吳小雨,何心怡,陶志煒,馬學乾,朱柏旭,李宗芳,,江 維,(西安交通大學第二附屬醫(yī)院生物診斷治療國家地方聯(lián)合工程研究中心,西安 70004;西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科;通訊作者,E-mail:jiangweixjtu56@xjtu.edu.cn)

衰老是生命過程中不可抗拒的自然規(guī)律,人口老齡化已逐步成為我國重大社會問題[1]。衰老常表現(xiàn)為免疫功能的減退或紊亂,如淋巴結中淋巴細胞的減少、運動異常、T淋巴細胞和B淋巴細胞之間的協(xié)作異常等,因此老年人發(fā)生嚴重感染的風險增高、對疫苗的反應性降低、腫瘤和自身免疫疾病的風險增高[2]。脾臟不但具有造血功能、濾血功能、儲血功能等,還是機體最大的二級免疫器官[3]。脾臟與多種免疫相關性疾病的發(fā)生發(fā)展相關,比如感染、腫瘤、肝膿腫等[4-7]。隨著年齡的增長,脾臟也發(fā)生了顯著的變化,比如有研究報道老年小鼠脾臟邊緣區(qū)B淋巴細胞的運動能力、產(chǎn)生抗體的能力均降低,脾臟的白髓增大[8,9]。但是現(xiàn)有的研究主要集中于脾臟單個細胞表型和功能的改變,尚缺少對脾臟增齡性變化的動態(tài)研究。因此,本研究旨在探索不同年齡小鼠脾臟和外周血免疫細胞及細胞因子的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

大鼠抗小鼠FITC-labeled CD3、大鼠抗小鼠PE-labeled CD19、大鼠抗小鼠PE-labeled CD4、大鼠抗小鼠APC-labeled CD8、大鼠抗小鼠APC-labeled CD49b、大鼠抗小鼠FITC-labeled Ly6G、大鼠抗小鼠PE-labeled Ly6C、大鼠抗小鼠CD16/32、大鼠抗小鼠PE-cy7-labeled CD11b、大鼠抗小鼠FITC-labeled CD11c抗體,均購自美國Biolegend公司。小鼠白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒、小鼠IL-6 ELISA試劑盒、小鼠干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)ELISA試劑盒,均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

雄性C57BL/6J小鼠24只(1月齡7只、2月齡7只、12月齡7只、17月齡3只),SPF級,購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心,生產(chǎn)許可證號:SYXK(陜)2018-001,飼養(yǎng)于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心SPF標準動物房內(nèi)。按月齡將其分為4組:幼年組(1月齡)7只、青年組(2月齡)7只、中年組(12月齡)7只、老年組(17月齡)3只。所有小鼠在同一時間麻醉,取脾臟和外周血,并檢測脾臟質(zhì)量、計算脾臟指數(shù),制備脾臟和外周血單細胞懸液、血清、脾臟組織懸液。實驗經(jīng)西安交通大學醫(yī)學部倫理委員會批準。

1.3 脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)測定

利用小動物呼吸系統(tǒng)4%異氟烷吸入法麻醉小鼠并稱重,打開小鼠腹腔,無菌取脾臟、無菌濾紙重復吸收水分并稱取脾臟干質(zhì)量,計算脾指數(shù),即脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.4 外周血及脾臟單細胞懸液制備

不同月齡小鼠在同一時間麻醉后取其脾臟,置于70 μm細胞篩網(wǎng)上研磨,用含2%胎牛血清的PBS沖洗研磨后的組織,并經(jīng)70 μm尼龍篩網(wǎng)過濾,過濾后獲取的細胞懸液在4 ℃、350g離心5 min,棄上清,并重復1次,取沉淀細胞并加入2 ml PBS重懸制備脾臟細胞懸液備用。眼球取血法采血于EDTA抗凝管中形成外周血細胞懸液備用。將5 ml紅細胞裂解液加入上述所制備脾臟細胞懸液、外周血細胞懸液并充分混勻,冰上孵育5 min,用含2%胎牛血清的PBS 9 ml終止,4 ℃、350g離心5 min,取沉淀細胞,用5 ml PBS重懸,4 ℃、350g離心5 min;取其沉淀細胞并用1 ml PBS重懸,計數(shù),調(diào)懸液細胞濃度為1×107～2×107個/ml,放置于冰上,備用。

1.5 流式細胞術檢測脾臟和外周血免疫細胞比例

吸取100 μl上述所制備的細胞懸液加入流式管中,用大鼠抗小鼠CD16/32抗體4 ℃孵育15 min,加入相應的抗體(CD3-CD19+B細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD3-CD49b+自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)、CD11b-CD11c+樹突狀細胞(dendritic cell, DC)、CD11b+Ly6CmedLy6G+粒細胞、CD11b+Ly6ChiLy6G-單核細胞),4 ℃避光孵育30 min,加入含1%胎牛血清的PBS 2 ml,4 ℃下350g離心5 min,棄上清液;重復1次,最后加入0.5 ml PBS重懸,用FACS Canto Ⅱ流式細胞術(BD,美國)檢測結果。

1.6 ELISA檢測脾臟和外周血炎癥因子水平

4%異氟烷吸入法麻醉小鼠,眼球取血法采血0.5 ml左右,血液在室溫下凝固1 h,5 000 r/min離心10 min,獲得血清。取脾臟組織,稱重后放入1 ml含蛋白酶抑制劑RIPA裂解液的離心管中,并置于冰上,用組織勻漿儀勻漿脾臟組織,冰上孵育20 min,14 000g離心10 min,取上清。ELISA試劑盒測定脾臟和外周血IL-1β、IL-6和IFN-γ水平。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 脾臟質(zhì)量變化

隨著月齡的增長,小鼠的體質(zhì)量呈逐漸增加趨勢,中年組小鼠體質(zhì)量達到最大值,但中年組與老年組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1)。隨著月齡的增長,小鼠脾臟質(zhì)量也呈逐漸增加趨勢,與幼年組小鼠相比,老年組小鼠脾臟質(zhì)量顯著增加(P<0.05),其他組間相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1)。隨著月齡的增長,小鼠脾臟指數(shù)呈逐漸下降趨勢,其中中年組小鼠脾臟指數(shù)最小,與幼年組齡小鼠相比較,中年組小鼠脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.01),其他組間相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1)。

與幼年組比較,*P<0.05,**P<0.01;與青年組比較,##P<0.01圖1 不同月齡小鼠體質(zhì)量、脾臟質(zhì)量、脾臟指數(shù)比較Figure 1 Comparison of body weight, spleen weight and spleen index among mice of different ages

2.2 脾臟免疫細胞的變化

中年組小鼠脾臟CD3-CD19+B淋巴細胞比例相對幼年組小鼠、青年組小鼠均明顯降低(P<0.05或P<0.01,見圖2);同樣,老年組小鼠脾臟CD3-CD19+B淋巴細胞比例相對幼年組小鼠、青年組小鼠也明顯降低(P<0.05或P<0.01,見圖2)。不同月齡小鼠中,青年組小鼠脾臟CD3+CD4+T淋巴細胞比例最高,與幼年組小鼠相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2);而與中年組和老年組相比差異無統(tǒng)計學意義。不同年齡小鼠脾臟CD3+CD8+T細胞、CD3-CD49b+自然殺傷細胞比例均無顯著差異(P>0.05,見圖2)。中年組小鼠脾臟CD11b+Ly6ChiLy6G-單核細胞比例最高,相對幼年組小鼠、青年組小鼠差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而與老年組小鼠相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖2)。不同年齡小鼠脾臟CD11b+Ly6CmedLy6G+粒細胞、CD11b-CD11c+樹突狀細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖2)。

與幼年組比較,*P<0.05 vs,**P<0.01;與青年組比較,#P<0.05,##P<0.01圖2 不同月齡小鼠脾臟免疫細胞比例的比較Figure 2 Comparison of the proportion of spleen immune cells among mice of different ages

2.3 外周血免疫細胞的變化

中年組小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴細胞比例相對幼年組小鼠、青年組小鼠均明顯降低(P<0.05或P<0.01);同樣,老年組小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴細胞比例相對幼年組和青年組小鼠均明顯降低(P<0.01,見圖3)。中年組小鼠外周血CD3+CD8+T淋巴細胞比例最高,與幼年組和青年組小鼠相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與老年組小鼠相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖3)。不同年齡小鼠外周血CD3-CD19+B細胞、CD3-CD49b+NK比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖3)。中年組小鼠外周血CD11b+Ly6ChiLy6G-單核細胞比例相對幼年組和青年組小鼠均顯著升高(P<0.01);同樣,老年組小鼠外周血CD11b+Ly6ChiLy6G-單核細胞比例相對幼年組和青年組小鼠均顯著升高(P<0.01,見圖3)。不同年齡小鼠外周血CD11b+Ly6CmedLy6G+粒細胞、CD11b-CD11c+DC比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖3)。

與幼年組比較,*P<0.05,**P<0.01;與青年組比較,#P<0.05,##P<0.01圖3 不同月齡小鼠外周血免疫細胞比例的比較Figure 3 Comparison of the proportion of blood immune cells among mice of different ages

2.4 脾臟細胞因子的變化

中年組小鼠脾臟IL-1β相對青年組小鼠明顯降低(P<0.01);同樣,老年組小鼠脾臟IL-1β相對青年組小鼠明顯降低(P<0.05,見圖4)。不同年齡小鼠脾臟IL-6、IFN-γ差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖4)。

2.5 外周血細胞因子的變化

不同年齡小鼠外周血IL-1β、IFN-γ差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖5)。中年組小鼠血清IL-6相對幼年組和青年組小鼠均顯著升高(P<0.01);同樣,老年組小鼠血清IL-6相對幼年組、青年組小鼠均顯著升高(P<0.05,見圖5)。

與青年組比較,#P<0.05,##P<0.01圖4 不同月齡小鼠脾臟細胞因子的比較Figure 4 Comparison of the levels of spleen cytokines among mice of different ages

與幼年組比較,*P<0.05,**P<0.01;與青年組比較,#P<0.05,##P<0.01圖5 不同月齡小鼠血清細胞因子的比較Figure 5 Comparison of the serum levels of cytokines among mice of different ages

3 討論

脾臟是胚胎時期的重要造血器官,出生后脾臟發(fā)育成為最大的淋巴器官,是機體發(fā)生免疫應答的重要場所[10]。有研究表明小鼠生后1 d,脾臟才可見動脈周圍淋巴鞘,隨后出現(xiàn)脾小結,隨著年齡的增長,小鼠脾小結模糊,脾臟白髓和紅髓之間界限逐漸不清,白髓所占比例減小,免疫能力隨之下降,因此,脾臟處于一個動態(tài)發(fā)育過程[9,11]。該研究結果提示,隨著年齡的增長小鼠脾臟質(zhì)量增加,小鼠脾臟指數(shù)卻是逐漸下降,小鼠脾指數(shù)隨年齡增長而降低是因為體質(zhì)量增長速度明顯快于脾臟增長速度。

文獻報道老年小鼠脾臟邊緣區(qū)巨噬細胞的數(shù)量減少以及功能減弱[12],隨著年齡增長,小鼠脾臟中的趨化因子如CCL19、CCL21等表達異常,導致脾臟T淋巴細胞、B淋巴細胞的趨化異常,進而導致淋巴細胞的比例失調(diào)[13-15]。而該研究結果提示青年(2月齡)小鼠脾臟CD3+CD4+T淋巴細胞比例最高,而隨著月齡增長,小鼠脾臟CD3-CD19+B淋巴細胞比例降低。同樣,隨著月齡增長,外周血CD3+CD4+T淋巴細胞比例降低而CD3+CD8+T淋巴細胞比例增高,說明不同月齡小鼠脾臟和外周血的淋巴細胞組成存在差異,可能是由于不同年齡小鼠趨化因子表達的差異造成。

單核巨噬細胞是造血系統(tǒng)中最具可塑性的一群細胞,具有吞噬、抗原提呈、修復等功能,是機體免疫系統(tǒng)的重要防線[16]。脾臟紅髓含有大量的單核巨噬細胞,在清除衰老細胞等濾血作用、吞噬病原物和抗原遞呈過程中起重要作用[17]。該研究結果表明中年(12月齡)小鼠脾臟CD11b+Ly6ChiLy6G-單核細胞比例最高,隨后單核細胞比例有下降趨勢,說明中年小鼠脾臟的濾血作用可能最強,隨著年齡增長而減弱。但該研究僅探索了脾臟免疫細胞比例的變化,對不同月齡小鼠脾臟免疫細胞功能的變化還未知。同時,基質(zhì)細胞是脾臟的重要組成成分,對脾臟免疫細胞的趨化定位、增殖與凋亡、免疫功能都具有重要的作用[18]。不同月齡小鼠脾臟基質(zhì)細胞的變化以及對脾臟免疫細胞比例及其功能的影響還需進一步探討。

細胞因子是免疫細胞分泌的炎癥產(chǎn)物,在免疫反應中發(fā)揮作用[19]。脾臟邊緣區(qū)B淋巴細胞對T淋巴細胞功能的調(diào)控、細胞因子的分泌、免疫反應的調(diào)節(jié)等具有重要的作用[20]。實驗結果顯示隨著月齡增長,小鼠脾臟IL-1β表達降低,可能是由于隨著月齡增長,脾臟CD3-CD19+B淋巴細胞比例降低而導致脾臟分泌的IL-1β減少造成的。IL-6主要是由單核巨噬細胞分泌的一種促炎因子[18]。而實驗的結果顯示隨著月齡增長,小鼠外周血IL-6表達增高?？赡苁怯捎陔S著月齡增長,外周血CD11b+Ly6ChiLy6G-單核細胞比例增高,單核細胞分泌的IL-6增多造成的,但其具體機制以及IL-1β、IL-6的變化對機體免疫的作用還需進一步研究。綜上所述,隨著月齡增長,脾重呈上升趨勢而脾臟指數(shù)呈下降趨勢,脾臟CD3-CD19+B淋巴細胞比例降低,外周血CD3+CD4+T淋巴細胞比例降低而CD3+CD8+T淋巴細胞、CD11b+Ly6ChiLy6G-單核細胞比例增高,同時小鼠脾臟IL-1β表達降低而外周血IL-6表達增高,可能與不同年齡機體免疫狀態(tài)不同相關。