徐麗秀,李金秋,馬俊旗,阿仙姑·哈斯木(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,烏魯木齊 8600;新疆醫(yī)科大學(xué)全科醫(yī)學(xué)學(xué)院,第七臨床學(xué)院;新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科;通訊作者,E-mail:axiangu75@6.com)

tumor markers; common differential genes

鱗狀細(xì)胞癌是一類起源于上皮組織的腫瘤,根據(jù)部位不同分為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)、肺鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)等,雖其具有共同的組織病理學(xué)特征,但病理機(jī)制尚不明確。DNA甲基化改變在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用[1,2],不同類型鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生也被證實(shí)與DNA的異常甲基化有關(guān)[3],在宮頸鱗狀細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中,異常甲基化基因的表達(dá)往往與腫瘤的分化程度、TNM分期以及患者的預(yù)后不良有關(guān)[4-6],且隨著研究的深入,部分異常甲基化基因已開始作為不同類型鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷標(biāo)志物[7,8]。然而,目前對鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生過程中共有甲基化基因的研究較少,這些共有甲基化基因可能影響癌細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。本次研究中,采用全基因組DNA甲基化分析,以宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌為研究對象,找到兩種腫瘤中共有差異甲基化基因,為進(jìn)一步了解鱗狀細(xì)胞癌的表觀遺傳機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究中涉及的32例樣本分別取自2012年6月至2013年3月期間,就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科和胸外科住院患者。包括8對宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織及其癌旁3 cm正常上皮組織,8對食管鱗狀細(xì)胞癌組織及其癌旁3 cm正常上皮組織,收集的組織在30 min內(nèi)存放至-80 ℃保存。每個(gè)標(biāo)本組織均由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行組織病理學(xué)診斷。本研究已得到了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:20130216-147)。

1.2 DNA制備與亞硫酸氫鹽修飾

使用DNA提取試劑盒(QIAGEN, Valencia, CA, USA)從32例組織中提取總DNA。DNA純度測定通過測量A260/A280,以A260/A280范圍在1.80～2.0之間的DNA為實(shí)驗(yàn)樣本。根據(jù)EZ DNA甲基化試劑盒(Zymo Research, Orange, CA, USA)說明書,按照1 μg DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理分析。

1.3 Infinium HumanMethylation450 BeadChip(甲基化450k芯片)分析

采用Infinium Human-Methylation 450k Bead Chip(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)進(jìn)行DNA甲基化分析。根據(jù)Illumina公司操作說明進(jìn)行,步驟如下:將經(jīng)過亞硫酸鹽處理后的DNA經(jīng)過15 μl洗脫緩沖液洗脫后用異丙醇重懸DNA,于Infinium HumanMethylation450 Bead Chips中雜交過夜。經(jīng)過雜交后,將游離DNA去除,通過單核苷酸擴(kuò)增處理BeadChips,使用Illumina iScan儀器對BeadChips樣本進(jìn)行掃描以獲得原始數(shù)據(jù)。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用在線軟件KEGG pathways分析(www.genome.jp/kegg/pathway.html)對DNA甲基化基因進(jìn)行通路富集分析。使用在線軟件GO分析(http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/)對富集途徑中的基因功能進(jìn)行分析,包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。對獲得的差異基因通過UALCAN在線數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)和GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.5.1 宮頸鱗狀細(xì)胞癌與食管鱗狀細(xì)胞癌基因甲基化芯片的原始數(shù)據(jù)處理 采用GenomeStudio v1.9軟件對經(jīng)過Illumina處理后32例樣本的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析,在配對的癌與癌旁組織中每個(gè)基因的表達(dá)中位數(shù)之比為差異倍數(shù)(fold change),進(jìn)行配對t檢驗(yàn),得到相應(yīng)P值。去除掉P>0.05的樣本及探針集后,使用Lumi和R包對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。Lumi將得到的歸一化數(shù)據(jù)中單個(gè)CpG位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為甲基化值,即β值,β值范圍為0～1,分別對應(yīng)完全未甲基化位點(diǎn)和完全甲基化位點(diǎn)。隨后,利用R包的limma模態(tài)分析不同樣品之間的差異,CpG位點(diǎn)篩選標(biāo)準(zhǔn)為|Δβ|>0.2,P<0.05,符合以上條件被認(rèn)為可以作為差異甲基化基因。

2 結(jié)果

2.1 鱗狀細(xì)胞癌中甲基化譜差異分析

采用全基因組DNA甲基化分析,分別對宮頸鱗狀細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌及其癌旁正常組織進(jìn)行檢測,根據(jù)|Δβ|>0.2,P<0.05,8例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中共篩選出29 505個(gè)差異甲基化位點(diǎn),其中9 227個(gè)高甲基化差異位點(diǎn),20 278個(gè)低甲基化差異位點(diǎn);8例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中共篩選出54 009個(gè)差異位點(diǎn),包括21 515個(gè)高甲基化位點(diǎn),32 494個(gè)低甲基化位點(diǎn),兩種組織共有差異位點(diǎn)5 421個(gè),其中2 869個(gè)高甲基化位點(diǎn),2 552個(gè)低甲基化位點(diǎn)(見表1)。

表1 宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁組織中差異甲基化CpG位點(diǎn)

2.2 鱗狀細(xì)胞癌組織中差異甲基化位點(diǎn)區(qū)域分布情況

對差異位點(diǎn)的亞定位區(qū)域分析發(fā)現(xiàn),宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中超過50%的差異位點(diǎn)位于CpG島相關(guān)區(qū)域以外的區(qū)域(open sea),但兩種組織的共有差異位點(diǎn)主要分布于CpG島(見表2)。在基因結(jié)構(gòu)分析中,宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中差異甲基化位點(diǎn)分布區(qū)域主要位于gene body,其次為TSS1500,5′UTR,TSS200,而共有差異甲基化位點(diǎn)主要分布于gene body和5′UTR區(qū)域(見表3)。

表2 宮頸癌和食管癌組織與癌旁組織差異甲基化中CpG位點(diǎn)分布情況 個(gè)(%)

表3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁組織中差異甲基化CpG位點(diǎn)在基因功能區(qū)域的分布 個(gè)(%)

2.3 鱗狀細(xì)胞癌中差異甲基化基因的鑒定

根據(jù)差異甲基化位點(diǎn)進(jìn)一步匹配得到相應(yīng)的差異基因,宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織篩選得到13 790個(gè)差異基因,食管鱗狀細(xì)胞癌組織得到15 207個(gè)差異基因,共有差異基因2 041個(gè)(見圖1)。

2.4 GO富集分析及KEGG富集分析結(jié)果

對得到的2 041個(gè)差異基因進(jìn)行富集分析,GO分析結(jié)果提示,在生物進(jìn)程功能注釋類別中,這些基因主要富集于信號傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、胚胎骨骼系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生;在分子功能注釋類別中,主要集中于基因序列特異性結(jié)合、基因序列特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、鈣通道活性的調(diào)節(jié);在細(xì)胞組分注釋類別中,主要以質(zhì)膜、基底膜、質(zhì)膜的整體組成為中心(見圖2)。KEGG-pathway分析結(jié)果表明,差異甲基化基因主要富集于25條信號通路,主要涉及黏著斑(hsa04510)、癌癥信號通路(hsa05200)、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用(hsa04512)和肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(hsa04810),前10條通路見表4。

CSCC1～4分別為4例宮頸鱗狀細(xì)胞癌樣本;ESCC1～4分別為4例食管鱗狀細(xì)胞癌樣本;Cervical tissue 1～4分別為4例宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌旁樣本;Esophageal tissue 1～4分別為4例食管鱗狀細(xì)胞癌癌旁樣本圖1 宮頸鱗狀細(xì)胞癌/食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織組與癌旁組織組差異甲基化基因熱圖Figure 1 Heatmap of differentially methylated genes between tumor tissues and adjacent normal tissues

圖2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌與食管鱗狀細(xì)胞癌中共有差異甲基化基因的GO分析Figure 2 GO analysis of common differential methylated genes in CSCC and ESCC

2.5 差異基因標(biāo)志物篩選結(jié)果

從25條通路中選取富集最顯著的10條通路,其中,7條通路中均出現(xiàn)ITGA6。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫對ITGA6基因進(jìn)行驗(yàn)證,UALCAN結(jié)果提示,在宮頸宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中,ITGA6的表達(dá)高于正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3A)。GEPIA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示,在食管鱗狀細(xì)胞癌ITGA6基因的表達(dá)高于正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中未出現(xiàn)顯著差異(見圖3B)。

表4 宮頸鱗狀細(xì)胞癌與食管鱗狀細(xì)胞癌中共有差異甲基化基因的KEGG富集分析結(jié)果

CSEC:宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌;ESCA:食管鱗狀上皮細(xì)胞癌;與相應(yīng)正常組織比較,*P<0.05圖3 UALCAN數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫中ITGA6在宮頸鱗狀細(xì)胞癌及食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)Figure 3 The expression of ITGA6 in CSEC/ESCA and normal tissues on UALCAN database and GEPIA database

3 討論

世界范圍內(nèi),宮頸癌作為女性第四大惡性腫瘤,威脅全球女性的健康[9];食管癌作為四大腫瘤之一,同樣給人類帶來巨大的公共健康問題[10]。在新疆地區(qū),食管癌和宮頸癌作為此地區(qū)主要腫瘤類型[11],盡管醫(yī)療診斷及治療的水平有了很大程度的改善,然而這兩種腫瘤的患病率及死亡率仍然居高不下。因此,能夠有效地對疾病做出早期診斷,提高患者生活質(zhì)量,是亟待解決的問題。宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌均是鱗狀上皮細(xì)胞來源的腫瘤,其具有共同的組織病理學(xué)類型,尋找一種共有的分子生物學(xué)標(biāo)志物將有助于鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷,從而提高患者的預(yù)后。

表觀遺傳學(xué)已證實(shí)在腫瘤的發(fā)生過程中扮演著重要的角色,其中,DNA甲基化作為主要的表觀遺傳機(jī)制,為研究腫瘤早期發(fā)現(xiàn)提供了有力的理論依據(jù)。通常認(rèn)為正常細(xì)胞中往往呈現(xiàn)低甲基化,抑癌基因的高甲基化或者癌基因的低甲基化是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的開端。目前,在抗腫瘤治療中,已有部分甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑獲得FDA批準(zhǔn),這預(yù)示著甲基化研究在腫瘤治療領(lǐng)域中擁有廣闊的應(yīng)用前景[12]。然而,針對鱗狀細(xì)胞癌中共有的甲基化基因的研究卻鮮有報(bào)道。在本次研究中,選取鱗狀細(xì)胞癌中的兩種類型(宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌)找到其與癌旁正常組織間的差異甲基化基因,進(jìn)一步篩選得到兩種組織的共有差異基因,為鱗狀細(xì)胞癌的診斷、患者預(yù)后的評估和臨床治療的選擇提供依據(jù)。

研究證實(shí)DNA異常甲基化通常發(fā)生于CpG位點(diǎn),本次研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中,低甲基化CpG位點(diǎn)的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高甲基化位點(diǎn)數(shù)量,提示在腫瘤發(fā)生過程中腫瘤的DNA甲基化狀態(tài)會隨之發(fā)生明顯的改變,其中CpG島的異常甲基化被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。CpG島(CpG island)是指CpG二核苷酸大量富集于基因的5′調(diào)控區(qū),在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用的DNA序列。本次研究結(jié)果中觀察到在宮頸鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中分別有5 278和5 841個(gè)甲基化差異位點(diǎn)位于CpG島,值得注意的是,在這兩種腫瘤組織中差異甲基化位點(diǎn)更頻繁地出現(xiàn)在shores,而不是在CpG島。盡管對這一亞定位的生物學(xué)意義了解相對較少,但研究提示疾病的發(fā)生與islands, shores和shelves上的甲基化變化存在一定的關(guān)系[13]。此外,一項(xiàng)關(guān)于人類結(jié)腸癌甲基化的研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)甲基化改變發(fā)生在shores,并不是傳統(tǒng)意義上的CpG島[14]。提示shores上甲基化位點(diǎn)的變化可能與鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生存在一定聯(lián)系。CpG島上的基因啟動子區(qū)域(TSS1500、TSS200、5′UTR和第1外顯子)發(fā)生甲基化改變可以直接調(diào)控基因的異常表達(dá),包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活[15],既往研究報(bào)道,HEADLAMP技術(shù)根據(jù)宮頸癌中DAPK1啟動子高甲基化的特征可以高效率檢測宮頸癌病變[16]。Kadian等[17]發(fā)現(xiàn)高危HPV感染可以誘導(dǎo)人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中APC、SFRP1和PTEN基因啟動子區(qū)域呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài),促使這些基因的表達(dá)沉默,進(jìn)而觸發(fā)腫瘤的發(fā)生。ZFPs啟動子甲基化缺失可以抑制其與下游FZD1和DVL2蛋白結(jié)合,阻遏Wnt/β-catenin信號活化,在食管鱗狀細(xì)胞癌中起到抑癌基因的作用[18]。本次研究發(fā)現(xiàn),啟動子區(qū)域上分布著大量的差異甲基化位點(diǎn),提示基因啟動子甲基化水平改變可能會潛在地影響宮頸癌和食管癌中多個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。

將宮頸癌和食管癌中篩選出的2 041個(gè)共有差異甲基化基因通過GO功能富集分析和KEGG通路分析,GO分析結(jié)果提示,在生物進(jìn)程功能注釋類別中,這些基因主要富集于信號傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、胚胎骨骼系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生;在分子功能注釋類別中,主要集中于基因序列特異性結(jié)合、基因序列特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、鈣通道活性的調(diào)節(jié);在細(xì)胞組分注釋類別中,主要以質(zhì)膜、質(zhì)膜的整體組成、基底膜為中心。KEGG通路分析結(jié)果顯示,以上甲基化基因主要富集于25條信號通路,包括黏著斑(hsa04510)、癌癥信號通路(hsa05200)、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用(hsa04512)和肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(hsa04810)。隨后,從25條通路中選取富集最顯著的10條通路發(fā)現(xiàn),7條通路中均出現(xiàn)ITGA6基因,利用UALCAN數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫對ITGA6基因進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果提示,與正常組織相比,ITGA6在癌組織中高表達(dá)。ITGA6已證實(shí)在前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌中均作為致癌基因,促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[19-21]。在宮頸癌中,ITGA6可以與miR-144形成復(fù)合體,增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力[22]。ITGA6可以作為食管癌生存預(yù)后的指標(biāo)[23],且抑制了食管癌組織對放療抵抗的敏感性[24]。

綜上所述,甲基化芯片聯(lián)合生物信息學(xué)分析篩選并初步鑒定ITGA6基因可以作為鱗狀細(xì)胞癌差異甲基化基因,接下來,需要進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證ITGA6基因在鱗狀細(xì)胞癌中的具體作用,為找到鱗狀細(xì)胞癌的共有分子指標(biāo)或治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。