣管內(nèi)去黏膜處理后異種埋植情況 豬氣管去黏膜處理后異種埋植犬,其中1只于術(shù)后第2天不明原因死亡,其余的術(shù)后第2天傷口局部無明顯腫脹;術(shù)后第5天背部埋植的氣管向下滑落,且有瘺口形成,有膿性分泌物流出(見圖3A);術(shù)后第11天取材,見埋植氣管已變成小碎片(見圖3B,C)。

2.2.3 3%SDS氣管內(nèi)外去黏膜 豬氣管去黏膜處理后異種埋植犬,其中1只于術(shù)后第3天不明原因死亡,另1只術(shù)后第4天埋植部位下方破潰(見圖4A),于第7天時氣管被排出(見圖4B);另1只于術(shù)后11 d取材,發(fā)現(xiàn)埋植氣管形態(tài)較前兩種方法要好,但同樣沒有完整的氣管形態(tài)(見圖4C)。

A.埋植氣管向下方移位,且有瘺口形成,局部有膿性分泌物流出;B.切開后已無氣管形態(tài),只見硅膠管;C.埋植的氣管已成碎片圖3 3%SDS氣管內(nèi)去黏膜處理后埋植氣管11 d的情況Figure 3 The general situation in 11 d after tracheal implantation in 3% SDS treatment group

A.埋植部分下方破潰,流膿;B.被排出的氣管;C.11 d取材時無完整的氣管形態(tài),但氣管環(huán)部分存在圖4 3%SDS氣管內(nèi)外去黏膜處理后埋植氣管11 d的情況Figure 4 The general situation in 11 d after tracheal implantation in 3% SDS internal and external treatment group

3 討論

隨著人類壽命的不斷延長,慢性疾病和終末期器官衰竭的患者越來越多。那么如何拯救這些終末期器官衰竭的患者呢?器官移植目前被認為是最有效的途徑。然而,人體器官供需不平衡一直是臨床移植的瓶頸。根據(jù)美國政府關(guān)于器官捐贈和移植的信息,截至2019年1月,超過11.3萬名候選者在等待器官移植,而2018年僅進行了36 528例移植。在中國,有超過30萬人在等待移植,但每年只有1.6萬個器官可供使用[4]。因此,異種移植可能是填補器官、組織和細胞供求差距的一種有前途的替代方法。

異種移植最早在1667年從羔羊到人的異種輸血中被提到[5]。動物器官的臨床異種移植是從1905年兔腎移植到人身上開始記載的[6]。由于非人類靈長類動物(NHPs)在進化上比其他物種更接近人類,從20世紀20年代到20世紀90年代,研究人員進行的幾項涉及NHPs腎臟、心臟和肝臟的異種移植試驗發(fā)現(xiàn),NHPs并不適合用于臨床異種移植[7,8],原因包括倫理方面的考慮、跨物種感染傳播給人類的高風(fēng)險、繁殖困難、器官大小差異等等因素[9]。從20世紀90年代以來,研究人員一直試圖將豬作為異種移植的源動物,豬目前被認為是最合適的候選物種。選擇豬作為異種移植器官的原因有豬產(chǎn)仔數(shù)較大,成熟期較短,豬的大小和生理上與人相似,異種人畜共患病的風(fēng)險較低,以及基因工程技術(shù)易于應(yīng)用于生產(chǎn)抗排異的豬器官[10]。然而,豬和人之間的遺傳差異導(dǎo)致了異種移植的障礙,包括免疫排斥和異種人畜共患病的風(fēng)險。其中免疫障礙是臨床異種移植的限制因素。由于基因編輯工具和免疫抑制療法的進步,以及在豬-非人類靈長類模型中延長了異種移植存活時間,臨床異種移植變得更加可行。

由于氣管與其他器官相比具有非常低的免疫原性[11,12],而且研究發(fā)現(xiàn)它的免疫原性主要位于氣管的黏膜層,軟骨僅具有輕微的免疫原性[13]。前期研究結(jié)果證實,SDS處理的氣管在全程未使用免疫抑制劑的情況下,同種異體埋植是成活的,埋植半年的氣管力學(xué)特性與新鮮氣管相比,無統(tǒng)計學(xué)差異[14]。同時,SDS作為大鼠全心灌注脫細胞的主要藥物[15],還可以在鼠前臂[16]、豬角膜[17]、豬心肌[18]、豬心臟瓣膜[19]、豬小腸[20]、豬腎[21]、人體靜脈[22]、鼠、豬和人類肺[23,24]及人類心臟[25]中達到脫細胞的標準。而且脫細胞支架由于其微小的抗原潛能,增加了異種移植和異體移植的通用性[26]。但是將此脫細胞方法應(yīng)用于氣管異種移植的報道幾乎沒有。因此本研究首次嘗試將此方法應(yīng)用于氣管異種移植。

本研究采用1%SDS溶液,與同種異體埋植相同的脫細胞方式[2]對豬氣管上皮層進行了處理,然后行異種埋植。在術(shù)后第2天埋植動物的傷口局部腫脹明顯;術(shù)后第4天左右傷口局部有破潰,可見混濁的膿性分泌物排出;1只犬于術(shù)后第7天取材,氣管軟骨環(huán)明顯軟化,部分被吸收。其余的于術(shù)后第11天取材,氣管形態(tài)完全消失,只見3個軟骨碎片。由于SDS脫細胞的程度與其濃度是相關(guān)的,本研究嘗試增加SDS的濃度,但在濃度超過3%時,SDS溶液會有晶體析出,影響脫細胞效果。研究盡管也調(diào)整了氣管SDS脫細胞的方式,從氣管黏膜層局部浸潤到全氣管的浸潤,但是實體動物異種埋植試驗證明,單一的脫細胞方法無法達到異種移植免疫排斥的要求。另外,術(shù)后出現(xiàn)膿性分泌物考慮可能是發(fā)生急性排斥反應(yīng)的同時發(fā)生了炎癥反應(yīng)。異種移植有3種排斥反應(yīng):超急性排斥反應(yīng)(hyperacute rejection,HAR)、急性體液性排斥反應(yīng)(acute humoral xenograft rejection, AHXR)和急性細胞性排斥反應(yīng)。異種移植物在幾分鐘到幾小時內(nèi)被迅速破壞,這一過程被稱為超急性排斥反應(yīng)(HAR);急性體液性異種移植排斥反應(yīng)(AHXR),也稱為延遲異種移植排斥反應(yīng)[27]。AHXR是一種由體液和細胞免疫反應(yīng)、活化的內(nèi)皮和炎癥共同引起的現(xiàn)象。急性細胞性排斥反應(yīng)與整個器官移植和細胞移植都有關(guān)。它會導(dǎo)致移植后幾天到幾周的排斥反應(yīng)[28]。除了免疫排斥外,炎癥反應(yīng)和凝血功能失調(diào)也變得更加突出,進而導(dǎo)致異種移植失敗[29]。

依據(jù)多年來在SDS脫細胞喉及氣管組織方面積累的經(jīng)驗,研究主要以HE染色結(jié)果對脫細胞的效果進行預(yù)判。脫細胞的目的是將有免疫原性的細胞成分從組織中去除,同時不損傷細胞外基質(zhì)支架。但是要想達到這種理想的狀態(tài)可能性非常小,因為任何一種脫細胞的方法在去除免疫原性細胞的過程中都不可避免地會損傷到細胞外基質(zhì)(ECM)。研究能做的只是采取某種脫細胞方法,單一的或聯(lián)合的,使其在脫細胞過程中盡可能減少對ECM的損傷[30]。即便是殘留在ECM中的少部分細胞成分也會對埋植后的受體有排斥作用,判斷脫細胞有效性的方法之一就是HE染色,當然還有更進一步的生化及生物力學(xué)等指標。本研究從應(yīng)用出發(fā),根據(jù)HE染色結(jié)果,在大動物體內(nèi)進行試驗,這樣更有現(xiàn)實的指導(dǎo)意義。

由于氣管的免疫原性主要位于氣管的黏膜層,軟骨僅具有輕微的免疫原性,在同種異體移植中,軟骨僅表現(xiàn)輕微的免疫原性,并且軟骨的輕微免疫原性可以忽略不計。因此,通過脫細胞處理后,在不需要任何免疫抑制劑的情況下,同種異體移植是成活的。然而本實驗中異種移植的免疫排斥反應(yīng)較同種移植的免疫排斥反應(yīng)更強烈?？赡芘c軟骨的免疫原性在同種異體移植物中表現(xiàn)不明顯,但在異種移植中可能會產(chǎn)生強烈的排斥反應(yīng)有關(guān),這需要今后進一步深入研究。