鄭曉燕,朱化超(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,西安 710061;通訊作者,E-mail:zhuhuachao08@126.com)

急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)是成人最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的急性白血病[1,2]。我國(guó)成人AML的發(fā)病率世界排名第三[3]。AML的病因是多因素的,目前尚未完全闡明。AML的發(fā)生通常伴隨多種編碼信號(hào)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾物的基因缺失、突變或過(guò)表達(dá),這些基因會(huì)影響細(xì)胞信號(hào)或其他基因的表達(dá)[4-6]。其中一些基因已經(jīng)作為AML診斷或預(yù)后的標(biāo)記物和潛在的治療靶點(diǎn)[7]。核糖體蛋白側(cè)柄亞單位P0(ribosomal protein lateral stalk subunit P0,RPLP0)基因編碼一種保守的酸性核糖體磷酸化蛋白(P蛋白),它是60S亞基的一個(gè)組成部分。有研究報(bào)道,RPLP0在子宮內(nèi)膜癌[8]、胃癌[9]、結(jié)直腸癌[10]中高表達(dá),并且調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移性。Handschuh等[11]通過(guò)基因芯片方法檢測(cè)了33例AML患者和15例健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的不同基因表達(dá),研究顯示,RPLP0在AML患者的PBMC中的表達(dá)量顯著高于檢測(cè)志愿者。然而,目前尚未查閱到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道RPLP0在AML中的生物學(xué)功能。因此,本研究通過(guò)觀察RPLP0對(duì)AML細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用,探討其可能的機(jī)制,旨在為AML的診斷和治療提供候選分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Lipofectamine 2000、SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。MTT試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。RNasy Mini Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自日本TaKaRa公司。RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司。RPLP0、p53、PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和β-actin一抗及HRP標(biāo)記的IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 AML患者骨髓標(biāo)本的收集

收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018年3月至2020年6月確診的30例AML患者的骨髓樣本作為AML組,其中男17例,女13例,年齡23～67歲,平均(43.25±12.33)歲;15例異基因造血干細(xì)胞移植健康供者的骨髓樣本作為健康組,其中男8例,女7例,年齡29～52歲,平均(39.73±9.32)歲。收集樣本后通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)RPLP0的mRNA和蛋白表達(dá)水平。樣本收集前AML患者未接受任何治療。兩組受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究已獲得西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有患者均簽署了知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)、人急性髓系白血病(AML)細(xì)胞系THP-1均購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞均在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中于37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。之后進(jìn)行細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染、MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR和Western blot檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞分組及處理

將THP-1細(xì)胞接種在24孔板中培養(yǎng)24 h,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。為了研究下調(diào)RPLP0對(duì)細(xì)胞功能的影響,將細(xì)胞分為對(duì)照組、shRNA-NC組和shRNA-RPLP0組;為了研究上調(diào)RPLP0對(duì)細(xì)胞功能的影響,將細(xì)胞分為對(duì)照組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-RPLP0組。細(xì)胞達(dá)到80%融合后,使用Lipofectamine 2000分別將RPLP0的短發(fā)夾RNA(shRNA-RPLP0)、shRNA陰性對(duì)照(shRNA-NC)、過(guò)表達(dá)RPLP0的質(zhì)粒(pcDNA3.1-RPLP0)以及對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1-NC)轉(zhuǎn)染到THP-1細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)照組為未轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞。shRNA-RPLP0、shRNA-NC、pcDNA3.1-RPLP0以及pcDNA3.1-NC均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均按照上述分組實(shí)施。

1.5 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板,每孔體積為200 μl,37 ℃孵育48 h,每孔加入20 μl的MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)上清液,每孔加入150 μl DMSO,搖床振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm光密度值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡

THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞,2 000 r/min離心10 min,洗滌細(xì)胞。加入300 μl的結(jié)合緩沖液,然后加入5 μl Annexin Ⅴ,避光孵育15 min,上機(jī)前5 min加入5 μl的碘化丙啶(PI)并孵育5 min。通過(guò)FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)RPLP0的mRNA表達(dá)量

使用RNasy Mini Kit從骨髓和細(xì)胞中提取總RNA。用SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Premix Ex Taq在7900HT熒光定量PCR儀擴(kuò)增。PCR循環(huán)程序如下:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸1 min,50次循環(huán)。RPLP0上游引物:5′-ACGGTACCTAGGGGCAATAG-3′,下游引物:5′-AGAGGTTAGTCTGGCTCGTGA-3′;β-actin上游引物:5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′,下游引物:5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。將RPLP0的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin的倍數(shù)(相對(duì)比值)。通過(guò)2-ΔΔCt方法確定基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測(cè)RPLP0、p53、PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表達(dá)量

將骨髓和細(xì)胞在RIPA裂解液中裂解,使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)12% SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶的TBST將膜在室溫下封閉1 h,4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜。一抗分別為RPLP0、p53、PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和β-actin。用TBST洗滌后,將膜與HRP標(biāo)記的IgG二抗在室溫孵育1 h。所有抗體稀釋倍數(shù)均為1 ∶1 000。將各蛋白表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin的倍數(shù)(相對(duì)比值)。使用增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RPLP0在AML患者骨髓和AML細(xì)胞中的表達(dá)

與健康組相比,AML患者骨髓中RPLP0的mRNA表達(dá)量顯著升高(t=6.977,P<0.001),RPLP0的蛋白表達(dá)量也顯著升高(t=8.959,P<0.001,見(jiàn)圖1)。與PBMC相比,THP-1細(xì)胞中RPLP0的mRNA表達(dá)量顯著升高(t=12.050,P<0.001),RPLP0的蛋白表達(dá)量也顯著升高(t=10.881,P<0.001,見(jiàn)圖2)。

與健康組比較,***P<0.001圖1 RPLP0在AML患者骨髓中的表達(dá)Figure 1 The expression of RPLP0 in the bone marrow of AML patients

與PBMC比較,***P<0.001圖2 RPLP0在PBMC和THP-1細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 The expression of RPLP0 in PBMC and THP-1 cells

2.2 RPLP0對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響

THP-1細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染shRNA-RPLP0后,各組細(xì)胞的RPLP0 mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=108.300,P<0.001);與shRNA-NC組相比,shRNA-RPLP0組RPLP0 mRNA表達(dá)量降低(P<0.001,見(jiàn)圖3)。轉(zhuǎn)染shRNA-RPLP0后,各組的RPLP0蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=175.621,P<0.001);與shRNA-NC組相比,shRNA-RPLP0組的RPLP0蛋白表達(dá)量降低(P<0.001,見(jiàn)圖3)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RPLP0后,各組的RPLP0 mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=101.094,P<0.001);與pcDNA3.1-NC組相比,pcDNA3.1-RPLP0組的RPLP0 mRNA表達(dá)量升高(P<0.001,見(jiàn)圖3)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RPLP0后,各組的RPLP0蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=131.722,P<0.001);與pcDNA3.1-NC組相比,pcDNA3.1-RPLP0組的RPLP0蛋白表達(dá)量升高(P<0.001,見(jiàn)圖3)。

與shRNA-NC組或pcDNA3.1-NC組比較,***P<0.001圖3 THP-1細(xì)胞中shRNA-RPLP0和pcDNA3.1-RPLP0的轉(zhuǎn)染效率Figure 3 Transfection efficiency of shRNA-RPLP0 and pcDNA3.1-RPLP0 in THP-1 cells

轉(zhuǎn)染shRNA-RPLP0后,各組THP-1細(xì)胞相對(duì)活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.373,P<0.001);與shRNA-NC組相比,shRNA-RPLP0組的相對(duì)細(xì)胞活力顯著降低(P<0.001,見(jiàn)圖4)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RPLP0后,各組THP-1細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.794,P=0.040);與pcDNA3.1-NC組相比,pcDNA3.1-RPLP0組的相對(duì)細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

2.3 RPLP0對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響

THP-1細(xì)胞經(jīng)shRNA-RPLP0轉(zhuǎn)染后,各組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=119.725,P<0.001);與shRNA-NC組相比,shRNA-RPLP0組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.001)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RPLP0后,各組THP-1細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.917,P=0.054,見(jiàn)圖5)。

與shRNA-NC組或pcDNA3.1-NC組比較,*P<0.05,***P<0.001圖4 RPLP0對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響Figure 4 The effect of RPLP0 on the proliferation of THP-1 cells

與shRNA-NC組或pcDNA3.1-NC組比較,***P<0.001圖5 RPLP0對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 The effect of RPLP0 on THP-1 cell apoptosis

2.4 RPLP0對(duì)THP-1細(xì)胞中p53-PTEN-PI3K-AKT軸的影響

通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了RPLP0與TP53和PTEN的蛋白之間存在互作關(guān)系(見(jiàn)圖6)。Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染shRNA-RPLP0后,各組THP-1細(xì)胞中p53、PTEN、p-PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而PI3K和AKT蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與shRNA-NC組相比,shRNA-RPLP0組p53和PTEN蛋白表達(dá)量顯著升高,而p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖7)。

圖6 string數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的RPLP0與TP53和PTEN的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 6 The protein interaction network of RPLP0 with TP53 and PTEN predicted by string database

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RPLP0后,各組THP-1細(xì)胞中p53、PTEN、p-PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而PI3K和AKT蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與pcDNA3.1-NC組相比,pcDNA3.1-RPLP0組p53和PTEN蛋白表達(dá)量顯著降低,而p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖8)。

3 討論

核糖體是由核糖體RNA和核糖體蛋白(RPs)組成的分子復(fù)合物。在人類細(xì)胞中已經(jīng)描述了大約80個(gè)RPs[12]。RPs對(duì)于穩(wěn)定成熟核糖體亞基中的rRNA結(jié)構(gòu)至關(guān)重要,可促進(jìn)rRNA在核糖體組裝過(guò)程中的正確折疊,從而滿足細(xì)胞的代謝活動(dòng)和對(duì)核糖體的需求[13]。RPs具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。此外,RPs還可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡和腫瘤形成等[14]。目前,有關(guān)學(xué)者已在人類腫瘤中檢測(cè)到大量RP的異常表達(dá),一些RPs的表達(dá)在腫瘤中顯著增強(qiáng)(例如S3、S11、L7、L18、L37、RPLP0和S6),而一些RPs的表達(dá)在癌癥中顯著降低(例如S12、S24、L32和L35a)[15-17]。此外,一些RP的表達(dá)量在某些類型的癌癥中升高,而在其他類型的癌癥中沒(méi)有變化[18]。RPLP0、RPLP1和RPLP2屬于一組酸性RPs,稱為P蛋白[13]。人核糖體P蛋白優(yōu)先形成RPLP1-RPLP2異二聚體,通過(guò)RPLP1蛋白附著到RPLP0上[19]。據(jù)報(bào)道,抑制RPLP1和RPLP2可以導(dǎo)致幾種癌細(xì)胞的增殖率下降,這表明P蛋白可以在增殖中發(fā)揮作用[20]。Handschuh等[11]研究顯示,RPLP0在AML患者的PBMC中的表達(dá)量顯著高于檢測(cè)志愿者。在本研究中,與異基因造血干細(xì)胞移植健康供者相比,RPLP0在AML患者骨髓中的mRNA和蛋白表達(dá)量均上調(diào),并且THP-1細(xì)胞中RPLP0的表達(dá)量明顯高于PBMC,該結(jié)果與Handschuh等[11]研究結(jié)果一致。然而,目前尚不清楚RPLP0是否參與調(diào)控AML的進(jìn)展。

與shRNA-NC組比較,***P<0.001圖7 下調(diào)RPLP0對(duì)THP-1細(xì)胞中p53、PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)的影響Figure 7 The effect of RPLP0 down-regulation on the expression of p53, PTEN, PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT protein in THP-1 cells

與pcDNA3.1-NC組比較,***P<0.001圖8 上調(diào)RPLP0對(duì)THP-1細(xì)胞中p53、PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)的影響Figure 8 The effect of RPLP0 up-regulation on the expression of p53, PTEN, PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT protein in THP-1 cells

控制細(xì)胞增殖和凋亡是癌癥治療的主要方向。為了考察RPLP0是否影響AML細(xì)胞的存活,本研究通過(guò)MTT法檢測(cè)了上調(diào)或下調(diào)RPLP0對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響,通過(guò)Annexin Ⅴ-FITC/PI染色法檢測(cè)了RPLP0對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果表明,下調(diào)RPLP0抑制了THP-1細(xì)胞增殖并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡,另外上調(diào)RPLP0促進(jìn)了THP-1細(xì)胞增殖,但未影響細(xì)胞凋亡。在其他癌癥類型中也有類似的文獻(xiàn)報(bào)道[9]。例如,胃癌N87細(xì)胞系和胃癌組織樣本中RPLP0高表達(dá);酵母雙雜交分析免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)RPLP0與人組織蛋白酶X(cathepsin X,CTSX)蛋白存在相互作用;RPLP0基因下調(diào)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞G1期阻滯并增加細(xì)胞凋亡;RPLP0基因下調(diào)可能通過(guò)下調(diào)CDK2來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程,進(jìn)一步研究表明,RPLP0影響p21的表達(dá)[9]。還有文獻(xiàn)報(bào)道,NONO(一種RNA/DNA結(jié)合蛋白)通過(guò)將RPLP0募集到DNA損傷位點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抗輻射能力和DNA損傷修復(fù)能力[10]。這些結(jié)果說(shuō)明RPLP0在多種癌癥中發(fā)揮致癌基因的功能,通過(guò)影響癌細(xì)胞增殖、凋亡等功能來(lái)調(diào)節(jié)癌癥的惡性行為。

p53蛋白是由抑癌基因TP53編碼的蛋白,當(dāng)細(xì)胞受到外源刺激時(shí),p53可表現(xiàn)出抗腫瘤活性,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期停滯、衰老、凋亡等生物過(guò)程[21]。p53通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,如Bcl-2家族的促凋亡成員[22]。p53依賴性凋亡途徑也是癌癥治療的重要方向之一。本研究通過(guò)string數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了RPLP0與TP53之間存在互作關(guān)系,因此推測(cè)RPLP0可能通過(guò)與p53蛋白相互作用來(lái)影響THP-1細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步的研究表明,下調(diào)RPLP0促進(jìn)了THP-1細(xì)胞中p53的蛋白表達(dá),而上調(diào)RPLP0則起到了相反的作用,表明RPLP0的癌基因作用部分依賴于p53蛋白的活性。在其他文獻(xiàn)中,Artero-Castro等[8]檢測(cè)了32例子宮內(nèi)膜癌患者中RPLP0、RPLP1和RPLP2的mRNA表達(dá)量。與正常組織相比,腫瘤組織中RPLP0、RPLP1和RPLP2的mRNA表達(dá)量均顯著升高,并且,這些蛋白的高表達(dá)與p53表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。因此,RPLP0可能在多種癌癥類型中通過(guò)p53依賴性凋亡途徑影響癌細(xì)胞的凋亡。

PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移,在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[23]。PTEN蛋白是一種雙特異性磷酸酶,其主要功能是通過(guò)將PIP3去磷酸化為PIP2來(lái)負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。失活的PTEN導(dǎo)致PIP3的積累,從而增加PI-3K/Akt信號(hào),促進(jìn)癌癥的發(fā)生[25]。大量研究表明,PI3K/Akt信號(hào)在AML患者的原始細(xì)胞中經(jīng)常被激活,并且對(duì)這些細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性有很強(qiáng)的促進(jìn)作用[26,27]。此外,p53與PTEN均是早期發(fā)現(xiàn)的抑癌因子,并且兩種蛋白之間存在交互作用,在大多數(shù)癌癥中發(fā)生突變并影響癌癥進(jìn)展[28-30]。本研究結(jié)果表明,下調(diào)RPLP0促進(jìn)了THP-1細(xì)胞中PTEN的蛋白表達(dá),并抑制了下游PI3K/Akt信號(hào)的激活,而上調(diào)RPLP0則起到了相反的作用,這些結(jié)果充分說(shuō)明RPLP0在AML中的作用至少部分是通過(guò)p53-PTEN-PI3K-AKT軸實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,本研究結(jié)果表明下調(diào)RPLP0的表達(dá)可抑制AML細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡,RPLP0對(duì)AML細(xì)胞增殖和凋亡的影響是通過(guò)p53-PTEN-PI3K-AKT軸介導(dǎo)的。