王 亞(無(wú)錫市第八人民醫(yī)院中醫(yī)科,無(wú)錫 214000;通訊作者,E-mail:737259639@qq.com)

楓香樹葉系金縷梅科楓香屬植物楓香(Liqui-dambar formosana Hance)的葉,具有祛風(fēng)除濕、行氣止痛、解毒之功效[1],在我國(guó)江西、廣西、廣東、海南等地廣泛分布,野生資源極其豐富,既是中成藥腸炎寧系列品種的主要組成藥,也可制成止血消炎制劑,還常用于急性胃腸炎、痢疾、產(chǎn)后風(fēng)等疾病的治療,是極具開發(fā)價(jià)值的一味中藥[2-4]。研究表明,楓香樹葉中主要含有山奈素、金絲桃苷、楊梅苷等黃酮類以及沒(méi)食子酸等酚酸類成分[5,6]。目前,2014年版《江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[7]收載的楓香樹葉還未建立含量測(cè)定控制方法,僅有學(xué)者對(duì)楓香樹葉中楊梅苷、異槲皮苷和山柰酚-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷3個(gè)黃酮苷類成分進(jìn)行了HPLC含量測(cè)定研究[8]。藥理活性研究表明,金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚3個(gè)黃酮類成分具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性,常作為中藥或中成藥質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[9,10]。鑒于楓香樹葉市場(chǎng)需求巨大、藥材產(chǎn)地分布廣泛,為確保藥用質(zhì)量,故本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC同時(shí)測(cè)定楓香樹葉藥材中金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚3個(gè)黃酮類成分的含量方法,為楓香樹葉藥材的質(zhì)量控制和資源開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters2695高效液相色譜儀(PAD檢測(cè)器,Waters公司);CPA225D型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯);KQ-500DE型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

對(duì)照品金絲桃苷(批號(hào)111521-201708)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(批號(hào)111869-201601)、山奈酚(批號(hào)110861-201611)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,楓香樹葉采自江西(以采集時(shí)間為批號(hào),即批號(hào)200923代表樣品采集于2020年9月23日,本實(shí)驗(yàn)所采集樣品批號(hào)分別為200923,200618,210315,200914,201127),自然陰干后經(jīng)黃平老師鑒定為楓香屬植物楓香(Liquid-ambar formosana Hance)的葉。甲醇為色譜純,磷酸等其他試劑均為分析純,水為自制超純水。

1.2 方法

1.2.2 混合對(duì)照溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品8.26 mg、山奈酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品12.38 mg、山奈酚對(duì)照品2.82 mg,置于50 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,制成質(zhì)量濃度分別為165.2,247.6,56.4 μg/ml的混合對(duì)照品溶液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 供試品溶液的制備 取粉碎后(過(guò)四號(hào)篩)的楓香樹葉1.0 g,置25 ml量瓶中,加入70%甲醇25 ml,稱重,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,冷卻,稱重,用70%甲醇補(bǔ)失減失重,搖勻,過(guò)濾,取繼濾液,作為供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)

分別取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“1.2.3”項(xiàng)下供試品溶液,按“1.2.1”色譜條件分別進(jìn)樣10 μl,采集色譜圖。對(duì)照品溶液與供試品溶液中3種成分色譜峰保留時(shí)間一致(見(jiàn)圖1),表明方法專屬性良好。

1.金絲桃苷(hyperin);2.山奈酚-3-O-蕓香糖苷(kaempferol-3-O-rutin);3.山奈酚(kaempferol)圖1 對(duì)照品與供試品色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance and test substance

2.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下溶液0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 ml至10 ml容量瓶中,加70%甲醇至刻度,制得不同濃度混合對(duì)照品溶液。分別吸取不同濃度對(duì)照品溶液各10 μl注入液相色譜,以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣濃度X進(jìn)行線性回歸計(jì)算,結(jié)果金絲桃苷,山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚在質(zhì)量濃度為1.652～165.2 μg/ml,2.476～247.6 μg/ml,0.564～56.4 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系,回歸方程分別為Y=28 641X+1 425(R2=0.999 2),Y=26 157X-2 946(R2=0.999 4)和Y=38 462X+4 255(R2=0.999 4)。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚峰面積,結(jié)果見(jiàn)表1,其含量的RSD值分別為1.94%,0.68%,2.09%。表明儀器精密度良好。

表1 三種被測(cè)成分精密度試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品制成供試品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0,2,4,6,8,12,24 h進(jìn)樣,測(cè)定金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚峰面積,結(jié)果見(jiàn)表2,計(jì)算其含量的RSD值分別為1.52%,1.06%,2.23%。表明3種成分在70%甲醇溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次(批號(hào)200923)樣品制成供試品溶液,按“1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚峰面積,結(jié)果見(jiàn)表3,計(jì)算其含量的RSD值分別為0.97%,1.49%,1.05%。表明方法重復(fù)性良好。

表2 三種被測(cè)成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表3 三種被測(cè)成分重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.6 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量(批號(hào)200923)的樣品6份,每份約0.5 g,按1 ∶1的比例加入金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚3種對(duì)照品,按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 三種被測(cè)成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.7 樣品含量測(cè)定

取不同批次樣品約1.0 g,每個(gè)批次平行3份,按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示,不同采集時(shí)間的楓香樹葉藥材中金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚含量存在顯著差異,其中3月份(批號(hào)210315)采集的樣品中金絲桃苷和山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量較高。

表5 樣品中3種成分的含量測(cè)定結(jié)果 (n=3,mg/g)

3 討論

3.1 被測(cè)樣品的采集

據(jù)報(bào)道,不同采集時(shí)間下楓香樹葉藥材有效成分的含量存在顯著差異。為闡明不同采收時(shí)間3種被測(cè)成分的含量差異,本實(shí)驗(yàn)收集了不同時(shí)間采集的楓香樹葉樣品,以采集時(shí)間編定樣品批號(hào),共收集了5個(gè)不同采收時(shí)間被測(cè)樣品。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和山奈酚分別在360,346,360 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)346 nm和360 nm波長(zhǎng)進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)在360 nm波長(zhǎng)下3個(gè)被測(cè)化合物的HPLC圖譜基線平穩(wěn),特征性強(qiáng),峰型較好。因此選擇360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 樣品溶劑的選擇

為盡可能提取出3種被測(cè)成分,本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑(甲醇、乙醇)、溶劑濃度(60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇、純甲醇)、提取時(shí)間(15,30,45,60 min)以及料液比(1 ∶10,1 ∶15,1 ∶20,1 ∶25,1 ∶50)進(jìn)行了考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在以70%甲醇、1 ∶25為料液比、30 min為提取時(shí)間的條件下3個(gè)被測(cè)成分的含量最大。

3.4 色譜條件的選擇

分別考察了不同比例的甲醇-磷酸水、甲醇-醋酸水和乙腈-磷酸水、乙腈-醋酸水為流動(dòng)相系統(tǒng),酸水濃度分別為0.1%和0.5%,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用甲醇-0.5%磷酸水能減少拖尾現(xiàn)象,且響應(yīng)值較高,溶劑毒性小,峰的分離度與峰形均較好,且無(wú)干擾峰。

4 小結(jié)

楓香樹葉藥材資源豐富、藥用價(jià)值較高,既是中成藥腸炎寧系列品種的主要組成藥[11],也因含有天然黑色素而常被民間用作食物著色的色素原料,還能泡水飲用,用于有效預(yù)防中暑[12]。本研究首次建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定楓香樹葉藥材中金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚3種黃酮類成分的方法,所建立的方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及回收率,表明檢測(cè)方法可行。應(yīng)用所建立的方法測(cè)定不同采集時(shí)間楓香樹葉藥材中3種成分的含量,結(jié)果顯示在3月份采收時(shí)金絲桃苷和山奈酚-3-O-蕓香糖苷的含量最高,在9月份采集時(shí)山奈酚的含量最高。為楓香樹葉藥材的質(zhì)量控制、采集時(shí)間等提供了科學(xué)的依據(jù),為楓香樹葉資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。