崔國(guó)艷，申 俞，李云飛，張慧鵬(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，長(zhǎng)治 046000；長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院；長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院普外科)

胃癌是臨床上最為常見的一種惡性腫瘤，已成為發(fā)生率位居世界第五的癌癥，其死亡率高達(dá)75%。相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明胃癌已成為癌癥死亡原因的第三位[1,2]，因?yàn)樵\斷篩查方法不足，大多數(shù)胃癌患者(≥50%)僅在晚期診斷出來[3]，因此識(shí)別胃癌分子生物標(biāo)志物有助于該疾病的早期診斷?；騿?dòng)子區(qū)DNA的異常甲基化可導(dǎo)致腫瘤抑制基因和細(xì)胞中其他腫瘤相關(guān)基因的失活，是目前胃癌中最明確的表觀遺傳標(biāo)記[4]。而特定基因甲基化的變化可作為胃癌進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子，如抑癌基因PTEN和RUNX3。PTEN是一種具有磷酸酶活性的抑癌基因，位于人類10q23染色體，其在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞黏附及腫瘤轉(zhuǎn)移的功能中起重要作用[5-7]。在胃癌患者的癌癥病灶處，RUNX3的表達(dá)缺失或下調(diào)，發(fā)生機(jī)制多為高甲基化、雜合性缺失或點(diǎn)突變等，而RUNX3啟動(dòng)子的高甲基化是造成胃癌中基因失活的主要原因[8,9]。另?yè)?jù)國(guó)際癌癥研究中心(IARC)的報(bào)告表明，78%的胃癌與幽門螺桿(H.pylori，Hp)感染相關(guān)[10]。

本研究據(jù)此在胃癌高發(fā)區(qū)山西省長(zhǎng)治市展開研究，探討PTEN、RUNX3啟動(dòng)子甲基化與胃癌臨床特征之間的關(guān)系，明確幽門螺桿菌感染、基因和表觀遺傳因素三者在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為胃癌的診斷和療效評(píng)估提供理論依據(jù)和分子靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例及標(biāo)本

收集2019年1月至12月在長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院行外科手術(shù)的胃癌患者為研究對(duì)象，女性50例，男性50例，年齡在39～84歲，平均年齡為63.26歲，所有病例術(shù)前未進(jìn)行放化療治療，且臨床診斷均為胃癌。臨床分期按腫瘤浸潤(rùn)深度分期，以國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期法為標(biāo)準(zhǔn)：胃癌Ⅰ～Ⅱ級(jí)33例，胃癌Ⅲ～Ⅵ級(jí)67例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例。腫瘤分化程度低分化48例，高中分化52例。以上標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)，術(shù)后取其切除的胃癌組織100份，取其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距癌組織邊緣>5 cm的正常胃黏膜組織)為對(duì)照組，所有標(biāo)本于-70 ℃冰箱凍存。所有標(biāo)本均在與患者溝通并征得其同意的情況下收集，符合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的要求。

1.2 H. pylori檢測(cè)

100例胃癌組患者(近2周內(nèi)均未服用過抗生素、鉍劑、質(zhì)子泵抑制劑等)，檢查前均行13C尿素呼氣試驗(yàn)。通過口服13C尿素膠囊進(jìn)入胃部，如果Hp存在，其分解尿素酶進(jìn)而水解尿素，尿素進(jìn)一步被水解形成CO2從肺部以氣體呼出，檢測(cè)專用的呼氣卡中是否有13C，如果有則表示Hp陽(yáng)性。診斷標(biāo)準(zhǔn):超基準(zhǔn)值(delta over baseline，DOB)>4為Hp陽(yáng)性，DOB值<4為Hp陰性。

1.3 基因啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè)

1.3.1 基因組DNA的提取 按照QIAGEN公司提供的基因組提取試劑盒說明書嚴(yán)格提取DNA,由Thermo SCIENTIFIC公司提供的Nano Drop2000C檢測(cè)DNA含量及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA甲基化修飾及純化 參照QIAGEN公司提供的EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，DNA純化試劑盒(碧云天公司)純化回收DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 甲基化特異性PCR擴(kuò)增(methylation specific PCR，MSP) 利用ethprimer軟件設(shè)計(jì)引物，PTEN特異性甲基化引物(PTEN-M)，正向引物：5′-GTATTTCGAGTAAAGGAAGAAGACG-3′，反向引物：5′-GATAAAAAACTACAACCCAACGAA-3′，PTEN特異性非甲基化引物(PTEN-U)正向引物：5′-TATTTTGAGTAAAGGAAGAAGATGA-3′，反向引物：5′-CAATAAAAAACTACAACCCAACAAA-3′；RUNX3特異性甲基化引物(RUNX3-M)，正向引物：5′-GTATTTCGAGTAAAGGAAGAAGACG-3′，反向引物：5′-GATAAAAAACTACAACCCAACGAA-3′；RUNX3特異性非甲基化引物(RUNX3-U)，正向引物：5′-GTGTTTTATTGTGGAGTGGGGTT-3′，反向引物：5′-CCAATCAACAAACTCCCAACAA-3′。PCR總反應(yīng)體系為25 μl，DNA 1 μl，10×Buffer 2.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.5 μl，正、反向引物各1 μl，5×High GC Buffer 5 μl，ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，Tm-5 ℃ 1 min，72 ℃ 1 kb/min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。4 ℃冷卻保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,如PTEN-M、RUNX3-M引物擴(kuò)增出條帶，而PTEN-U、RUNX3-U引物未擴(kuò)增出條帶，說明PTEN、RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了完全甲基化；如PTEN-M、RUNX3-M引物未擴(kuò)增出條帶，而PTEN-U、RUNX3-U引物擴(kuò)增出條帶，說明PTEN-M、RUNX3-M基因啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)生甲基化；如兩種引物均擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，說明存在部分甲基化；部分甲基化和完全甲基化均判定為甲基化。

1.4 焦磷酸測(cè)序

取上述PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果分析方法：檢測(cè)其中連續(xù)3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化百分率，取值范圍為0～100%，用這3個(gè)位點(diǎn)甲基化百分率的平均值作為該樣本PTEN和RUNX3基因甲基化最終檢測(cè)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN和RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化

在100例癌組織和癌旁組織，PTEN基因總甲基化水平分別為40%和4%；RUNX3基因總甲基化水平分別為64%和8%，且PTEN和RUNX3基因甲基化在癌組織和癌旁組織中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表1)。PTEN啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化PCR產(chǎn)物片段分別為200 bp和100 bp(見圖1)，RUNX3啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化PCR產(chǎn)物片段分別為212 bp和151 bp(見圖2)，且在癌組織和癌旁組織中均發(fā)現(xiàn)有特異性條帶，說明存在部分甲基化。

表1 兩組PTEN和RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化比較

M：特異性甲基化引物擴(kuò)增；U：特異性非甲基化引物擴(kuò)增；P：癌旁組織；C：癌組織；每組C/P代表同一患者的不同組織圖1 癌組織和癌旁組織中PTEN基因甲基化狀態(tài)Figure 1 PTEN gene methylation in gastric cancer tissue and paracancer tissue

M：特異性甲基化引物擴(kuò)增；U：特異性非甲基化引物擴(kuò)增；P：癌旁組織；C：癌組織；每組C/P代表同一患者的不同組織圖2 癌組織和癌旁組織中RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)Figure 2 RUNX3 gene methylation in gastric cancer tissue and paracancer tissue

2.2 PTEN和RUNX3基因甲基化與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

PTEN和RUNX3基因甲基化陽(yáng)性表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位無(wú)關(guān)(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)；RUNX3基因甲基化與腫瘤分化程度相關(guān)(P=0.001)，PTEN基因甲基化與腫瘤分化程度無(wú)關(guān)(P=0.522，見表2)。

2.3 PTEN和RUNX3基因甲基化與H. pylori感染相關(guān)性

在100例胃癌組織中H.pylori感染陽(yáng)性68例，PTEN基因甲基化38例，甲基化率為55.9%(38/68)，高于H.pylori感染陰性患者的甲基化率31.3%(10/32)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)；RUNX3基因甲基化32例，甲基化率為47.1%,高于H.pylori感染陰性患者的15.6%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。PTEN和RUNX3基因在H.pylori陽(yáng)性和陰性組織中二者甲基化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。胃癌組織中PTEN和RUNX3基因甲基化在H.pylori陽(yáng)性組中較陰性組中高，提示H.pylori感染可促進(jìn)PTEN和RUNX3基因甲基化。

3 討論

基因啟動(dòng)子區(qū)DNA的異常甲基化可導(dǎo)致腫瘤抑制基因和細(xì)胞中其他腫瘤相關(guān)基因的失活，是目前胃癌中最明確的表觀遺傳標(biāo)記[11,12]。Kang等[13]的報(bào)道表明，PTEN因甲基化而失活后將導(dǎo)致與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的一系列生物學(xué)行為的改變,例如細(xì)胞增殖與凋亡失調(diào),腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)等,說明PTEN基因甲基化在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。Kazemi等[14]研究顯示，RUNX3啟動(dòng)子區(qū)的CpG異常甲基化不但會(huì)造成機(jī)體內(nèi)mRNA與蛋白表達(dá)的缺失，也會(huì)因影響基因的表達(dá)造成TGF-β信號(hào)通路的紊亂，從而引發(fā)胃癌。但以上研究并未區(qū)分是否有Hp感染，忽略了Hp在胃癌發(fā)生發(fā)展中的影響。陳綺丹等[15]研究結(jié)果顯示，Hp陽(yáng)性組胃黏膜組織中PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示PTEN可能在Hp感染相關(guān)胃癌中發(fā)揮作用。李雪等[16]研究得出幽門螺桿菌感染可能誘使RUNX3基因甲基化，從而導(dǎo)致抑癌基因RUNX3失去活性，導(dǎo)致胃癌發(fā)生。由此可知抑癌基因RUNX3和PTEN的甲基化與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。

表2 胃癌組織PTEN、RUNX3甲基化與臨床病理特征的關(guān)系 (例)

本研究結(jié)果顯示，在胃癌組織中PTEN和RUNX3基因甲基化陽(yáng)性率分別為40%和64%，與相應(yīng)的癌旁組織相比較，基因甲基化陽(yáng)性率均增加。在胃癌組織中PTEN、RUNX3基因甲基化率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05),而在不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位的患者PTEN和RUNX3基因甲基化率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示PTEN和RUNX3基因甲基化情況可用于判斷腫瘤的轉(zhuǎn)移情況,預(yù)測(cè)胃癌手術(shù)的放化療療效等，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]。另外在本研究中，H.pylori感染陽(yáng)性的胃癌組織中PTEN、RUNX3基因甲基化水平分別為55.9%和47.1%，高于相應(yīng)的陰性組的31.3%和15.6%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PTEN和RUNX3基因的高表達(dá)與幽門螺桿菌感染有關(guān)，幽門螺桿菌感染可能通過DNA甲基化抑制PTEN、RUNX3基因表達(dá)從而促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，胃癌患者的PTEN與RUNX3基因甲基化可抑制抑癌基因的表達(dá)，而Hp的感染可促進(jìn)PTEN和RUNX3基因的甲基化，促進(jìn)胃癌的發(fā)生。另外PTEN和RUNX3基因甲基化檢測(cè)對(duì)胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移具有臨床診斷意義。但因研究過程有限、樣本量偏小，對(duì)于復(fù)雜的腫瘤病因和表觀遺傳學(xué)之間的復(fù)雜關(guān)系仍待進(jìn)一步研究。